專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白活性的方法。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素-12 (Human Interleukin 12，hIL-12)是一種異二聚體細(xì)胞因子，由 P35和p40兩個(gè)亞單位通過(guò)多對(duì)二硫鍵連接組成。hIL-12又稱(chēng)為NK細(xì)胞刺激因子(NKSF)， hIL-12具有強(qiáng)烈的抗腫瘤和抗病毒效益，這種效應(yīng)是由機(jī)體的自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells, NK細(xì)胞)介導(dǎo)的，hIL-12還在細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、B細(xì)胞的發(fā) 育分化和成熟活化中起重要作用，被譽(yù)為免疫系統(tǒng)行使抗病毒、抗腫瘤的核心調(diào)控因子，機(jī) 體天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。這一系列的生物學(xué)功能使人們認(rèn)識(shí)到hIL-12有可能在臨 床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。目前，重組人白細(xì)胞介素-12 (Recombinant Human Interleukin 12,rhIL-12)作為一種藥物已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤、抗病毒性疾病和過(guò)敏性哮喘的臨床試驗(yàn)階段。 rhIL-12的活性直接關(guān)系到臨床上治療效果評(píng)價(jià)及用藥劑量等關(guān)鍵問(wèn)題。目前，用于活性測(cè) 定的NK細(xì)胞、T細(xì)胞主要來(lái)源于正常人外周血或新生兒臍血，由于個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、 重復(fù)性、靈敏度均難以保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步驟1)用不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞 CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素，檢測(cè)每種濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人 自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生的、干擾素的量，以產(chǎn)生的、干擾素的量為 縱坐標(biāo)，以重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，作曲線圖，得到S型標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖，從所述S型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中得到所述Y干擾素的量為其最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的重組 人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值，將該濃度值記作ED5(Is ；2)用不同濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞 CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素，檢測(cè)每種濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自 然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生的、干擾素的量，以產(chǎn)生的、干擾素的量為縱 坐標(biāo)，以待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，作曲線圖，得到S型曲線圖，從所 述S型曲線圖中得到所述Y干擾素的量為其最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)重組人白細(xì)胞 介素-12蛋白的濃度值，將該濃度值記作ED5to ；3)根據(jù)公式I，計(jì)算得到所述待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性，<formula>formula see original document page 4</formula> ( 公式 I)其中，Ps為重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的活性值，Pr為待測(cè)重組人白細(xì)胞 介素-12蛋白的活性值；
所述步驟1)中所用的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901與所述步驟2)中 所用的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901的狀態(tài)相同，所述步驟1)的刺激NKG細(xì)胞 產(chǎn)生Y干擾素的方法與所述步驟2)中的刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生Y干擾素的方法相同，所述步 驟1)的檢測(cè)每種濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生的Y干擾素 的量的方法與所述步驟2)中的檢測(cè)每種濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激NKG 細(xì)胞產(chǎn)生的Y干擾素的量的方法相同；所述步驟1)和所述步驟2)沒(méi)有先后順序。上述過(guò)程中，所述步驟1)中，所述用不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素的方法包括如下步驟將 所述不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901共培養(yǎng)，得到所述Y干擾素；所述步驟2)中，所述用不同濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自然殺 傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素的方法包括如下步驟將所述不同濃度的待 測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白與所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901共培養(yǎng)，得 到所述、干擾素。上述過(guò)程中，所述步驟1)的共培養(yǎng)中，所述共培養(yǎng)的體系由所述重組人白細(xì)胞介 素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901和培養(yǎng)基組成；所述步驟2)的共培養(yǎng)中，所述共培養(yǎng)的體系由所述待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋 白、所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901和培養(yǎng)基組成；上述過(guò)程中，在所述步驟1)和所述步驟2)前，包括如下細(xì)胞活化步驟將人自然 殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901接種于細(xì)胞培養(yǎng)基I中，在溫度為37°C、二氧化碳體積濃 度為5%的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)基I由a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白細(xì)胞介素-2組 成，a -MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白介素-2的配比為8ml a -MEM培養(yǎng)基1ml 胎牛血清1ml馬血清1000IU重組人白介素_2。上述過(guò)程中，所述共培養(yǎng)中培養(yǎng)基由1640培養(yǎng)基和胎牛血清組成，1640培養(yǎng)基與 胎牛血清的體積比為9 1 ；所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901在所述共培養(yǎng)體系中的濃度為 2. 5X105 個(gè)/ml ；所述共培養(yǎng)的溫度為37°C，所述共培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%，所述共培養(yǎng) 的時(shí)間為12-48小時(shí)，具體為18-24小時(shí)。上述過(guò)程中，所述步驟1)中重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在所述共培養(yǎng)體系 中的濃度分別為 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. lng/ml、 0.05ng/ml ；所述步驟2)中待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白在所述共培養(yǎng)體系中的濃度分別 為 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、L 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. Ing/mKO. 05ng/mlo上述過(guò)程中，所述檢測(cè)Y干擾素的量的方法為酶聯(lián)免疫法，其中所用的一抗為、 干擾素單克隆抗體。上述過(guò)程中，所述重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性為重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激淋巴細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)生、干擾素的活性；所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞或 B細(xì)胞。人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901在檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激 自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生Y干擾素的活性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明采用人自然殺傷細(xì)胞(NKG細(xì)胞)CGMCC No. 2901作為測(cè)活細(xì)胞株，該細(xì)胞 株具有性能穩(wěn)定均一、易培養(yǎng)、傳代次數(shù)不受限制的特點(diǎn)，并且在IL-12蛋白的刺激下可產(chǎn) 生、干擾素，存在時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系，是測(cè)rhIL-12蛋白活性得理想載體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn) 證明，本發(fā)明方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠且重復(fù)性好(檢測(cè)了 3份樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，均 得到正確結(jié)果)，避免了現(xiàn)有技術(shù)中來(lái)源于正常人外周血或新生兒臍血的NK細(xì)胞、T細(xì)胞不 穩(wěn)定、有時(shí)檢測(cè)不出結(jié)果的弊端。另外，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定且成本低廉、具有 很高的穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度及特異性。因此，本發(fā)明方法在rhIL-12蛋白活性檢測(cè)領(lǐng)域 將有廣闊的應(yīng)用前景，為rhIL-12蛋白的臨床應(yīng)用、藥性檢測(cè)等提供了良好的基礎(chǔ)。


圖1. ELISA方法檢測(cè)、干擾素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2.不同濃度rhIL-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品NKG細(xì)胞共孵育24小時(shí)后產(chǎn)生、干擾素的量。圖3.不同濃度rhIL-12蛋白待測(cè)樣品與NKG細(xì)胞共孵育24小時(shí)后產(chǎn)生、干擾
素的量。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。NKG細(xì)胞的制備1.外周血標(biāo)本取患有非何杰金氏淋巴瘤的病人的外周血10ml，肝素抗凝，經(jīng)患
者同意。2.外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離用10ml無(wú)菌PBS溶液稀釋抗凝外周血標(biāo)本后，用淋 巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2200轉(zhuǎn)/分，30分鐘，20度；吸取中界層面的單個(gè)核細(xì) 胞，使用PBS溶液洗滌3遍，1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，20度；使用250 u 1無(wú)菌PBS溶液重懸細(xì) 胞，計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為1. 1 X 107250 ul,4度放置，備用。3. NK細(xì)胞的分離純化向上述細(xì)胞溶液中加入20 u 1非特異的鼠IgG，4度，30分 鐘，以封閉非特異性結(jié)合。向細(xì)胞溶液中加入100 ill CD56 MicroBeads，振蕩混勻，4度，30 分鐘，每10分鐘混勻一次。使用MACS分選器分選細(xì)胞，收集⑶56陽(yáng)性的NK細(xì)胞。使用 PBS溶液洗滌2遍，1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，20度；使用完全a -MEM液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào) 整濃度為1. OX 105/ml，37度，5% C02培養(yǎng)；上述細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，⑶56陽(yáng)性細(xì)胞占 95%以上。4.克隆化生長(zhǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)將上述純化的NK細(xì)胞經(jīng)有限稀釋至每毫升含5個(gè) 細(xì)胞，加至96孔板中，100 u 1/孔，相當(dāng)于每孔含0. 5個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液為完全a -MEM液體培 養(yǎng)基，37度，5% C02培養(yǎng)；及時(shí)補(bǔ)加IL-2溶液，使其濃度維持在100U/ml左右。觀察克隆形成情況，培養(yǎng)10天后部分孔出現(xiàn)細(xì)胞克隆，選擇單個(gè)克隆孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至足夠數(shù)量時(shí)，挑取 呈克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞增殖后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，獲得 性狀穩(wěn)定的細(xì)胞群體，其中1株細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)184天，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)69天， 細(xì)胞生長(zhǎng)情況、細(xì)胞狀態(tài)等均良好，將此株細(xì)胞命名為NKG細(xì)胞。該NKG細(xì)胞(人自然殺傷細(xì)胞)已于2009年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2901。重組人白細(xì)胞介素-12 (rhIL-12)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自NIBSC(The National Institutefor Biological Standards and Control)。重組人白細(xì)胞介素 _2 購(gòu)自長(zhǎng)春生 物制品研究所。胎牛血清購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司，馬血清購(gòu)自上海依科賽生物 制品有限公司。1640培養(yǎng)基、a-MEM(液體)培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司。人、干擾素 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bender公司，試劑盒中包括人、干擾素標(biāo)準(zhǔn)品、鼠抗人、干擾素單 克隆抗體、鼠抗人、干擾素單克隆抗體包被的板及其他檢測(cè)中需要的試劑。1640完全培養(yǎng)基由1640培養(yǎng)基和胎牛血清組成，1640培養(yǎng)基與胎牛血清的體積 比為9 1。1640培養(yǎng)基的配制取1640干粉培養(yǎng)基1袋(10. 4克)，加入到裝有950ml三 蒸水的燒杯內(nèi)，磁力攪拌器攪拌使其完全溶解，加入2. 0克NaHC03，繼續(xù)攪拌至溶解，用1M 的HC1調(diào)節(jié)PH值7. 2，使用三蒸水定容至lOOOmL，0. 22um無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，得到1640培 養(yǎng)基，4°C保存。使用前加入10%體積的胎牛血清，即為1640完全培養(yǎng)基。微量移液器購(gòu)自法國(guó)Gilson公司，78-1型磁力加熱攪拌器購(gòu)自江蘇安普電 子工程有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司，C02培養(yǎng)箱購(gòu)自 Thermo forme公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自BI0-RAD公司。實(shí)施例1、檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性一、細(xì)胞活化及準(zhǔn)備將NKG細(xì)胞(人自然殺傷細(xì)胞)CGMCC No. 2901接種于細(xì)胞培養(yǎng)基I中，在37°C、 5% C02的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；期間可視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代。所述細(xì)胞培養(yǎng)基I由a -MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白細(xì)胞介素_2組 成，a -MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白介素-2的配比為8ml a -MEM培養(yǎng)基1ml 胎牛血清1ml馬血清1000IU重組人白細(xì)胞介素_2。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NKG細(xì)胞于50ml無(wú)菌離心管中，800rpm，lOmin，離心，棄上 清，PBS溶液洗滌兩遍后，懸于1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基)中，調(diào) 整細(xì)胞濃度為5X 105個(gè)/ml，按100 u 1/孔加入96孔板各孔中，共36孔。二、標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品的準(zhǔn)備本實(shí)施例所用的待測(cè)樣品為重組人白細(xì)胞介素12凍干劑(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)免 疫學(xué)研究所生產(chǎn)，活性為6. lX106(IU/mg))。1、標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備將rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品溶于1. 0ml注射用水中，然后使用1640完全培養(yǎng)基稀釋成 以下 8 個(gè)稀釋度(ng/ml) :12. 8、6. 4、3. 2、1. 6、0. 8、0. 4、0. 2、0. 1，備用；2、待檢樣品的準(zhǔn)備將待檢樣品溶于1. 0ml注射用水中，然后使用1640完全培養(yǎng)基稀釋成以下8個(gè)稀釋度(ng/ml) 12. 8、6. 4、3. 2、1. 6、0. 8、0. 4、0. 2、0. 1，備用。三、共培養(yǎng)(、干擾素的誘生)標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組和待檢品實(shí)驗(yàn)組均在同一 96孔板上進(jìn)行試驗(yàn)。1、標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組向步驟一中加有細(xì)胞的96孔板對(duì)應(yīng)孔中分別加入100 ill不同 稀釋度的IL-12標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)稀釋度做雙復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)基對(duì)照2孔。37°C，5% C02培 養(yǎng)24小時(shí)；共培養(yǎng)體系由IL-12標(biāo)準(zhǔn)品、NKG細(xì)胞和1640完全培養(yǎng)基組成，IL-12標(biāo)準(zhǔn)品在共 培養(yǎng)體系中的濃度分別為 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、 0. lng/ml、0. 05ng/ml，人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901在共培養(yǎng)體系中的濃度為 2. 5X105 個(gè)/ml。2、待檢品實(shí)驗(yàn)組向步驟一中加有細(xì)胞的96孔板對(duì)應(yīng)孔中分別加入100 ill不同 稀釋度的IL-12待檢品，每個(gè)稀釋度做雙復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)基對(duì)照2孔。37°C，5% C02培 養(yǎng)24小時(shí)；共培養(yǎng)體系由IL-12待檢品、NKG細(xì)胞和1640完全培養(yǎng)基組成，IL-12待檢品在共 培養(yǎng)體系中的濃度分別為 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、 0. lng/ml、0. 05ng/ml，人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901在共培養(yǎng)體系中的濃度為 2. 5X105 個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)證明，標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)胞混合后，培養(yǎng)時(shí)間從18小時(shí)-24小時(shí)，結(jié)果均一致，待測(cè) 品也如此。四、Y干擾素含量檢測(cè)取培養(yǎng)后的NKG細(xì)胞上清50 u 1，酶聯(lián)免疫法(ELISA方法)測(cè)定、干擾素含量。1、稀釋人、干擾素標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液將、干擾素標(biāo)準(zhǔn)品先1 10，再 1 100 稀釋為 200pg/ml，倍比稀釋為(pg/ml)200、100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125、0，共 8 個(gè)梯度。2、用洗滌液洗滌鼠抗人Y干擾素單克隆抗體包被的板條2次，拍干。3、分別取待檢樣品組細(xì)胞上清50 u 1、標(biāo)準(zhǔn)品組細(xì)胞上清50 u 1加入酶標(biāo)板中(待 檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均做復(fù)孔)，再加入50 yl樣品稀釋液和50 yl生物素標(biāo)記的鼠抗人、干 擾素單克隆抗體工作液，混勻，室溫(22°C 士4°C )放置2小時(shí)。用洗滌液洗板3次，拍干； 每孔加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶工作液lOOyl，室溫(22°C 士 4°C )放置1小時(shí)。用 洗滌液洗板3次，拍干后，每孔加TMB底物工作液100 iU，室溫(22°C 士4°C )靜置10-20分 鐘，每孔再加終止液100 Pi。450nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。五、作S型曲線圖1、標(biāo)準(zhǔn)品作圖采用Origin軟件，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的A值作圖，結(jié)果如圖1所示。以產(chǎn)生的、干擾素的量為縱坐標(biāo)，以人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐 標(biāo)，作圖，結(jié)果如圖2所示。2、待檢品作圖根據(jù)圖1，輸入待檢樣品A值直接求出待檢樣品、干擾素含量。以產(chǎn)生的、干擾 素的量為縱坐標(biāo)，以人白細(xì)胞介素-12蛋白待檢品的濃度為橫坐標(biāo)，作圖，結(jié)果如圖3所示。
六、待測(cè)樣品活性計(jì)算以Y干擾素含量對(duì)樣品稀釋度作圖，計(jì)算各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的ED50(即、干擾素含
量為最大濃度的一半時(shí)的樣品濃度)，并按下式計(jì)算結(jié)果<formula>formula see original document page 9</formula>
Ps 標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)，iu/mg ；ed50s 標(biāo)準(zhǔn)品 ed50 ；ED5Qr 待測(cè)樣品 ED50。待測(cè)樣品效價(jià)=1.0x107 (iu/mg) x0. 58645 (ng/ml)/0. 94505 (ng/ml)= 6. 2x106(iu/mg)結(jié)果檢測(cè)得到的效價(jià)正確。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，第一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為6. 2x106(iu/ mg)，第二次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為5.95\106(貝/1^)，第三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為6.3\106(貝/1^)。表 明，本發(fā)明方法結(jié)果可靠。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步驟1)用不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生γ干擾素，檢測(cè)每種濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生的γ干擾素的量，以產(chǎn)生的γ干擾素的量為縱坐標(biāo)，以重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，作曲線圖，得到S型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從所述S型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中得到所述γ干擾素的量為其最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值，將該濃度值記作ED50s；2)用不同濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生γ干擾素，檢測(cè)每種濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生的γ干擾素的量，以產(chǎn)生的γ干擾素的量為縱坐標(biāo)，以待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，作曲線圖，得到S型曲線圖，從所述S型曲線圖中得到所述γ干擾素的量為其最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的濃度值，將該濃度值記作ED50r；3)根據(jù)公式I，計(jì)算得到所述待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性， <mrow><mi>Pr</mi><mo>=</mo><mi>Ps</mi><mo>&times;</mo><mfrac> <msub><mi>ED</mi><mrow> <mn>50</mn> <mi>s</mi></mrow> </msub> <msub><mi>ED</mi><mrow> <mn>50</mn> <mi>r</mi></mrow> </msub></mfrac> </mrow>(公式I)其中，Ps為重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的活性值，Pr為待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性值；所述步驟1)中所用的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901與所述步驟2)中所用的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901的狀態(tài)相同，所述步驟1)的刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的方法與所述步驟2)中的刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的方法相同，所述步驟1)的檢測(cè)每種濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素的量的方法與所述步驟2)中的檢測(cè)每種濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激NKG細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素的量的方法相同；所述步驟1)和所述步驟2)沒(méi)有先后順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述用不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷 細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素的方法包括如下步驟將所述不同濃度的重組 人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別與所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCCNo. 2901共培養(yǎng)， 得到所述Y干擾素；所述步驟2)中，所述用不同濃度的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激人自然殺傷細(xì) 胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901產(chǎn)生、干擾素的方法包括如下步驟將所述不同濃度的待測(cè)重 組人白細(xì)胞介素-12蛋白分別與所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCCNo. 2901共培養(yǎng)，得到 所述Y干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟1)的共培養(yǎng)中，所述共培 養(yǎng)的體系由所述重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901和培養(yǎng)基組成；所述步驟2)的共培養(yǎng)中，所述共培養(yǎng)的體系由所述待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白、 所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901和培養(yǎng)基組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟1)和所 述步驟2)前，包括如下細(xì)胞活化步驟將人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCCNo. 2901接種于細(xì) 胞培養(yǎng)基I中，在溫度為37°C、二氧化碳體積濃度為5%的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)基I由a "MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白細(xì)胞介素_2組成， a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和重組人白細(xì)胞介素-2的配比為8ml a-MEM培養(yǎng)基 lml胎牛血清1ml馬血清1000IU重組人白細(xì)胞介素_2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)中培養(yǎng)基由1640培 養(yǎng)基和胎牛血清組成，1640培養(yǎng)基與胎牛血清的體積比為9 1 ；所述人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No. 2901在所述共培養(yǎng)體系中的濃度為2. 5X105 個(gè)/ml ；所述共培養(yǎng)的溫度為37°C，所述共培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%，所述共培養(yǎng)的時(shí) 間為12-48小時(shí)，具體為18-24小時(shí)，再具體為24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中重組人白細(xì)胞 介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在所述共培養(yǎng)體系中的濃度分別為6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、 0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. lng/ml、0. 05ng/ml ；所述步驟2)中待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白在所述共培養(yǎng)體系中的濃度分別為 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、L 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. Ing/mKO. 05ng/mlo
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)Y干擾素的量的方法 為酶聯(lián)免疫法，其中所用的一抗為Y干擾素單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述重組人白細(xì)胞介素-12蛋 白的活性為重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激淋巴細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)生Y干擾素的活性；所述淋巴 細(xì)胞細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞。
9.人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCCNo. 2901在檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白刺激自 然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生Y干擾素的活性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白活性的方法。該方法包括如下步驟1)用不同濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生γ干擾素，檢測(cè)每種濃度的重組人白細(xì)胞介素-12蛋白標(biāo)準(zhǔn)品刺激人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞CGMCC No.2901產(chǎn)生的γ干擾素的量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)用于1)相同的方法用待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，得到所述γ干擾素的量為其最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的濃度值；3)計(jì)算得到所述待測(cè)重組人白細(xì)胞介素-12蛋白的活性。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定且成本低廉、具有很高的穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度及特異性。因此，本發(fā)明方法在rhIL-12蛋白活性檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景，為rhIL-12蛋白的臨床應(yīng)用、藥性檢測(cè)等提供了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101799474SQ201010134960
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者孫汭, 田志剛, 程民, 鄭曉東, 魏海明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)