取:將HL-1心肌細(xì)胞接種至激光共聚焦小皿上，待細(xì)胞長滿后，加入含有600ng/mL ApoA5的1%血清claycomb培養(yǎng)基于37°C孵育12小時。孵育結(jié)束后，棄去HL-1心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS液洗3遍。
[0045]固定、打孔:加入4%多聚甲酸ImL/孔，室溫下固定細(xì)胞20分鐘后，用PBS液洗3遍。加入含0.5 % Triton-XlOO的PBS溶液ImL/孔室溫下孵育10分鐘后，用PBS液冼3遍。加入含5% BSA的PBS溶液ImL/孔，室溫下孵育30分鐘。
[0046]一抗孵育:棄去上清液，在試驗(yàn)孔中加入用1% BSA稀釋的ApoA5第一抗體(1:200)，并設(shè)未加ApoA5第一抗體的孔做為陰性對照孔，4°C孵育12小時。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0047]二抗孵育:加入CY3標(biāo)記的ApoA5第二抗體(1: 200)，避光、20°C孵育30分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0048]細(xì)胞核染色、觀察:每孔中加入0.2 μ g/mL DAPI染色液lmL，室溫下孵育10分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍后甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。激光共聚焦圖片見圖1。
[0049]由圖1可以看出，通過激光共聚焦技術(shù)觀察試驗(yàn)孔中ApoA5在HL-1心肌細(xì)胞的分布情況，通過DAPI染色可定位到細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，發(fā)現(xiàn)ApoA5 (綠色熒光)分布在HL-1心肌細(xì)胞胞漿(細(xì)胞質(zhì))中，說明ApoA5被攝取進(jìn)入HL-1心肌細(xì)胞，同時也驗(yàn)證了 ApoA5具有生物學(xué)活性。由圖2可以看出，未加ApoA5第一抗體的陰性對照孔中，可定位到細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，未發(fā)現(xiàn)綠色熒光?？梢?，本發(fā)明通過觀察HL-1心肌細(xì)胞對ApoA5的攝取情況可準(zhǔn)確檢測ApoA5的生物學(xué)活性。
[0050]實(shí)施例2ApoA5生物學(xué)活性的檢測
[0051]ApoA5的攝取:將HL-1心肌細(xì)胞接種至激光共聚焦小皿上，待細(xì)胞長滿后，加入含有1200ng/mL ApoA5的1%血清claycomb培養(yǎng)基于37°C孵育18小時。孵育結(jié)束后，棄去HL-1心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS液洗3遍。
[0052]固定、打孔:加入4%多聚甲酸ImL/孔，室溫下固定細(xì)胞15分鐘后，用PBS液洗3遍。加入含0.5% Triton-XlOO的PBS溶液ImL/孔室溫下孵育5分鐘后，用PBS液冼3遍。加入含5% BSA的PBS溶液ImL/孔，室溫下孵育30分鐘。
[0053]—抗孵育:棄去上清液，加入用1% BSA稀釋的ApoA5第一抗體(1:200)，并設(shè)未加ApoA5第一抗體的孔做為陰性對照孔，4°C孵育8小時。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0054]二抗孵育:加入CY3標(biāo)記的ApoA5第二抗體(1: 200)，避光、15°C孵育40分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0055]細(xì)胞核染色、觀察:每孔中加入0.2 μ g/mL DAPI染色液lmL，室溫下孵育10分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍后甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。激光共聚焦圖片與實(shí)施例1提供的圖片相似?？梢?，本發(fā)明通過觀察HL-1心肌細(xì)胞對ApoA5的攝取情況可檢測ApoA5的生物學(xué)活性。
[0056]實(shí)施例3ApoA5生物學(xué)活性的檢測
[0057]ApoA5的攝取:將HL-1心肌細(xì)胞接種至激光共聚焦小皿上，待細(xì)胞長滿后，加入含有3000ng/mL ApoA5的I %血清claycomb培養(yǎng)基于37°C孵育12小時，所用ApoA5經(jīng)過滅活處理，已失去生物學(xué)活性。孵育結(jié)束后，棄去HL-1心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS液洗3遍。
[0058]固定、打孔:加入4%多聚甲酸ImL/孔，室溫下固定細(xì)胞25分鐘后，用PBS液洗3遍。加入含0.5 % Triton-XlOO的PBS溶液ImL/孔室溫下孵育15分鐘后，用PBS液冼3遍。加入含5% BSA的PBS溶液ImL/孔，室溫下孵育30分鐘。
[0059]一抗孵育:棄去上清液，加入用1% BSA稀釋的ApoA5第一抗體(1:200)，4°C孵育12小時。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0060]二抗孵育:加入CY3標(biāo)記的ApoA5第二抗體(1: 200)，避光、20°C孵育30分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍，每遍10分鐘。
[0061]細(xì)胞核染色、觀察:每孔中加入0.2 μ g/mL DAPI染色液lmL，室溫下孵育10分鐘。棄去上清液，用PBS洗3遍后甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。激光共聚焦圖片見圖3。
[0062]由圖3可以看出，通過激光共聚焦技術(shù)觀察ApoA5在HL-1心肌細(xì)胞的分布情況，通過DAPI染色(藍(lán)色熒光)可定位到細(xì)胞核，未發(fā)現(xiàn)ApoA5 (綠色熒光)分布在HL-1心肌細(xì)胞胞漿(細(xì)胞質(zhì))中，說明ApoA5未被攝取進(jìn)入HL-1心肌細(xì)胞，同時也驗(yàn)證了 ApoA5不具有生物學(xué)活性?？梢姡景l(fā)明通過觀察HL-1心肌細(xì)胞對ApoA5的攝取情況可檢測ApoA5的生物學(xué)活性。
[0063]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種非診斷目的檢測ApoA5生物學(xué)活性的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將HL-1心肌細(xì)胞與ApoA5孵育，經(jīng)固定、打孔后，與ApoA5第一抗體孵育，再與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育，觀察所述熒光標(biāo)記在HL-1心肌細(xì)胞中的位置，獲得ApoA5生物學(xué)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述與ApoA5孵育的時間為12?24小時，溫度為37 °C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定采用的試劑為多聚甲酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述打孔采用的試劑為TritonX-100。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述與ApoA5第一抗體孵育的時間為8?24小時，溫度為4°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育具體為:在15?30°C、避光條件下與焚光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育30?40分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述ApoA5的濃度為600?3000ng/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述觀察為采用激光共聚焦技術(shù)觀察。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記為CY3標(biāo)記。
10.一種檢測ApoA5生物學(xué)活性的試劑盒，其特征在于，包括HL-1心肌細(xì)胞、ApoA5、固定劑、打孔劑、ApoA5第一抗體、焚光標(biāo)記的ApoA5第二抗體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白活性檢測領(lǐng)域，特別涉及一種非診斷目的檢測ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒。該方法包括：將HL-1心肌細(xì)胞與ApoA5孵育，經(jīng)固定、打孔后，與ApoA5第一抗體孵育，再與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育，觀察所述熒光標(biāo)記在HL-1心肌細(xì)胞中的位置，獲得ApoA5生物學(xué)活性。本發(fā)明提供的檢測方法通過觀察HL-1心肌細(xì)胞對ApoA5的攝取情況可準(zhǔn)確檢測ApoA5的生物學(xué)活性。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104597248
【申請?zhí)枴緾N201510002726
【發(fā)明人】趙水平, 羅俊, 鄭小燕, 聶賽, 趙旺
【申請人】中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月5日