重組人白細(xì)胞介素-12 的生物活性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組人白細(xì)胞介素-12(rhIL-12)的一種新的活性檢測方法。采用PBMCs預(yù)先經(jīng)PHA孵育的方法進(jìn)行研究，即在原方法中增加PBMCs經(jīng)PHA活化這一步驟。新的生物學(xué)活性測定方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，批內(nèi)、批間、不同實驗人員操作及不同人的細(xì)胞檢測精密性好，平均變異系數(shù)小于30％；與原方法比較，對同一樣品的生物學(xué)活性檢測結(jié)果無顯著性差異；該方法特點是不需對受試者進(jìn)行嚴(yán)格篩選，具有普適性，可以代替原方法用于rhIL-12體外生物學(xué)活性的檢測。
【專利說明】重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種生物活性檢測方法，具體的說，是一種重組人白細(xì)胞介素-12 的生物活性檢測方法；屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 我公司研制的重組人白細(xì)胞介素-12(rhIL-12)，采用基因工程技術(shù)重組的中華地 鼠卵巢細(xì)胞株（CHO)表達(dá)和生產(chǎn)。作為一種高分子的糖蛋白，rhIL-12用于制藥，其質(zhì)量研 究和質(zhì)量控制具有生物制品共有的復(fù)雜和困難程度。在質(zhì)量研究和質(zhì)量控制中，特別是該 生物制品的生物活性檢測方法的建立，是其藥物開發(fā)中的難點，但又是必須要克服的。目 前，國內(nèi)外尚無依賴rhIL-12生長的商品化的穩(wěn)定細(xì)胞株，而且中國藥典中并無rhIL-12生 物學(xué)活性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。2006年，王威、饒春明、王軍志在《中國生物制品學(xué)雜志》上發(fā)表 了一篇文章《重組人白介素-12生物學(xué)活性檢測方法的建立》。本公司在對rhIL-12的生物 學(xué)活性研究中，也參照該文獻(xiàn)，采用rhIL-12直接與健康人外周血單個核細(xì)胞（PBMC)孵育 來誘生IFN-γ，從而建立了rhIL-12體外生物學(xué)活性常規(guī)檢測方法。然而，該方法雖然可對 rhIL-12生物學(xué)活性進(jìn)行檢測，精密度和準(zhǔn)確性也符合中國藥典的規(guī)定，但此方法受個體差 異和人體的免疫狀況影響甚大，部分人的PBMC對IL-12的應(yīng)答低下，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，我公司對rhIL-12生物學(xué)測定方法進(jìn)行了研究及改進(jìn)。根據(jù)文獻(xiàn) 報道，IL-12的生物活性是由專一性的、高親和力的白細(xì)胞介素-12受體（IL-12R)介導(dǎo)的； 流式細(xì)胞儀分析表明，在人的NK細(xì)胞上無論處于活化或靜息狀態(tài)，均有IL-12R，而人T細(xì) 胞、單核細(xì)胞以及B細(xì)胞只有處在活化狀態(tài)下才有IL-12R表達(dá)，也就是說靜息的T細(xì)胞是 沒有IL-12R表達(dá)的。因此，在部分以靜息T細(xì)胞為主的人群中，由于無IL-12R表達(dá)，所以 取用這些人群的外周血單個核細(xì)胞檢測活性時，就可能造成無應(yīng)答。植物血凝素（PHA)活 化的⑶3+T細(xì)胞（包括⑶4+和⑶8+)可表達(dá)IL-12R，IL-12可促進(jìn)活化后的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì) 胞因子。1989年，Trinchieri將外周血淋巴細(xì)胞（PBL)與不同濃度的IL-12(原名天然殺 傷細(xì)胞刺激因子，NKSF)共同孵育，采用或不采用植物血凝素M(PHA-M)或二丁酸佛波醇酯 (PDBu)激活PBL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與經(jīng)激活的上清液檢測到的IFN-γ是未經(jīng)激活上清液所檢測到 的10倍。
[0004] 所以，我公司采用PBMC預(yù)先經(jīng)PHA孵育的方法進(jìn)行研究，即在原方法中增加PBMC 經(jīng)PHA活化這一步驟。新的方法在加入PHA激活后，rhIL-12刺激PBMC分泌的IFN-γ的 量要顯著高于原方法，且IFN-Y的量與rhIL-12的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性。在受試的20例 健康人中，所有人的PBMC經(jīng)PHA活化后，誘生的IFN-Y的量與rhIL-12的濃度均呈"S型 曲線"，而未經(jīng)PHA活化的，僅有40%呈"S型曲線"，表明新的方法具有普適性，不會因受試 個體因素導(dǎo)致檢測結(jié)果無法判定。
[0005] 部分受試者未經(jīng)PHA活化的PBMC，經(jīng)rhIL-12刺激后誘生的IFN-γ的量與 rhIL-12濃度呈"S型曲線"，即，可用原方法測定rhIL-12生物活性，原方法對生物學(xué)活性的 測定結(jié)果與新的方法無顯著性差異（P> 〇. 05)，也證明兩種方法均可用于rhIL-12的質(zhì)量 控制，但原方法需要對受試者進(jìn)行嚴(yán)格篩選，實施較為困難。
[0006] 新的生物學(xué)活性測定方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，批內(nèi)、批 間、不同實驗人員操作及不同人的細(xì)胞檢測精密性好，平均變異系數(shù)小于30%;與原方法比 較，對同一樣品的生物學(xué)活性檢測結(jié)果無顯著性差異；該方法特點是不需對受試者進(jìn)行嚴(yán) 格篩選，具有普適性，可以代替原方法用于rhIL-12體外生物學(xué)活性的檢測。我公司也發(fā)現(xiàn) 采用抗⑶3抗體（anti-⑶3)或刀豆球蛋白（ConA)這兩種T細(xì)胞刺激物，也能取得與PHA 相類似的效果。
[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測方法簡單，檢測結(jié)果穩(wěn)定的重組人白細(xì)胞介素-12的生物 活性檢測方法。
[0008] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：該重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法 是在rhIL-12刺激外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素一gamma來檢測時，采用植物血凝素預(yù) 活化PBMC。
[0009] 上述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，所述的預(yù)活化采用抗⑶3抗 體和刀豆球蛋白。
[0010] 上述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，所述的rhIL-12由采用基因 工程技術(shù)重組的中華地鼠卵巢細(xì)胞株表達(dá)和生產(chǎn)。
[0011] 上述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，所述的PHA使用時刺激濃度 為 10μg/ml。
[0012] 上述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法用于rhIL-12作為藥物時的質(zhì) 量研究和質(zhì)量控制。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案檢測方法檢測方法簡單，檢測結(jié)果穩(wěn)定， 可用于rhIL-12作為藥物時的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖IPBMC經(jīng)PHA活化后IL-12誘生INF-γ的量效關(guān)系；
[0015]其中：1:PHA使用量 20ug+IL-12,2:PHA使用量 10ug+IL-12,3:PHA使用量 5ug+IL-12,4:PHA使用量 20ug+ 培養(yǎng)液，5;PHA使用量 2. 5ug+IL-12。
[0016] 圖2PBMC未經(jīng)PHA活化或經(jīng)PHA活化后加IL-12誘生INF-γ的量效關(guān)系（注： 與經(jīng)PHA活化組比較，*，Ρ〈(λ01，#，Ρ〈(λ001)。PBMC經(jīng)PHA活化后，IL-12以劑量依賴的 方式誘生IFN-γ;
[0017] 其中：1:經(jīng)PHA活化；2:未經(jīng)PHA活化
[0018] 圖3經(jīng)PHA活化生物活性測定曲線；
[0019] 圖4未經(jīng)PHA活化生物活性測定曲線；
[0020] 圖5PBMC未經(jīng)PHA活化或經(jīng)PHA活化后檢測相同批次IL-12量效曲線；
[0021] 其中：1:加PHA參考品；2:加PHA供試品，3:未加PHA參考品，4:未加PHA供試品。
[0022] 圖6rhIL-12誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN-γ的劑量依賴曲線。
[0023] 其中：1國際標(biāo)準(zhǔn)品；2 :IL_2供試品

【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本 發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán) 利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0025] 實施例1
[0026] 本發(fā)明提供的rhIL-12生物學(xué)活性測定方法：
[0027] 本法系根據(jù)經(jīng)PHA活化后的PBMC在不同濃度的IL-12誘導(dǎo)下，PBMC產(chǎn)生IFN-γ 的量效關(guān)系與對照品比較，用酶標(biāo)儀讀出A值后，試驗數(shù)據(jù)采用計算機(jī)程序或四參數(shù)回歸 計算法進(jìn)行處理。
[0028] 1.試劑
[0029] PBMC經(jīng)PHA(植物血凝素）活化后IL-12誘生INF-γ最佳濃度篩選
[0030] 儀器：SW-CJ-2F型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱 (SANYO,日本），LXJ-II型離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），MultiskanMK3酶標(biāo)儀、Well wash4MK2洗板機(jī)（上海熱電儀器有限公司），XW-80A旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公 司）。
[0031]試劑：
[0032](I)rhIL-12生物學(xué)活性參考品（廣州市愷泰生物科技有限公司），批號： 20090705 (95800IU/支）；
[0033](2)rhIL_12供試品三個批次各3支（廣州市愷泰生物科技有限公司），批號： 2010120U20101202,20110201；
[0034] (3)Hanks'液及RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液均為可直接使用的液體培養(yǎng)基（GIBC0公 司，美國），4°C保存，批號：C11875;
[0035](4)特級（無噬菌體、內(nèi)毒素）胎牛血清（杭州四季青），批號：090802 ;
[0036] (5)完全培養(yǎng)液：量取IOml胎牛血清，加RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液90ml，4°C保存；
[0037] (6)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物高科技有限公司），批號：091111;
[0038] (7)人IFN-γELISA檢測試劑盒及TMB底物顯色劑（BD，美國），批號：34100;
[0039] (8)PHA(Sigma，美國）。
[0040] (9)洗液：Tween 20+PBS (5/10000, v/v)
[0041] (10)檢測緩沖液：胎牛血清+PBS(10/100,v/v)
[0042] 以上儀器和試劑在后續(xù)的實施例中是共用和通用的。
[0043] 2.參考品溶液的制備
[0044] 取重組人白介素12生物學(xué)活性測定參考品，按使用說明書復(fù)溶后，用完全培養(yǎng)液 稀釋至約每Iml含1600IU，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀 釋度做2個復(fù)孔。每孔分別留100μ1參考品溶液，棄去孔中多余溶液，以上操作均在無菌 條件下進(jìn)行。
[0045] 3.供試品溶液的制備
[0046] 將供試品按標(biāo)示量用滅菌注射用水復(fù)溶，復(fù)溶完全后用旋渦混合器充分混合。用 完全培養(yǎng)液稀釋至每Iml約含1600IU(IL-12濃度約為160ng/ml)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個復(fù)孔。每孔分別留100μ1供試品溶液， 棄去孔中多余溶液，以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。
[0047] 4.測定方法
[0048] 4.IPBMC的分離
[0049] 抽取靜脈血20ml，肝素抗凝，Hanks'液等量混勻，各取5mlFicoll淋巴細(xì)胞分離 液置于6支15ml刻度離心管中，將稀釋的血液沿管壁緩緩疊加于分離液上，形成清晰的界 面，置水平離心機(jī)中，2000r/min離心20min，用滴管直接吸出單個核細(xì)胞層置于另一刻度 離心管中，加入4倍量以上的Hanks'液，充分混勻，1000r/min離心IOmin,傾去上清液，再 用Hank液洗兩次，用Iml完全培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X106個 /ml。繼加PHA(終濃度lOyg/ml)溶液混勻，置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中溫育24h后， 用無菌PBS(1000r/10min)洗滌兩次后，加完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度成 2X106/ml。
[0050] 4. 2IFN-γ的誘生
[0051] 在加有參考品溶液和供試品溶液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入活化后細(xì)胞懸液 100μ1/孔，于37°C5%CO2培養(yǎng)48小時后，每孔取50μ1培養(yǎng)上清ELISA(按BD公司試劑 盒說明書操作）法測定IFN-γ含量。
[0052] 4.3IFN-Y含量測定
[0053] 1)包被酶標(biāo)板：用包被緩沖液稀釋鼠抗人IFN-Y單克隆抗體，包被抗體與包被緩 沖液I:250稀釋，100μ1/孔包被ELISA板，4°C放置過夜。
[0054] 2)洗板：用含0. 05%Tween20的PBS溶液洗滌三次，最后一次洗滌后將酶標(biāo)板在 吸水紙上拍干，以除去剩余的洗滌液。
[0055] 3)阻斷：加入含10%胎牛血清的PBS終止包被抗體與酶標(biāo)板的結(jié)合，200μ1/孔， 室溫孵育1小時。
[0056] 4)洗板：用含0. 05%Tween20的PBS溶液洗滌三次，最后一次洗滌后將酶標(biāo)板在 吸水紙上拍干，以除去剩余的洗滌液。
[0057] 5)加樣：洗滌后每孔加入含10 %胎牛血清的PBS50μ1/孔及細(xì)胞培養(yǎng)上清液 50μ1/孔充分混勻,密封酶標(biāo)板,室溫孵育2小時。
[0058] 6)按步驟4)洗板5次。
[0059] 7)洗滌后加入生物素標(biāo)記的鼠抗人IFN-Y單克隆抗體及親合素標(biāo)記的辣根過氧 化物酶100μI/ ?L密封酶標(biāo)板,室溫孵育1小時。生物素標(biāo)記的鼠抗人IFN-γ單克隆抗 體及親合素標(biāo)記的辣根過氧化物酶與檢測緩沖液按I:250稀釋。
[0060] 8)按步驟4)洗板7次。
[0061] 9)顯色：洗滌后加TMB顯色劑，室溫避光放置30分鐘。
[0062] 10)終止：加入50μ1終止液，450nm波長立刻讀板。
[0063] 5.結(jié)果處理
[0064] 試驗數(shù)據(jù)采用計算機(jī)程序或四參數(shù)回歸計算法進(jìn)行處理。并按下式計算試驗結(jié) 果：
[0065] 供試品生物學(xué)活性（lU/ml)=PrX DrXEr
[0066]式中Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，IU/ml;
[0067] Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0068] Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0069]Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；
[0070]Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。
[0071] 具體檢測例如下：
[0072] 檢測例1
[0073] 選用濃度分別為20、10、5、2. 5μg/ml的四種PHA溶液對PBMC進(jìn)行活化，經(jīng) rhIL-12誘生的INF-γ結(jié)果見圖1。由圖1可知，PHA濃度越高，活化后的PBMC經(jīng)IL-12誘 生后INF-γ量越高，PHA濃度為10μg/ml時，量效關(guān)系最明顯，因此為最佳活化濃度，以下 實驗均選用10μg/mlPHA活化PBMC后檢測IL-12生物學(xué)活性。經(jīng)PHA活化后加培養(yǎng)液的 對照組INF-γ誘生的量極少。
[0074] 檢測例2PBMC未經(jīng)PHA活化或經(jīng)PHA活化后誘生INF-γ量的比較
[0075]方法：按常規(guī)方法分離外周血單核細(xì)胞（PBMC)，最終用完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào) 整細(xì)胞濃度為2X106/ml。制備好的細(xì)胞分成兩組，一組直接將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng) 板中，100μ1/孔，并加入相應(yīng)濃度IL-12,培養(yǎng)48h后ELISA法測定培養(yǎng)上清中INF-Y 濃度；另一組加PHA10μg/ml活化24h后，用PBS洗滌兩次后重新計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度成 2X106/ml，并將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100μ1/孔，同上法加IL-12誘生INFi。 以IL-12濃度對誘生的INF-γ吸光度作圖。結(jié)果顯示，PBMC經(jīng)PHA活化后加IL-12誘生 INF-γ的量比經(jīng)未活化的PBMC誘生INF-γ的量差異顯著（見圖2)。
[0076] 檢測例3新的檢測方法（經(jīng)PHA活化）與原方法的生物活性測定曲線比較
[0077] 選用20例健康人的PBMC，采用經(jīng)和未經(jīng)PHA活化的方法進(jìn)行檢測，近乎40 %呈典 型S型曲線；經(jīng)PHA活化，近乎100%呈典型S型曲線，說明新方法明顯優(yōu)于原方法參見圖3 和圖4。
[0078] 檢測例4PBMC未經(jīng)PHA活化或經(jīng)PHA活化后檢測相同批次IL-12效價的比較
[0079] 同上法分別加入IL-12活性參考品和一批待檢樣品，檢測待檢樣品的生物學(xué)活 性，結(jié)果見表1和圖5。由表1可知，兩種方法檢測對樣品的生物學(xué)活性檢測結(jié)果無顯著性 差異。
[0080] 表IPBMC未經(jīng)PHA活化或經(jīng)PHA活化后IL-12效價（η= 4,IU/支）

【權(quán)利要求】
1. 一種重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，其特征在于，在rhIL-12刺激外周 血單個核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素一 gamma來檢測時，采用植物血凝素預(yù)活化PBMC。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，其特征在于，所 述的預(yù)活化采用抗CD3抗體或刀豆球蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，其特征在于，所 述的rhIL-12由采用基因工程技術(shù)重組的中華地鼠卵巢細(xì)胞株表達(dá)和生產(chǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法，其特征在于，所 述的PHA使用時刺激濃度為10 y g/ml。
5. 權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-12的生物活性檢測方法用于rhIL-12作為藥 物時的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制。
【文檔編號】G01N33/68GK104357534SQ201410640781
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】王翠玲, 王增松, 李文棠, 郭桂鈴, 夏書奇, 李平, 張宜俊 申請人:廣州市愷泰生物科技有限公司