專利名稱：有生物學(xué)活性的、含c-端精氨酸的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)注來(lái)自蛋白胨的活性肽片段的分離、鑒定和表征。
背景技術(shù)：
常常將動(dòng)物和植物組織的水解產(chǎn)物添加至原核和真核細(xì)胞的培養(yǎng)基以提高存活 細(xì)胞數(shù)目和重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物滴度。如此，在細(xì)胞培養(yǎng)基配方中已經(jīng)廣泛采用了來(lái)自多種多 樣來(lái)源的蛋白胨來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)、壽命和生產(chǎn)率。然而，由于它們不明確的性質(zhì)，它 們作為用于治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)的培養(yǎng)基添加劑的存在呈現(xiàn)了數(shù)項(xiàng)挑戰(zhàn)。動(dòng)物衍生成分作為用于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基添加劑的使 用會(huì)引起病毒、支原體和朊病毒污染(Kallel等，J. Biotechnol. 95 195-204(2002))。避 免在細(xì)胞培養(yǎng)基使用動(dòng)物衍生成分的努力得到了歐洲和美國(guó)管理當(dāng)局的支持(Castle和 Roberston, Dev. Biol. Stand. 99 191-196 (1999))。在過(guò)去的幾十年里已經(jīng)自培養(yǎng)基中成功 消除了動(dòng)物血清，而且大多數(shù)當(dāng)前使用的培養(yǎng)基被證實(shí)是不含蛋白質(zhì)的(Froud，Dev. Biol. Stand. 99 157-166 (1999))。然而，轉(zhuǎn)換成不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基常常導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力 的損失(Lee 等，J. Biotechnol. 69 :85_93 (1999))。結(jié)果是，常常在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(也叫作蛋白胨(peptone))作 為營(yíng)養(yǎng)添加劑，因?yàn)樗鼈冎械囊恍┛梢哉J(rèn)為是不含蛋白質(zhì)的(Burteau等，In Vitro Cell. Dev. Biol.-Anim. 39(7) :291_296 (2003))。用于細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白胨通常通過(guò)各種各樣的基 于生物學(xué)的起始材料(動(dòng)物組織、奶衍生產(chǎn)品、微生物或植物)的酶促消化來(lái)制造。蛋白胨的總體效果是增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)率(productivity)，且產(chǎn)品 品質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比相同(Jan 等，Cytotechnology 16 17-26 (1994) ；Heidemann 等，Cytotechnology 32 157-167 (2000) ；Sung φ, Appl. Microbiol. Biotechnol. 63 527-536(2004))。數(shù)份論文顯示了蛋白胨含有諸如游離氨基酸、寡肽、鐵鹽、脂質(zhì)和痕量 元素等物質(zhì)(Franek 等，Biotechnol. Prog. 16 :688_692 (2000) ；Martone 等，Bioresour. Technol. 96 :383_387 (2005))。一項(xiàng)研究調(diào)查了蛋白胨的潛在作用，并顯示了它們會(huì)具 有營(yíng)養(yǎng)效果(Heidemann 等，Cytotechnology 32:157-167(2000))。同樣，Schlaeger, J. Immunol. Meth. 194 191-199 (1996)證明了一種特定的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物展示出抗凋亡特 性。盡管對(duì)蛋白胨在細(xì)胞培養(yǎng)中的效果進(jìn)行了眾多調(diào)查，它們的作用機(jī)制仍然未知。 而且即使已經(jīng)顯示了蛋白胨在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中是有益的，然而它們的使用也具有許多缺 點(diǎn)。首先，由于有些蛋白胨是動(dòng)物衍生的，因此產(chǎn)生以使用血清相似的問(wèn)題。另外，來(lái)自其 它來(lái)源的蛋白胨也可能是外來(lái)因子(adventitious agent)的潛在來(lái)源。其次，蛋白胨中的 “活性”成分及其作用機(jī)制的不確定性使之難以測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)制備過(guò)程中所使用的蛋白胨 批次的品質(zhì)(如果不是不可能的話)。最后，因?yàn)榈鞍纂酥苽涞膩?lái)源材料和工藝不是標(biāo)準(zhǔn)化 的或普遍可互換的，所以蛋白胨自身本性是單一來(lái)源的原材料。因此，有機(jī)會(huì)更好地表征蛋 白胨以減少或消除這些缺點(diǎn)。因此，了解蛋白胨中活性成分的組成和特性以創(chuàng)建已很好確定可再生產(chǎn)濃度的、包含詳細(xì)說(shuō)明活性成分的“確定成分培養(yǎng)基”會(huì)是有利的。另外，通過(guò)打開控制細(xì)胞生長(zhǎng)和 死亡及更好地控制重組蛋白質(zhì)表達(dá)的窗口，活性蛋白胨成分的鑒定預(yù)期導(dǎo)致更好地了解重 組宿主細(xì)胞和細(xì)胞系的生理學(xué)狀況。 因此，本文付出了努力來(lái)表征蛋白胨組成和了解它們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的效果的機(jī)制。本發(fā)明基于將動(dòng)物衍生的蛋白胨(PP3)分級(jí)成可鑒定的成分，并且通過(guò)應(yīng)用現(xiàn)代 分析技術(shù)(包括高分辨率質(zhì)譜術(shù))來(lái)研究這些化合物的性質(zhì)。本發(fā)明至少部分基于以精氨 酸為末端的二肽和三肽在PP3的促進(jìn)生長(zhǎng)和提高滴度的活性中發(fā)揮作用的認(rèn)識(shí)。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明關(guān)注式(Xl)nX2R的肽，其中Xl和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸；η 為 0 或 1;且R代表精氨酸，其中所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是通過(guò)對(duì)蛋白胨(諸如ΡΡ3蛋白胨)分級(jí)獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽選自表1中所列出的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是三肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是三肽，選自表1中所列出的肽。蛋白胨生物學(xué)活性可以例如選自下組促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；提高細(xì)胞密度；提高存活 細(xì)胞計(jì)數(shù)；和提高重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)產(chǎn)率。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種組合物，其包含如上文所定義的二肽或三肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是細(xì)胞培養(yǎng)基。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含如上文所定義的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述重組宿 主細(xì)胞可以是任何真核或原核宿主，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和大腸桿菌細(xì) 胞。由所述宿主細(xì)胞生成的所述異源蛋白質(zhì)可以是例如抗體(包括抗體片段)或任何 治療性蛋白質(zhì)。還有一方面，本發(fā)明關(guān)注兩種或更多種如上文所定義的肽的混合物。在一個(gè)不同的方面，本發(fā)明關(guān)注一種組合肽文庫(kù)，其包含(Xl)nX2R的肽、基本上由 (Xl) nX2R的肽組成、或由(Xl) nX2R的肽組成，其中Xl和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸；η 為 0 或 1 ；且R代表精氨酸，其中至少一些所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。還有一方面，本發(fā)明關(guān)注一種用于重組生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括在適合于所 述異源蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的重組宿主細(xì)胞， 其中所述培養(yǎng)基包含至少一種權(quán)利要求1的肽。由于下面的描述(包括實(shí)施例)，本發(fā)明的這些和其它方面會(huì)變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述


圖1是如實(shí)施例中所描述的PP3分級(jí)和分析的示意圖。圖2顯示了 C18反相層析的結(jié)果。 圖3顯示了 C18流出(未結(jié)合)級(jí)分的層析結(jié)果。“相對(duì)比活性”定義為相等重量 的級(jí)分的活性除以PP3的。圖4A和4B顯示了 G15純化的材料(級(jí)分F3-F7)的比活性相對(duì)于PP3的比活性 顯著升高，就其提高重組蛋白質(zhì)滴度(圖3A)和存活細(xì)胞計(jì)數(shù)(VCC ；圖3B)的能力而言。圖5。G-15級(jí)分的質(zhì)譜分析。頂圖級(jí)分的MS掃描。底圖m/z 403. 2,389. 2和 375. 2 的 ms/ms 分析。圖6。一個(gè)以R為末端的計(jì)算機(jī)(in silico)三肽文庫(kù)中肽的頻率分布。X軸三 肽的質(zhì)量；Y軸位于每種質(zhì)量的頻率。圖7A和B。PP3和XXR肽對(duì)VCC和產(chǎn)物滴度的影響。A 在生物測(cè)定法中響應(yīng)添加 濃度漸增的PP3(黑線)或XXR肽(紅線)而測(cè)量到的VCC。B:在生物測(cè)定法中響應(yīng)添加 濃度漸增的PP3 (黑線)或XXR肽(紅線)而測(cè)量到的產(chǎn)物滴度。圖8。牛I示蛋白胨(proteose peptone)_3(PP3)多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO 1)。發(fā)明詳述A.定義除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常的理解具有相同的含義。Singleton 等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版，J. Wiley&Sons (New York，NY1994)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請(qǐng)中所使 用的許多術(shù)語(yǔ)的一般性指導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“蛋白胨”在本文中以最廣義使用，而且包括通過(guò)部分水解蛋白質(zhì)獲得的水 溶性蛋白質(zhì)衍生物及其混合物，包括但不限于自豬、牛、和其它動(dòng)物的粘膜組織衍生的，通 過(guò)用蛋白水解酶水解生成的水解產(chǎn)物混合物，以及來(lái)自各種植物組織的水解產(chǎn)物。該術(shù) 語(yǔ)明確包括但不限于月示蛋白胨(proteos印印tone) -3 (PP3)，也稱作lactophorin，它是 在牛乳中找到的153個(gè)殘基的次要磷糖蛋白(Sorensen和Sorensen，J. Dairy Res. 60 535-542(1993)) (SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào):P80195 ；GenBank 編號(hào)CAA58309)，及在其 它物種的乳中表征的同源蛋白質(zhì)，像駱駝(Beg等，F(xiàn)EBS Lett. 216 :270_274(1987))、 美洲馬它(Cantisani 等，J. Biochem. Biophys. Methods 21 :227_236 (1990))、綿羊、和山 羊(Sorensen 等，J. Dairy Sci. 80 3176-3181 (1997)及 Lister 等，J. Dairy Res. 81 2111-2115(1998))。到目前為止，在人乳中沒(méi)有找到PP3。PP3可以自商業(yè)來(lái)源獲得，諸如 例如 Difco Laboratories (Detroit, Michigan)。術(shù)語(yǔ)“肽”在本文中用于指含有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的化合物，其中一個(gè)氨基酸的 羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基通過(guò)酰胺或“肽”鍵相連接。該定義明確包括由至少兩個(gè)氨基 酸殘基形成的肽，特別是二肽和三肽?！暗鞍踪|(zhì)”意指鏈長(zhǎng)度足以生成更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。典 型的是，本文中的蛋白質(zhì)會(huì)具有至少約15-20kD、優(yōu)選至少約20kD的分子量。本文中定義內(nèi) 所涵蓋的蛋白質(zhì)的例子包括所有哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，特別是治療性和診斷性蛋白質(zhì)，諸如治 療性和診斷性抗體，及一般而言含有一個(gè)或多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)，包括包含一個(gè)或多個(gè)鏈間和/或鏈內(nèi)二硫鍵的多鏈多肽。 術(shù)語(yǔ)“氨基酸”或“氨基酸殘基”通常指具有其本領(lǐng)域公認(rèn)定義的氨基酸，諸如選 自下組的氨基酸丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸 (Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)；亮氨 酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇 氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)，但是可以根據(jù)需要使用經(jīng)修飾 的、合成的或罕見的氨基酸。如此，37CFR 1.822(b) (4)中列出的經(jīng)修飾的和不常見的氨基 酸包括在此定義內(nèi)，且通過(guò)述及明確收入本文。氨基酸可分成各式各樣的亞組。如此，氨基 酸可以分組成具有非極性側(cè)鏈(例如Ala、Cys, lie、Leu、Met、Phe, Pro、Val)；帶負(fù)電荷的 側(cè)鏈(例如Asp、Glu)；帶正電荷的側(cè)鏈(例如Arg、HiS、LyS)；或不帶電荷的極性側(cè)鏈(例 如 Asn、Cys、Gin、Gly、His、Met、Phe, Ser、Thr、Trp、和 Tyr)。氨基酸也可分組成小氨基酸 (Gly、Ala)、親核氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水氨基酸(Val、Leu、lie、Met、Pro)、芳香 族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)、和堿性氨基酸(Lys、Arg)。涉及本發(fā)明肽的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”或“蛋白胨生物學(xué)活性”用于指已知由蛋白胨 展現(xiàn)的任何生物學(xué)活性，包括但不限于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或提高細(xì)胞密度和/或提高細(xì)胞 存活力、和/或提高異源多肽在重組宿主培養(yǎng)物中的生產(chǎn)效率。術(shù)語(yǔ)“層析”指根據(jù)混合物中的各種溶質(zhì)在流動(dòng)相的影響下或在結(jié)合和洗脫過(guò)程 中穿過(guò)靜止的介質(zhì)遷移的速率的差異，將混合物中的感興趣溶質(zhì)與混合物中的其它溶質(zhì)分 開的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“親和層析”和“蛋白質(zhì)層析”在本文中可互換使用，指其中感興趣蛋白質(zhì)或 感興趣抗體可逆地且特異性地結(jié)合至生物特異性配體的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。優(yōu)選的是，所述 生物特異性配體共價(jià)附著至層析固相材料且在溶液接觸層析固相材料時(shí)是溶液中的感興 趣蛋白質(zhì)可及的。在層析步驟期間，所述感興趣蛋白質(zhì)(例如抗體、酶、或受體蛋白質(zhì))保 留其對(duì)生物特異性配體(例如抗原、底物、輔因子、或激素)的特異性結(jié)合親和力，而混合物 中的其它溶質(zhì)和/或蛋白質(zhì)沒(méi)有可觀察地或特異性地結(jié)合配體。感興趣蛋白質(zhì)對(duì)固定化配 體的結(jié)合容許污染性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)流過(guò)層析介質(zhì)而感興趣蛋白質(zhì)保持特異性結(jié)合 至固相材料上的固定化配體。然后，特異性結(jié)合的感興趣蛋白質(zhì)用低PH、高pH、高鹽、競(jìng)爭(zhēng) 性配體、等等以活性形式自固定化配體消除，并隨洗脫緩沖液流過(guò)層析柱，不含早先容許流 過(guò)柱地污染性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)。任何成分都能用作用于純化其相應(yīng)特異性結(jié)合蛋白質(zhì) (例如抗體)的配體。術(shù)語(yǔ)“非親和層析”和“非親和純化”指其中不利用親和層析的純化過(guò)程。非親和 層析包括依賴感興趣分子(諸如蛋白質(zhì)，例如抗體)與固相基質(zhì)之間的非特異性相互作用 的層析技術(shù)?！叭针x子交換樹脂”指如下的固相，其帶負(fù)電荷且因此有游離陽(yáng)離子供與流過(guò)該 固相的水溶液中的陽(yáng)離子交換。附著至固相以形成陽(yáng)離子交換樹脂的、帶負(fù)電荷的配體 可以是例如羧酸根或磺酸根。商品化的陽(yáng)離子交換樹脂包括羧甲基纖維素、在瓊脂糖上 固定化的磺丙基(SP)(例如 Pharmacia 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW 或 SP-SEPHAR0SE HIGHPERF0RMANCE )和固定化在瓊脂糖上的磺酰基(例如Pharmacia的S-SEPHAR0SE FAST FLOW )。“混合模式離子交換樹脂”指經(jīng)陽(yáng)離子、陰離子、和疏性模塊共價(jià)修飾的固相。商品化的混合模式離子交換樹脂是BAKERBOND ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)，其含有附 著至硅膠固相支持介質(zhì)的弱陽(yáng)離子交換基團(tuán)、低濃度陰離子交換基團(tuán)、和疏水性配體。術(shù)語(yǔ)“陰離子交換樹脂”在本文中用于指帶正電荷的固相，例如具有附著于它的一 個(gè)或多個(gè)帶正電荷的配體，諸如季氨基團(tuán)。商品化的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、QAE SEPHADEX 和 FAST Q SEPHAROSE (Pharmacia)。B.詳細(xì)描述蛋白胨的分級(jí)和分析本發(fā)明基于使用各種層析和其它分離技術(shù)對(duì)活性蛋白胨片段的鑒定。蛋白胨的分級(jí)可通過(guò)本領(lǐng)域公知技術(shù)來(lái)實(shí)施，包括層析步驟的組合。圖1中例 示了一個(gè)用于蛋白胨PP3分級(jí)分離和分析的典型方案。此方案中的第一個(gè)步驟是反相 HPLC(RP HPLC)，其用來(lái)基于各成分的疏水特征將它們分開。化合物在高水性流動(dòng)相中結(jié)合 至反相HPLC柱，并用高有機(jī)性流動(dòng)相自RPHPLC柱洗脫。如此，可以使用此技術(shù)通過(guò)運(yùn)行適 宜有機(jī)溶劑的線性或非線性梯度將肽分開。然后可以對(duì)來(lái)自反相HPLC的流出級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步的層析分離步驟，諸如大小排 阻層析，如圖1所示。大小排阻層析(SEC)依賴基于不同水力半徑的分子在層析柱內(nèi)花費(fèi) 的時(shí)間對(duì)這些分子的分選。作為分子在構(gòu)成柱的靜止相的體積內(nèi)花費(fèi)或多或少時(shí)間的結(jié)果 發(fā)生分配。具有大水力半徑的分子在分離期間早期洗脫；具有較小半徑的分子較晚洗脫。 SEC樹脂是本領(lǐng)域公知的，而且可以自多家制造商購(gòu)買。在下文實(shí)施例所描述的實(shí)驗(yàn)中，使 用了 SEPHADEX G15大小排阻柱(Amersham Biosciences)，但是其它大小排阻柱也是合適 的。如果需要，可以通過(guò)混合模式層析將蛋白胨細(xì)分級(jí)(sub-fractionate)。在此技術(shù) 中，靜止相在單一層析配體中含有兩種不同的結(jié)合域。通常偶聯(lián)的分離原理是離子交換和 RP層析。當(dāng)反相層析(RP層析)未能將結(jié)構(gòu)上接近的肽分開時(shí)，一般需要應(yīng)用混合模式層 析。當(dāng)前，數(shù)家制造商銷售顯示不同特異性的混合模式樹脂，包括Hypercarb樹脂(Thermo Scientific)、Oasis HLB樹脂(Waters Corporation)和 DowexOptipore SD-2樹脂(Dow ChemicalCompany)。Oasis吸附劑是二乙烯基苯和N_乙烯基吡咯烷酮的共聚物。親水-親 脂平衡組合物容許相對(duì)于傳統(tǒng)RP樹脂而言強(qiáng)的RP保留和改善的孔隙潤(rùn)濕。因此，極性和 非極性化合物都能吸附。Oasis珠的平均大小是30 u m。Optipore樹脂的組成與Oasis樹 脂的(具有叔胺的二乙烯基苯)類似，從而給予它RP和弱陰離子交換吸收劑二者的特性。 顆粒平均大小是幾百P m。在每個(gè)純化步驟，可以對(duì)得到的級(jí)分分析生物學(xué)活性和/或進(jìn)行各種分析方法以 測(cè)定它們的組成。肽活性的測(cè)定法可以使用已知的生物測(cè)定法測(cè)試所生成的蛋白胨級(jí)分，包括實(shí)施例中所描述的 基于細(xì)胞的生物測(cè)定法。蛋白胨衍生肽的生物學(xué)活性的測(cè)定法通常基于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中各 種培養(yǎng)參數(shù)的測(cè)量，包括培養(yǎng)基中所討論的肽。此類參數(shù)包括例如細(xì)胞密度、存活細(xì)胞 (viable cell)計(jì)數(shù)、所生成的異源多肽(例如抗體)的生產(chǎn)率、等。此類測(cè)定法披露于 例如 Franek 等，Biotechnol. Prog. 16 688-692 (2000) ；Franek 等，Biotechnol. Prog. 18 155-158(2002) ；Franek 等，Biotechnol. Prog. 19 169-174 (2003) ；Franek 等，Biotechnol.Prog. 21 96-08(2005)。蛋白胨級(jí)分的組成的測(cè)定如此，可以通過(guò)質(zhì)譜術(shù)(MS)、NMR、ICPMS、氨基酸分析、及這些技術(shù)和本領(lǐng)域公知的 其它技術(shù)的各種組合來(lái)分析蛋白胨和蛋白胨級(jí)分的組成。質(zhì)譜儀由離子源、質(zhì)量分析儀、離子檢測(cè)儀、和數(shù)據(jù)獲取單元組成。首先，將肽在離 子源中離子化。然后在質(zhì)量分析儀中依照離子化的肽的質(zhì)荷比將它們分開，并檢測(cè)分開的 離子。質(zhì)譜術(shù)已經(jīng)廣泛用于蛋白質(zhì)分析，尤其在發(fā)明基質(zhì)輔助激光解吸離子化/飛行時(shí)間 (MALDI-T0F)和電噴射離子化(ESI)方法后。有數(shù)種型號(hào)的質(zhì)譜儀，包括例如MALDI-T0F和 三聯(lián)或四極-T0F，或離子阱質(zhì)譜儀偶聯(lián)ESI。如此，例如Q-Tof-2質(zhì)譜儀利用的正交飛行時(shí) 間分析儀，其容許同時(shí)檢測(cè)跨越整個(gè)質(zhì)譜范圍的離子。關(guān)于更多詳情參加例如Chemusevich 等，J. Mass Spectrom. 36 :849_865 (2001)。如果需要，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)測(cè)定肽片段和最終衍生它們的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列，諸如質(zhì)譜術(shù)的某些變化形式、或Edman降解。雖然通過(guò)在特定蛋白胨的降解產(chǎn)物中鑒定的肽片段例示了本發(fā)明，但是預(yù)期其它 蛋白胨會(huì)含有具有相似結(jié)構(gòu)和功能特征的肽成分。組合肽文庫(kù)組合肽文庫(kù)是本領(lǐng)域公知的，而且標(biāo)準(zhǔn)教科書中記載了用于生成和篩選此類文 _白勺^^去，i者女口M女口 Combinatorial Peptide Library Protocols (Methodsin Molecular Biology)，Shmuel Cabilly，編，Humana Press Inc. 1998。組合肽文庫(kù)可以是不同的形式。例如，所謂的“一珠一化合物”文庫(kù)含有數(shù)以千 計(jì)的珠，每個(gè)攜帶單一文庫(kù)化合物的多個(gè)拷貝(Lam等，Nature，354，82-84 (1991))。對(duì)文 庫(kù)篩選期望的活性，并分離任何有活性的珠。然后通過(guò)常規(guī)方法(諸如例如通過(guò)Edman降 解)表征附著至鑒定出的所鑒定的珠的活性化合物。或者，可以采用還原性的(reductive) 辦法。在另一種方法中，即Houghten的定位固定法(Bioorg. Med. Chem. Lett.，14， 1947-1951 (2004))，在篩選前生成一組相關(guān)文庫(kù)。每個(gè)文庫(kù)含有其中一個(gè)特定殘基作為單 一構(gòu)件塊固定且剩余殘基完全隨機(jī)化的化合物。不同文庫(kù)在固定位置處具有不同構(gòu)件塊 (building block)。對(duì)這組文庫(kù)篩選期望活性能夠直接鑒定位于固定殘基處的最適構(gòu)件 塊。此過(guò)程可序貫進(jìn)行，一次優(yōu)化一個(gè)殘基，或者可以同時(shí)篩選整組文庫(kù)以容許直接自單輪 篩選鑒定最適文庫(kù)化合物。使用本文中具體公開的肽，可以使用組合肽文庫(kù)來(lái)鑒定別的具有改善的化學(xué)和/ 或生物學(xué)特征的肽。肽合成依照本發(fā)明鑒定的肽可以通過(guò)常規(guī)肽合成方法來(lái)合成，諸如例如固相合成法，其 能以多種形式實(shí)施，諸如例如使用Fmoc (9H-芴-9-基-甲氧基-羰基)或Boc (叔-丁氧羰 基)保護(hù)基團(tuán)來(lái)保護(hù)合成中所使用的氨基酸單體的N-末端。這兩種技術(shù)的自動(dòng)化合成儀都 可購(gòu)買得到，但是固相肽合成也能手工實(shí)施。更多詳情參加例如Atherton，E.，Sheppard, R. C. (1989). Solid Phase peptidesynthesis -.a practical approach. Ocford, England IRL Press. ISBN 0199630674 ；^Stewart,J.M. ,Young, J. D. (1984). Solid phase peptide synthesis, H 2 fk, Rockford :Pierce Chemical Company,91. ISBN 0935940030。
二肽和三肽的用涂本發(fā)明的二肽和三肽可作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分用于生產(chǎn)重組多肽(包括抗體)。重組多肽(諸如抗體)可以在各種真核和原核宿主生物體中生成。適合于表達(dá)糖基化多肽(諸如抗體)的宿主細(xì)胞可衍生自多細(xì)胞真核生物體。無(wú) 脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的 允許昆蟲宿主細(xì)胞，它們來(lái)自諸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)、和家蠶(Bombyx mori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染， 例如苜蓿尺蠖(Autographa californica) NPV 的 L-1 變體和家蠶(Bombyx mori) NPV 的 Bm_5 株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉、玉 米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。然而，脊椎動(dòng)物細(xì)胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動(dòng)物細(xì)胞的 繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系 (C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞， Graham et al, J. Gen Virol. 36 :59 (1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢細(xì)胞/_DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 4216(1980))；小鼠塞托利 (sertoli)細(xì)胞(TM4,Mather,Biol. R印rod. 23 :243_251 (1980))；猴腎細(xì)胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎 細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺 細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51) ； TRI 細(xì)胞(Mather 等，AnnalsN. Y.Acad. Sci. 383 :44-68 (1982)) ； MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞; 和人肝肉瘤系0fepG2)。例如，可以在dpl2.CH0細(xì)胞中生成重組多肽(諸如抗體)，其是自CH0-K1DUX-B11 細(xì)胞生成的，如EP307247所記載的。CH0-K1 DUX-B11細(xì)胞繼而是自CH0-K1 (ATCC No. CCL61 CH0-K1)細(xì)胞獲得的，遵循 Simonsen，C. C.，和 Levinson，A. D.，(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 2495-2499 及 Urlaub G.，和 Chasin，L.，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA77 4216-4220中記載的方法。另外，已知且能使用其它CH0-K1 (dhfr_)細(xì)胞系。可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成肽、多肽和蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。商 品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10 (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、 和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使 用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham和Wallace (1979)，Meth. in Enz. 58 44 ；Barnes 禾口 Sato (1980)，Anal. Biochem. 102 255 ；U. S. Pat. No. 4，767，704 ； 4，657，866 ;4，927，762 ；或 4，560，655 ;W0 90/03430 ；W0 87/00195 ；U. S. Pat. No. Re. 30，985 ；或U. S. Pat. No. 5，122，469，通過(guò)述及將它們的公開內(nèi)容都收入本文。任何 這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、或表皮生 長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和 胸苷)、抗生素(諸如Gentamycin 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度 存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的適宜濃度包 含任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，諸如溫度、PH等，就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對(duì)于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明的肽可以單獨(dú)或以各種組合使用，作為任何商品化或定制的培養(yǎng)基的成 分。本文中的肽的用途不限于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物或一般性的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的肽還 可用于原核宿主生物體的細(xì)胞培養(yǎng)。例示性的原核宿主細(xì)胞包括但不限于真細(xì)菌，諸如革 蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例 如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠 傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草 芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公開 的DD266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌 294(ATCC 31，446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌8、大腸桿菌乂1776仏10 31，537)、和大腸 桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。下面的非限制性實(shí)施例提供了本發(fā)明的進(jìn)一步詳情。實(shí)施例使用組合文庫(kù)進(jìn)行的有生物學(xué)活性的、含C-端精氨酸的三肽的分子鑒定材料和方法TubeSpin生物測(cè)定法TubeSpin生物測(cè)定法設(shè)計(jì)用于在5毫升(mL)工作體積中使用1. 5X106個(gè)細(xì)胞/ mL的初始存活細(xì)胞密度檢驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞增殖和生產(chǎn)率(分別通過(guò)存活細(xì)胞 密度和所生成的抗體的濃度來(lái)測(cè)定)的影響。以7. 15mL的體積制備每份培養(yǎng)物，自此轉(zhuǎn)移5mL至測(cè)定管。測(cè)定管是帶專用帽的 50mL離心管，該專用帽裝有0.2微米孔徑的膜以便于氣體流動(dòng)。將剩余的2. 15mL用于測(cè)量 存活細(xì)胞密度(以證實(shí)已經(jīng)達(dá)到了靶密度和細(xì)胞是可存活的二者)、摩爾滲透壓濃度和代 謝數(shù)據(jù)(PH、谷氨酰胺、谷氨酸根、葡萄糖、乳酸根、銨、鈉、鉀)。根據(jù)期望培養(yǎng)基添加劑的起始濃度和摩爾滲透壓濃度，測(cè)定該添加劑的靶濃度。 自此數(shù)據(jù)計(jì)算需要的添加劑體積、在最終培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)生理學(xué)摩爾滲透壓濃度需要的氯化 鈉體積、和達(dá)到7. 15mL需要的水體積。使用這些值裝配培養(yǎng)基添加劑、氯化鈉、和水的制備 性溶液。然后通過(guò)交換培養(yǎng)基使選擇性Genentech必需培養(yǎng)基(GEM)中的細(xì)胞進(jìn)入稱作 GEM2的生產(chǎn)-品質(zhì)培養(yǎng)基。然后將GEM2中的細(xì)胞添加至每個(gè)制備管以在7. 15mL中達(dá)到規(guī) 定的1. 5X106個(gè)細(xì)胞/mL。然后每個(gè)測(cè)定管接受5mL并于37°C溫育4. 75天。在溫育期結(jié)束時(shí)，再次測(cè)量存活細(xì)胞密度、摩爾滲透壓濃度、和代謝狀況，并將測(cè) 定培養(yǎng)物樣品用于分開的抗體定量測(cè)定法以測(cè)定濃度。C18反相制備層析制備并立即使用pp3的20 % (w/v)水溶液。給5X5cm不銹鋼柱裝填 WatersPreparative C18硅土( 125A孔徑；55-105微米粒度)。該柱用10倍體積的含0. 02% (w/v)三氟乙酸(TFA)的水(緩沖液Α)預(yù)平衡，并以60ml/min的流速運(yùn)行。將200mL 上述PP3溶液加載到該柱上。使用受Unicorn軟件控制的Akta層析系統(tǒng)(GE Healthcare) 實(shí)現(xiàn)柱的溶劑控制和流出物監(jiān)測(cè)。加載后，用緩沖液A清洗柱，直至流出液在280nm的吸光 度達(dá)到基線。然后用含0.02% TFA的85% (ν/ν)乙腈(ACN)清洗所述柱以洗脫結(jié)合的材 料。使用生物測(cè)定法對(duì)各級(jí)分測(cè)定生物學(xué)活性。
G15 S印hadex制備層析來(lái)自C18的流出材料通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來(lái)濃縮，并在G-15 S印hadex柱(7cm直 徑X50cm長(zhǎng)度)上進(jìn)一步分級(jí)分離。加載前用去離子水平衡該柱，并加載整個(gè)C18流出收 集物。收集級(jí)分，并使用上文所述生物測(cè)定法測(cè)定活性。Hypercarb 分析層析使用Hypercarb (石墨)柱(5微米粒度；柱尺寸0. ImmX 50mm)分析活性級(jí)分的 樣品。所使用的緩沖液是緩沖液A 水性0. 02% TFA ；和緩沖液B 85% ACN+0. 02% TFA。將 各種體積(0-10微升)加載到用緩沖液A預(yù)平衡的柱上，并在25分鐘里用達(dá)到50%緩沖液 B的線性梯度洗脫。以0. lml/min的流速運(yùn)行該柱。用配備有二極管陣列檢測(cè)儀和MSD單 一四極質(zhì)譜儀WAgilentl 1OOHPLC實(shí)現(xiàn)溶劑控制。整個(gè)系統(tǒng)在Agilent Chemstation軟件 的控制下。質(zhì)譜術(shù)使用 Q-T0F(Waters Corporation)或 Orbitrap 質(zhì)譜儀(Thermofinnigan)實(shí)施 高分辨率質(zhì)譜術(shù)。以靜態(tài)噴射模式運(yùn)行該設(shè)備，在這兩種情況中都發(fā)現(xiàn)質(zhì)量精確度(mass accuracy)小余5ppm。使用圖譜來(lái)獲得精確的質(zhì)量信息，其用于與肽文庫(kù)信息關(guān)聯(lián)起來(lái)。生物信息學(xué)以必要的質(zhì)量精確度來(lái)構(gòu)建二肽和三肽的計(jì)算機(jī)文庫(kù)，與如上所述測(cè)定的質(zhì)量關(guān) 聯(lián)起來(lái)。肽合成使用Fmoc固相肽合成來(lái)創(chuàng)建三肽文庫(kù)。該文庫(kù)設(shè)計(jì)成含有所有可能的以精氨酸 (R)為末端的三肽，即XXR。MMPP3的分級(jí)圖1中圖示了用于PP3分級(jí)分離和分析的方案。C18 反相 HPLCPP3的初始分級(jí)是使用反相HPLC進(jìn)行的。圖2所示層析圖是代表性的PP3反相層 析圖譜。大部分質(zhì)量(初始干重的約70% )像大部分生物學(xué)活性一樣流出柱。將來(lái)自C18的流出級(jí)分濃縮并加載到G-15 S印hadex上進(jìn)行大小排阻層析，結(jié)果 如圖3所示。對(duì)來(lái)自G15柱的級(jí)分分析生物活性。G15純化的材料(級(jí)分F3-F7)的比活性相對(duì) 于PP3的比活性顯著升高，就其提高重組蛋白質(zhì)滴度(圖4A)和存活細(xì)胞計(jì)數(shù)(VCC ；圖4B) 的能力而言。對(duì)G15級(jí)分集合進(jìn)行質(zhì)譜術(shù)使用質(zhì)譜術(shù)分析活性級(jí)分以獲得關(guān)于活性成分的分子本質(zhì)的信息。圖5顯示了自如上所述獲得的G15收集物樣品獲得的代表性質(zhì)譜。該圖譜含有眾多質(zhì)量小余500Da的 峰。該圖譜的一項(xiàng)驚人特征為它們含有許多以重復(fù)方式存在的、質(zhì)量相差14個(gè)質(zhì)量單位的 峰的事實(shí)。而且，位于175. lm/z的峰(圖5)通過(guò)精確的質(zhì)量和后續(xù)的元素組成分析被鑒定 為精氨酸。另外，使用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)對(duì)來(lái)自圖5所示圖譜的三個(gè)質(zhì)量(403.2,389.2 和375. 2m/z ；以方框標(biāo)示)的分析揭示了小余200Da的質(zhì)量范圍中相似的斷裂樣式。這包 括自這三個(gè)質(zhì)量中的每一個(gè)鑒定出位于175. lm/z的完整精氨酸殘基。另外，基于精確的質(zhì) 量測(cè)量，這些分子被鑒定為具有下述可能身份的肽403. 2Da :EVR ；DIR ；DLR
389. 2Da :LTR ；ITR375. 2Da :SIR ；SLR ；TVR上述序列中頭2個(gè)氨基酸的次序也可以顛倒。由于氨基酸個(gè)體組合的交疊，在每 個(gè)質(zhì)量處存在數(shù)種可能性。含精氨酸的三肽的計(jì)算機(jī)文庫(kù)的創(chuàng)建在來(lái)自蛋白胨級(jí)分的質(zhì)譜中看到的14質(zhì)量單位重復(fù)結(jié)構(gòu)和C-端精氨酸在一組這 些分子中的存在提示酶促創(chuàng)建的肽“組合文庫(kù)”在源自動(dòng)物組織的PP3中的存在。為了進(jìn) 一步調(diào)查此想法，我們決定創(chuàng)建含C-端精氨酸的三肽的計(jì)算機(jī)文庫(kù)。該文庫(kù)含有400種可 能的肽，圖6所示的圖呈現(xiàn)了它的質(zhì)量組成和分布。該分布確實(shí)類似在以14Da間隔具有重 復(fù)峰的蛋白胨級(jí)分中看到的14質(zhì)量單位差異。真實(shí)XXR組合肽文庫(kù)的構(gòu)建和分析為了進(jìn)一步探索含C-端精氨酸的肽可能負(fù)責(zé)在PP3級(jí)分中看到的活性的一部分 的想法，我們使用固相(Fmoc)肽合成制備了這些分子的組合文庫(kù)。在去離子水中溶解含有 凍干肽的文庫(kù)，并用NaOH將該溶液的pH調(diào)節(jié)至約7. 0。然后使用G-15柱將該溶液脫鹽。 收集該文庫(kù)的級(jí)分，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來(lái)濃縮，并通過(guò)質(zhì)譜術(shù)和通過(guò)生物測(cè)定法來(lái)測(cè)定。質(zhì)譜分 析揭示了二肽和三肽二者的存在。認(rèn)為在混合物中找到的二肽源自一定比例的失敗的肽合 成反應(yīng)。質(zhì)譜術(shù)揭示了多個(gè)峰的存在，將它們與上文所述計(jì)算機(jī)文庫(kù)進(jìn)行比較。表1列出 了在此級(jí)分中找到的肽的質(zhì)量、身份和相對(duì)強(qiáng)度。命名基于精確的質(zhì)量測(cè)量結(jié)果，誤差小余 5ppm。此表呈現(xiàn)了此級(jí)分中存在的所有肽的部分列表。G-15 XXR級(jí)分的生物測(cè)定法對(duì)如上所述制備的XXR肽在生物測(cè)定法中測(cè)定活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和滴度都具 有顯著的積極效果。此實(shí)施例中所呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了 PP3含有分子量小余500Da的活性分子。這些分 子中的一些被鑒定為含C-端精氨酸的三肽。這些肽的組合文庫(kù)在6天生物測(cè)定法中顯示 出生物學(xué)活性。我們得出結(jié)論，含C-端精氨酸的三肽至少部分負(fù)責(zé)PP3的促進(jìn)生長(zhǎng)和提高 滴度的活性。本文中例示性描述的發(fā)明可以在本文中沒(méi)有具體公開的任何元素、限制缺失的情 況中適當(dāng)?shù)貙?shí)踐。如此，例如，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有”、等應(yīng)當(dāng)讀作可擴(kuò)展的和沒(méi)有限 制的。另外，本文中所采用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述而非限制的術(shù)語(yǔ)，而且在使用此類術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)沒(méi)有意圖排除所示發(fā)明或其部分的任何等同方案，但是認(rèn)識(shí)到在要求保護(hù)的發(fā)明范 圍內(nèi)各種修改是可能的、如此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案和任選的特征具體 公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地做出本文中所公開的具體化的發(fā)明的修改和 變化，而且此類修改和變化視為在本文中所公開的發(fā)明范圍內(nèi)。本文中已經(jīng)廣泛地和一般 性地描述了發(fā)明。每個(gè)落在上位公開內(nèi)的較窄上位和亞上位分組也構(gòu)成這些發(fā)明的一部 分。這把會(huì)容許自上位概念中消除任何主題的附帶條件或否定限制包括在每項(xiàng)發(fā)明的上位 描述內(nèi)，不管是否具體敘述了要消除的材料。另外，在以馬庫(kù)什組的方式描述發(fā)明的特征或 方面的情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也由此以馬庫(kù)什組各成員或成員亞組的方 式描述。本文中的方法中所描繪的和/或所使用的各步驟可以以與描繪的和/或規(guī)定的不 同的次序?qū)嵤?。各步驟僅僅是這些步驟可發(fā)生的次序的例示。各步驟可以以期望的任何次 序發(fā)生，只要使得它仍實(shí)現(xiàn)要求保護(hù)的發(fā)明的目的。
根據(jù)本文中對(duì)發(fā)明的描述，顯而易見的是可以使用各種等同實(shí)施方案來(lái)執(zhí)行本發(fā) 明的概念而不背離其范圍。此外，雖然已經(jīng)具體參照某些實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以在形式和細(xì)節(jié)上做出變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。所 描述的實(shí)施方案在所有方面視為例示性的而非限制性的。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文 中所描述的具體實(shí)施方案，而是能夠有許多等同的實(shí)施方案、重排、修改、和替代且不背離 本發(fā)明的范圍。如此，別的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)和在所附權(quán)利要求內(nèi)。通過(guò)述及將本文中提及的所有美國(guó)專利和申請(qǐng)、外國(guó)專利和申請(qǐng)、科學(xué)論文、書 籍、和出版物完整收入本文，就像明確和單獨(dú)地指出通過(guò)述及而完整收錄每一篇具體的專 利或申請(qǐng)，包括任何附圖、圖和表，就像完整列出一樣。表1:來(lái)自XXR的肽鑒定
權(quán)利要求
式(X1)nX2R的肽，其中X1和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸；n為0或1；且R代表精氨酸，其中所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。
2.權(quán)利要求1的肽，其是通過(guò)對(duì)蛋白胨分級(jí)獲得的。
3.權(quán)利要求2的肽，其中所述蛋白胨是ΡΡ3。
4.權(quán)利要求1的肽，其選自表1中所列出的肽。
5.權(quán)利要求1的肽，其是三肽。
6.權(quán)利要求5的肽，其中所述三肽選自表1中所列出的肽。
7.權(quán)利要求1的肽，其中所述生物學(xué)活性選自下組促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；提高細(xì)胞密度；提 高存活細(xì)胞計(jì)數(shù)；和提高重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)產(chǎn)率。
8.一種組合物，其包含權(quán)利要求1的肽。
9.權(quán)利要求8的組合物，其是細(xì)胞培養(yǎng)基。
10.一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求1的肽。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞培養(yǎng)物，其是重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述重組宿主細(xì)胞生成異源蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述重組蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段。
16.權(quán)利要求1的兩種或更多種肽的混合物。
17.—種組合肽文庫(kù)，其包含式(Xl)nX2R的肽，其中Xl和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸； η為0或1 ；且 R代表精氨酸，其中至少一些所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。
18.權(quán)利要求17的組合肽文庫(kù)，其基本上由式(Xl)nX2R的肽組成， 其中Xl和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸； η為0或1 ；且R代表精氨酸，其中至少一些所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。
19.權(quán)利要求17的組合肽文庫(kù)，其由式(Xl)nX2R的肽組成，其中Xl和X2可以相同或不同，且獨(dú)立代表精氨酸以外的任何氨基酸； η為0或1 ；且 R代表精氨酸，其中至少一些所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學(xué)活性。
20.一種用于重組生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括在適合于所述異源蛋白質(zhì)表達(dá)的條件 下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的重組宿主細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包含至少 一種權(quán)利要求1的肽。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述異源蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注來(lái)自蛋白胨的活性肽片段的分離、鑒定和表征。
文檔編號(hào)C07K5/06GK101848925SQ200880114757
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者蒂姆·布里斯, 詹姆斯·威爾金斯, 馬薩魯·K·希拉托里 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司