老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)板含有多個(gè)檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽，檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽上含有下述任何兩種或兩種以上組合的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物:Tau,Aβ,TNF-α，IL-11,IL-6，ANG-2，TRAIL-R4,IL　8,IGFBP　6,ICAM-1,CCL18和PDGF-BB。本發(fā)明可用于體外血液檢測(cè)，簡(jiǎn)單、安全、成本低，多種生物標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)提高診斷準(zhǔn)確率，尤其適合于老年癡呆癥的早期篩查。
【專利說(shuō)明】老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒。具體地說(shuō)，是一種老年癡呆癥相關(guān)的多種生物標(biāo)志物的體外血液檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)估計(jì)，全球有2600萬(wàn)人患老年癡呆癥(英譯名:為阿爾茨海默氏癥，簡(jiǎn)稱:AD)患者。老年癡呆癥是危害極大的老年精神疾病，目前醫(yī)學(xué)界還沒(méi)有找到治愈這種病的辦法。雖然這種疾病可長(zhǎng)達(dá)20年，平均而言，AD患者被診斷后還能存活8至10年。這種疾病通常始于60歲以后，隨著年齡的增大發(fā)病率急劇增大。美國(guó)人年齡65歲以上的有百分之十得AD，年齡在85歲以上的有百分之五十的人得AD。老年癡呆癥在早期階段難以識(shí)別，很容易被誤診。
[0003]根據(jù)阿爾茨海默氏癥協(xié)會(huì)和美國(guó)的研究認(rèn)為早期診斷是至關(guān)重要。因?yàn)檫@時(shí)大部分病變進(jìn)展緩慢。早期診斷，早期治療，可以相當(dāng)大地延緩病變發(fā)生，維護(hù)病人的正常生活水平。早期準(zhǔn)確診斷還有助區(qū)分真老年癡呆癥病人與其它擬似老年癡呆癥(如抑郁癥，藥物的副作用，濫用藥物，維生素缺乏，脫水，膀胱感染或甲狀腺問(wèn)題)的病人，避免誤診造成的不必要的，可能有害的治療。
[0004]目前診斷阿爾茨海默氏癥，涉及大量的測(cè)試包括:醫(yī)療史，精神狀態(tài)評(píng)估，物理檢查，神經(jīng)學(xué)檢查，神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估，腦核磁共振，實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(抽腦脊髓檢查)；因此，目前老年癡呆癥的診斷不但斷費(fèi)用高，而且不適合于早期篩查；有必要開(kāi)發(fā)一種適合于在體外對(duì)早期AD患者和正常人進(jìn)行早期篩查的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板及其檢測(cè)試劑盒。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:使用一種可用于老年癡呆癥體外血液或體液檢測(cè)的檢測(cè)板，所述檢測(cè)板上含有多個(gè)檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽，檢測(cè)板的形式包括但不限于:酶標(biāo)盤(pán)或生物芯片的基片或免疫印跡膜或磁珠等。所述檢測(cè)板可以和相關(guān)的檢測(cè)試劑配套制成多種不同類型(如ELISA，生物芯片，RT-PCR等)的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒。
[0007]所述檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽上含有下述任何兩種或兩種以上組合的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物:Tau, A β , TNF-a，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，ICAM-1, CCL18 和PDGF-BB。
[0008]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0009]所述的生物標(biāo)志物的蛋白包括完整的蛋白或蛋白片段或僅含該類生物標(biāo)志物部分氨基酸序列的偶聯(lián)蛋白。
[0010]所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是預(yù)先固定在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0011]所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是在使用時(shí)加入到檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0012]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Αβ，TNF-a，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和PDGF-BB。
[0013]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Αβ和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Tau, TNF- a，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，ICAM-1, CCL18 和PDGF-BB。
[0014]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和A β以及下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:TNF- a，IL-11, IL-6，ANG-2，TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和 PDGF-BB0
[0015]所述的Tau包括所有Tau異構(gòu)體的中任何一種Tau。
[0016]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在檢測(cè)板的同一個(gè)檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0017]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在同一個(gè)或不同的檢測(cè)板的不同的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽。
[0018]所述的生物標(biāo)志物的蛋白包括其完整的蛋白或蛋白片段或含有個(gè)別氨基酸變異或缺失的該類生物標(biāo)志物蛋白，或僅含該類生物標(biāo)志物部分氨基酸序列的偶聯(lián)蛋白。
[0019]檢測(cè)板是一酶標(biāo)盤(pán)，所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在酶標(biāo)盤(pán)的檢測(cè)槽內(nèi)。
[0020]一種含上述的檢測(cè)板的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒，包括但不限于:ELISA，生物芯片，RT-PCR等不同類型的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒。
[0021]上述的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括但不限于:基于抗原-抗體反應(yīng)或受體蛋白-配體反應(yīng)原理，使用包括競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸收或雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸收等技術(shù)來(lái)測(cè)定人的血液或腦脊液或淋巴液或組織切片或尿液或其它體液中多種生物標(biāo)志物含量，進(jìn)而來(lái)判定既得或潛在的老年癡呆癥相關(guān)的疾病。
[0022]含上述的檢測(cè)板的老年癡呆癥體外分子檢測(cè)試劑盒，使用RT-PCR，包括TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)來(lái)測(cè)定人的血液或腦脊液或淋巴液或組織切片或尿液或其它體液中所述生物標(biāo)志物的mRNA含量，進(jìn)而來(lái)判定既得或潛在的老年癡呆癥相關(guān)的疾病。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:通過(guò)簡(jiǎn)單的抽血，然后在體外對(duì)受檢者血液中與老年癡呆癥相關(guān)的多種生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)分析，以診斷受檢者是否患有老年癡呆癥，或是否有潛在危險(xiǎn)患老年癡呆癥。體外檢測(cè)、安全、檢測(cè)成本低、多標(biāo)志同時(shí)檢測(cè)比較，提高診斷準(zhǔn)確率、尤其是適于早期篩查。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是本發(fā)明的生物標(biāo)志物Tau的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖2是本發(fā)明的生物標(biāo)志物A β的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026]圖3是本發(fā)明的生物標(biāo)志物TNF-a的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:
[0028]本發(fā)明的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，檢測(cè)板含有多個(gè)檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽，檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽上含有下述任何兩種或兩種以上組合的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物:Tau, A β，TNF- α，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和 PDGF-BB。
[0029]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0030]所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是預(yù)先固定在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0031]所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是在使用時(shí)加入到檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0032]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Αβ，TNF-α，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和PDGF-BB。
[0033]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Αβ和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Tau, TNF-α，IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和PDGF-BB。
[0034]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和A β以及下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:TNF- α，IL-11, IL-6，ANG-2，TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 和 PDGF-BB0
[0035]所述的Tau包括所有Tau異構(gòu)體的中任何一種Tau。
[0036]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在檢測(cè)板的同一個(gè)檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
[0037]所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在同一個(gè)或不同的檢測(cè)板的不同的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽。
[0038]所述的生物標(biāo)志物的蛋白包括其完整的蛋白或蛋白片段或含有個(gè)別氨基酸變異或缺失的該類生物標(biāo)志物蛋白，或僅含該類生物標(biāo)志物部分氨基酸序列的偶聯(lián)蛋白。
[0039]檢測(cè)板是一酶標(biāo)盤(pán)，所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在酶標(biāo)盤(pán)的檢測(cè)槽內(nèi)。
[0040]一種含上述的檢測(cè)板的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒。
[0041]上述的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，基于抗原-抗體反應(yīng)或受體蛋白-配體反應(yīng)原理，使用包括競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸收或雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸收等技術(shù)來(lái)測(cè)定人的血液或腦脊液或淋巴液或組織切片或尿液或其它體液中多種生物標(biāo)志物含量，進(jìn)而來(lái)判定既得或潛在的老年癡呆癥相關(guān)的疾病。
[0042]上述的檢測(cè)板的老年癡呆癥體外分子檢測(cè)試劑盒，基于PCR原理，使用RT-PCR，包括TaqMan熒光定量RT—PCR技術(shù)來(lái)測(cè)定人的血液或腦脊液或淋巴液或組織切片或尿液或其它體液中所述生物標(biāo)志物的mRNA含量，進(jìn)而來(lái)判定既得或潛在的老年癡呆癥相關(guān)的疾病。
[0043]本發(fā)明所涉及的生物標(biāo)志物:Tau，AP，TNF-α，IL-11,IL-6, ANG-2,TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18 及 PDGF-BB 均為人生物標(biāo)志物。為了避免歧義，具體定義如下:
[0044]1.Tau,全名:Microtubule_Associated Protein Tau,包括所有的 Tau 蛋白異構(gòu)體(Isoforms)中任何一種 Tau 蛋白;別稱:MAPT, DDPAC ;FTDP_17; MAPTL; MSTD; MTBT1;MTBT2;PPND;其基因序列號(hào)分別為 Isoforml:NM_016835.4, Isoform2:NM_005910.5,Isoform3:NM_016834.4, Isoform4:NM_016841.4, Isoform5:NM_001123067.3, Isoform6:NM_001123066.3。
[0045]2.A β ,全名:Amyloid β-protein ( β -淀粉樣蛋白)，另Ij 稱:Amyloidbeta,Abeta;Ai3由淀粉樣前體蛋白(APP)其基因序列號(hào)為:NM_000484，水解而成的36-42個(gè)氨
基酸妝。
[0046]3.TNF-α,全名:(腫瘤壞死因子-alpha),別稱:TNF;DIF;TNF-alpha;TNFA;TNFSF2;其基因序列號(hào)為:NM_000594。
[0047]4.1L-11,全名:白細(xì)胞介素11，別稱:IL11,AGIF;其基因序列號(hào)為:NM_000641o
[0048]5.1L-6，全名:白細(xì)胞介素6，別稱:IL6, BSF2，HGF，HSF，IFNB2;其基因序列號(hào)為:NM_000600。
[0049]6.ANGPT2,全名:人血管生成素2基因，別稱:AGPT2，ANG2;其基因序列號(hào)為:NM_001118887.1, (BC143902)。
[0050]7.TRAIL-R4,全名:腫瘤壞死因子受體超家族成員10D，別稱:TNFRSF10D，CD264，DCR2, TRAILR4, TRUNDD;其基因序列號(hào)為:NM_003840，(HQ448394)。
[0051]8.1L - 8,全名:白細(xì)胞介素 8，別稱:IL8，CXCL8，GCP_1，GCPl，LECT，LUCT，LYNAP，MDNCF, MONAP, NAF, NAP-1, NAPl ;基因序列號(hào):NM_000584，(DQ890564)。
[0052]9.1GFBP6,全名:胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6，別稱:IGF_BP6，IBP-6;其基因序列號(hào)為:NM_002178，(DQ896243)。
[0053]10.1 CAM-1,全名:細(xì)胞間黏附分子-1,別稱:1CAMl ;BB2，CD54，P3.58;其基因序列號(hào)為:NM_000201。
[0054]11.CCL18,全名:趨化因子配體18 (或巨噬細(xì)胞炎癥蛋白18)，別稱:SCYA18，DC-CKI, PARC, AMAC-1, DCCKI, MIP-4, CKb7;其基因序列號(hào)為:NM_002988
[0055]12.PDGF-BB,全名:人血小板衍生生長(zhǎng)因子_BB，是TOGF-B的二聚體，別稱:PDGFB, PDGF-2, PDGF2, SIS, SSV, c-sis;其基因序列號(hào)為:NM_002608。
[0056]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
[0057]1.所述的生物標(biāo)志物相關(guān)蛋白的抗原制備:[0058]本發(fā)明的老年癡呆癥體外試劑盒，所述的各生物標(biāo)志物的抗原可以按公知的基因重組方法或天然組織提取方法來(lái)獲得。所述的各生物標(biāo)志物相關(guān)蛋白抗原在用作免疫前得先純化，然后與弗氏完全佐劑(第一次免疫)或與弗氏不完全佐劑(后續(xù)免疫)一起乳化后用于免疫接種。
[0059]本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以是按所列生物標(biāo)志物中的任一氨基酸序列人工合成的多肽。
[0060]本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原可以是含有上述所列氨基酸序列的整個(gè)蛋白或僅含有上述所列相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
[0061]本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以是含有在上述所列任一氨基酸序列中引入個(gè)別氨基酸變異或缺失的序列。
[0062]上述各種生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以進(jìn)一步與載體蛋白(比如BSA，KLH)相偶聯(lián)，以提高免疫原性。
[0063]本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原還可以是基于DNA的疫苗，它可以在免疫動(dòng)物體內(nèi)按基因表達(dá)程序廣生含有上述所列生物標(biāo)志物相關(guān)氣基酸序列的部分或完整的蛋白。
[0064]2.本發(fā)明的生物標(biāo)志物相關(guān)抗體或受體蛋白的制備:
[0065]本發(fā)明的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒，所述的各生物標(biāo)志物相關(guān)的抗體可以按公知的多克隆抗體制備方法或單克隆抗體制備方法來(lái)獲得。
[0066]本發(fā)明的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒，所述的各生物標(biāo)志物相關(guān)的受體蛋白可以按公知的基因重組方法或天然組織提取方法來(lái)獲得。
[0067]3.老年癡呆癥相關(guān)的多生物標(biāo)志物篩查用檢測(cè)試劑盒的制備例:
[0068]I)所述的檢測(cè)試劑盒含有，但不局限于:檢測(cè)板、示蹤液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液。
[0069]2)檢測(cè)板制備:
[0070]用間接包被法固定生物標(biāo)志物特異的抗體。首先，用PBS緩沖液將兔抗鼠的抗體稀釋至濃度0.lug/ml-30ug/ml,再添加IOOul該抗體稀釋液到96-孔酶標(biāo)板的孔內(nèi)，在室溫下孵育1-4小時(shí)或低溫(4-8°C )下孵育10-24小時(shí)；用PBS+0.1%吐溫20的洗液沖洗酶標(biāo)板孔3-5次；然后，在酶標(biāo)板的孔內(nèi)添加200ul的2% BSA-PBS封閉液，室溫下孵育1-4小時(shí)，再用PBS+0.1%吐溫20的洗液沖洗酶標(biāo)板孔3-5次；
[0071]其次，用PBS緩沖液配制濃度為0.lug/ml-10ug/ml的下述12個(gè)生物標(biāo)志物特異的鼠抗體溶液，按酶標(biāo)板布局表(表I)所示，在酶標(biāo)板上1-12列的孔內(nèi)分別添加100微升下述生物標(biāo)志物特異的抗體溶液:
[0072]Tau (列 I), A β (列 2)，TNF-a (列 3)，IL-11 (列 4)，IL-6 (列 5)，ANG-2 (列 6)，TRAIL-R4 (列 7)，IL - 8 (列 8)，IGFBP - 6 (列 9)，ICAM-1 (列 10)，CCL18 (列 11)，PDGF-BB (列12);
[0073]在室溫下孵育0.5-4小時(shí)(或低溫(4-8°C )孵育10-24小時(shí))，用PBS+0.I %吐溫20洗液沖洗酶標(biāo)板孔3-5次；然后，45°C下干燥，將該盤(pán)抽真空密封于鋁袋內(nèi)，儲(chǔ)存在低溫干燥冰箱備用。
[0074]3)陽(yáng)性對(duì)照液制備:
[0075]陽(yáng)性對(duì)照是用純化的并經(jīng)準(zhǔn)確定量過(guò)的各生物標(biāo)志物按臨床診斷要求的檢出界限濃度制備(各生物標(biāo)志物陽(yáng)性對(duì)照濃度不盡相同)。為示例方便，本實(shí)施例僅以IOOpg/ml(并非臨床診斷要求的檢出界限濃度)做示范，配置2倍的工作濃度。將各個(gè)生物標(biāo)志物:Tau, A β，TNF-a, IL-11, IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL - 8，IGFBP - 6，I CAM-1, CCL18, PDGF-BB)溶解于含1% BSA的PBS溶液里配成100pg/ml濃度的陽(yáng)性對(duì)照，分裝、低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0076]4)陰性對(duì)照液: [0077]定量用:陰性對(duì)照液是含I % BSA的PBS溶液；低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0078]定性用:將年輕(18-28歲)正常人血清溶解于含I % BSA的PBS溶液里配成等同于定性檢測(cè)時(shí)的樣品血清濃度，比如:10%，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0079]5)樣品稀釋液:
[0080]樣品稀釋液是含I % BSA的PBS溶液；制備:將I克BSA蛋白溶解于100毫升PBS緩沖液，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0081]6)示蹤劑:
[0082]示蹤劑是標(biāo)記分子與純化的生物標(biāo)志物共價(jià)偶聯(lián)物,如:HRP_Tau。所述的標(biāo)記分子是常用的過(guò)氧化氫酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶(AP)或熒光分子、量子點(diǎn)等。示蹤劑可以按公知的方法制備。比如通過(guò)EDC介導(dǎo)羧基與胺基反應(yīng)來(lái)獲得。例:將EDC、HRP、Tau蛋白按摩爾數(shù)20:4:1溶解于PBS緩沖液，并在室溫反應(yīng)2小時(shí)，然后通過(guò)透析去除游離的EDC ；也可進(jìn)一步通過(guò)HPLC純化獲得高純度HRP-Tau偶聯(lián)物。按照此法制備示蹤劑:HRP_Tau，HRP-A β，HRP-TNF-a, HRP-1L-ll，HRP-1L-6, HRP-ANG-2，HRP-TRAIL-R4, HRP-1L -8，HRP-1GFBP - 6，HRP-1CAM-1, HRP-CCL18, HRP-PDGF-BB ;將各示蹤劑分別溶解于含 I %BSA的PBS溶液里配成每毫升0.3微克的濃度，備用。
[0083]7)洗滌液:
[0084]將I克吐溫20 (Tween20)溶解于I升的PBS溶液配成0.1%的濃度，備用。.[0085]8)顯色液:
[0086]常用顯色液有兩種，其一是:過(guò)氧化氫酶用顯色底物溶液:將TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)以0.2mg/ml的濃度溶于10mM(pH4)檸檬酸緩沖液，再加0.03%過(guò)氧化氫(H202),避光低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。適于測(cè)定波長(zhǎng):370nm或450nm(用等量IM硫酸終止后)；其二是:堿性磷酸酶用顯色底物溶液:將PNPP (對(duì)硝基苯磷酸鹽)以IOmmol / L的濃度溶于含lmmol / L MgCl2的0.1mol / L 二乙醇胺緩沖液(pH9.8)，避光低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。適于測(cè)定波長(zhǎng):405nm。本實(shí)施例使用過(guò)氧化氫酶底物TMB顯色液。
[0087]4.老年癡呆癥相關(guān)的多生物標(biāo)志物篩查用檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法例:
[0088]I)加樣:按表1所示，在檢測(cè)板(預(yù)包被的酶標(biāo)板)的列1-12的孔內(nèi)分別添加50ul 下述示蹤劑:HRP-Tau (列 I)，HRP-A β (列 2)，HRP-TNF-a (列 3)，HRP-1L-1I (列 4)，HRP-1L-6(列 5)，HRP-ANG-2(列 6)，HRP-TRAIL-R4(列 7)，HRP-1L - 8(列 8)，HRP-1GFBP -6(列 9)，HRP-1CAM-1(列 10)，HRP-CCL18(列 11)，HRP-PDGF-BB(列 12);
[0089]2)按表1所示，再分別在A，B, C，D，E，F(xiàn)，G和H行的孔內(nèi)添加50ul陽(yáng)性對(duì)照液，陰性對(duì)照液，待測(cè)試樣1-6;在室溫下孵育3小時(shí)(也可在4-8°C孵育10-24小時(shí));
[0090]表1，酶標(biāo)板布局:
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:檢測(cè)板含有多個(gè)檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽，檢測(cè)區(qū)或檢測(cè)槽上含有下述任何兩種或兩種以上組合的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的HiRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物:Tau，Αβ，TNF-α，IL-11，IL-6, ANG-2, TRAIL-R4, IL8, IGFBP6, I CAM-1, CCL18 和 PDGF-BB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是預(yù)先固定在檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白，或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白或特異抗體，或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物，是在使用時(shí)加入到檢測(cè)板的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Αβ，TNF-a，IL-11, IL-6,ANG-2, TRAIL-R4, IL8, IGFBP6, ICAM-1, CCL18 和 PDGF-BB。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Αβ和下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:Tau，TNF-a，IL-11，IL-6,ANG-2, TRAIL-R4, IL8, IGFBP6, ICAM-1, CCL18 和 PDGF-BB。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體`蛋白、特異抗體或根據(jù)其所對(duì)應(yīng)的mRNA而設(shè)計(jì)的DNA引物的組合是含有Tau和Αβ以及下述生物標(biāo)志物中任何一種或以上的組合:TNF_a，IL-11, IL-6,ANG-2, TRAIL-R4, IL8, IGFBP6, ICAM-1, CCL18 和 PDGF-BB。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的Tau包括所有Tau異構(gòu)體的中任何一種Tau。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在檢測(cè)板的同一個(gè)檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被包含在同一個(gè)或不同的檢測(cè)板的不同的檢測(cè)區(qū)上或檢測(cè)槽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、5或6所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:所述的生物標(biāo)志物的蛋白包括其完整的蛋白或蛋白片段或含有個(gè)別氨基酸變異或缺失的該類生物標(biāo)志物蛋白，或僅含該類生物標(biāo)志物部分氨基酸序列的偶聯(lián)蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的老年癡呆癥體外檢測(cè)用檢測(cè)板，其特征是:檢測(cè)板是一酶標(biāo)盤(pán)，所述的生物標(biāo)志物的蛋白或其所對(duì)應(yīng)的受體蛋白、特異抗體的組合被直接或間接地包被在酶標(biāo)盤(pán)的檢測(cè)槽內(nèi)。
13.一種含有權(quán)利要求 1-12任一項(xiàng)所述的檢測(cè)板的老年癡呆癥體外檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103487587SQ201310422863
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】鄒潮 申請(qǐng)人:哈德遜（天津）生物技術(shù)有限責(zé)任公司