鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒及檢測方法，屬于動物醫(yī)學(xué)動物疫病分子生物學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒，該試劑盒由一擴(kuò)反應(yīng)混合液、二擴(kuò)反應(yīng)混合液、陰性對照和陽性對照組成。本發(fā)明將采用套式PCR擴(kuò)增，且目的片段較小，保證了反應(yīng)的高靈敏度。檢測總時間控制在4小時左右，達(dá)到了快速檢測的目的。本發(fā)明能徹底解決偽狂犬流行毒株和gE基因缺失疫苗毒株鑒別診斷問題，快速、靈敏，特異性好，非常適合偽狂犬疫情的大面積快速檢測普查，適用于各實(shí)驗(yàn)室、動物疫病預(yù)防控制中心以及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。
【專利說明】鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)診斷試劑盒及檢測方法，屬于動物醫(yī)學(xué)動物疫病分子生物學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病（Pseudorabies，PR)又名奧葉茲基氏病、豬皰疹病毒I型等，是由疽疹 病毒科（Herpesvirdae), α-疫病毒亞科（Alpherpesvirinae)中的偽狂犬病毒（PRV)引 起的一種或多種動物感染的急性傳染病，迄今仍是我國主要的豬群傳染病之一。偽狂犬病 毒可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎；新生仔豬衰竭死亡，死亡率可達(dá)100%;成年豬多 呈隱性感染，長期帶毒排毒，成為該病的主要傳染源，由于缺乏臨床癥狀，帶毒豬很容易被 忽視，造成豬場偽狂犬病毒長期存在，危害巨大。自1902年匈牙利首次發(fā)現(xiàn)該病以來，該病 在世界各地已廣泛流行。在我國，自1984年劉永純首次報(bào)道此病后，迄今為止已有20多個 省份相繼發(fā)生該病，給我國的養(yǎng)豬業(yè)特別是集約化養(yǎng)豬造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于偽狂犬 的重要性，我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物疫病。
[0003] 疫苗免疫接種則是防制乃至根除該病的主要手段之一。自20世紀(jì)70年代以來，人 工篩選的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的廣泛應(yīng)用，對防制偽狂犬病做出重要貢獻(xiàn)。 在我國廣泛使用的Barth-k61株弱毒疫苗，其基因中有包括整個gE和大部分gl基因序列 缺失。基因缺失疫苗在減少偽狂犬病感染的機(jī)會、減輕感染后的癥狀、減少散毒量等方面較 弱毒苗和滅活苗都有了很大的改進(jìn)，因而基因缺失疫苗成了目前預(yù)防控制偽狂犬病的主要 手段，西方許多國家的根除偽狂犬病的計(jì)劃都依賴基因缺失疫苗進(jìn)行免疫接種而制定。
[0004] 我國使用的診斷豬偽狂犬的血清學(xué)方法有病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)（SN)、瓊 脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、乳膠凝集試驗(yàn)（LA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)和免疫熒光技術(shù)（IF)， 分子生物學(xué)方法有PCR技術(shù)和核酸雜交技術(shù)。病毒分離鑒定是診斷偽狂犬最可靠的辦法之 一，但最大的缺點(diǎn)是耗時長，敏感性低。血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)等優(yōu) 點(diǎn)是特異性好，缺點(diǎn)是靈敏性較低。ELISA可區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，且靈敏度 高，目前應(yīng)用廣泛。但ELISA檢測豬群呈野毒抗體陽性并不代表豬群目前就感染偽狂犬野 毒，因?yàn)橐岸究贵w陽性也可能是豬群曾經(jīng)感染野毒引起。因此，在偽狂犬野毒的定性診斷上 尚需要依賴病原的檢測。
[0005] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCR技術(shù)以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在動 物疫病診斷中得到了廣泛應(yīng)用。Belak等針對gB基因設(shè)計(jì)引物，最早使用PCR的方法檢測 偽狂犬病毒。Jestin等從鼻拭子抽提核酸，通過擴(kuò)增PRV的gD基因序列檢測出偽狂犬病 毒。Talmage T B等應(yīng)用gB基因引物對活檢的扁桃體細(xì)胞和實(shí)質(zhì)組織進(jìn)行擴(kuò)增，能應(yīng)用于 潛伏感染的檢查。國內(nèi)婁高明、范偉興等也分別建立了檢測PRV的PCR方法，可用于偽狂犬 病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。由于我國多年一直采用疫苗預(yù)防為主的防控策略，豬群疫苗免 疫覆蓋率高，導(dǎo)致疫苗毒株在豬群中廣泛存在。常規(guī)PCR技術(shù)不能區(qū)分疫苗毒和偽狂犬野 毒，在診斷結(jié)果的判定上存在困難。
[0006] 國內(nèi)有學(xué)者嘗試建立相關(guān)的鑒別診斷方法，如劉麗娜等建立了多重PCR鑒別豬偽 狂犬病野毒與疫苗毒診斷方法，可以檢測到106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒 的核酸模板量。但是，作者也意識到，多重PCR方法對病料模板的純度和含量要求高于單一 的PCR方法，所以若要將其應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，還需進(jìn)一步研究，且作者并沒有將方法應(yīng)用于 檢測臨床病理組織材料，不能確定其在臨床應(yīng)用中的表現(xiàn)。藺芳等也建立了多重PCR方法， 設(shè)計(jì)了 3對引物對四種偽狂犬疫苗樣品DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，其中1種疫苗得到與設(shè)計(jì) 相符的1條特異性條帶，其余為2條。但其最大的缺陷仍是僅限于純培養(yǎng)的細(xì)胞毒，沒有進(jìn) 行臨床樣本的直接檢測試驗(yàn)，所以其方法能否應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際，不需細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分 離純化而直接檢測組織或血清等材料，尚無定論。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明旨在提出一種操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高、特異性好 的鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒。
[0008] 實(shí)現(xiàn)該發(fā)明目的的技術(shù)方案如下：鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù) 合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒，該試劑盒由一擴(kuò)反應(yīng)混合液、二擴(kuò)反應(yīng)混合液、陰性對 照和陽性對照組成； 所述一擴(kuò)反應(yīng)混合液由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比為7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管； 所述二擴(kuò)反應(yīng)混合液由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m πιοΙ.Ι/ΜΝΤΡ^δ μπιο?·!/1 PRgD-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-2R 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2R下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比為7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管； 所述陰性對照為ΡΚ-15正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液； 所述陽性對照為gE基因缺失疫苗株Batha_k61細(xì)胞培養(yǎng)液； 其中，所述的引物 PRgD-lF 序列為：5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' 所述的引物 PRgD-lR 序列為：5' - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3' 所述的引物 PRgE-lF 序列為：5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' 所述的引物 PRgE-lR 序列為：5' - CGACAGCAGCCAGACGC -3' 所述的引物 PRgD_2F 序列為：5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' 所述的引物 PRgD_2F 序列為：5' - GTCCACGCGCGCCTTGA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列為：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列為：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列為：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列為：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3'。
[0009] 本發(fā)明的另一個發(fā)明目的：提供一種鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株 復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒的檢驗(yàn)方法，包括下列步驟： 1) DNAzol Reagent試劑法提取待檢樣品DNA，空氣中自然干燥，用40 μ L 8mmol · L WaOH 溶解； 2) 取一擴(kuò)混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，均勻混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C，預(yù)變性5 min，94 °C 60 s，62°C 60 s，72 °C 60 s共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸 10 min ； 3) 取二擴(kuò)混合液23 μ L，加入二擴(kuò)產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C 預(yù)變性5 min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸10 min ； 4) 10 g·!/1瓊脂糖凝膠中電泳； 5) 結(jié)果分析：陰性對照不出條帶，陽性對照出217bp -個條帶，說明對照成立；樣品中 出現(xiàn)217bp -個條帶，即為gE基因缺失疫苗毒株；樣品出現(xiàn)217bp、354bp兩個條帶，即為偽 狂犬流行毒株感染。
[0010] 試劑盒的驗(yàn)證性試驗(yàn)： ①特異性試驗(yàn) 使用本發(fā)明的診斷試劑盒，按照DNAzol Reagent試劑說明提取Batha-k61偽狂犬基因 缺失疫苗、偽狂犬野毒SXHX13株、PCV-2、PPV等DNA病毒的DNA作為模板，用試劑盒的一擴(kuò) 混合液和二擴(kuò)混合液進(jìn)行復(fù)合套式PCR，擴(kuò)增完畢后電泳觀察。按照TRIzol Reagent試劑 說明提取豬瘟兔化弱毒活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗和豬流行性腹瀉病毒SXJY12 株總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，用本發(fā)明的診斷試劑盒一擴(kuò)混合液和二擴(kuò)混合液進(jìn)行 復(fù)合套式PCR，擴(kuò)增完畢后電泳觀察。
[0011] 結(jié)果顯示，Batha-k61偽狂犬基因缺失疫苗株出現(xiàn)217bp -個條帶；偽狂犬野毒 SXHX13株出現(xiàn)217bp、354bp兩個條帶；PCV-2、PPV、豬瘟兔化弱毒活疫苗、豬繁殖與呼吸綜 合征弱毒疫苗和豬流行性腹瀉病毒SXJY12株均沒有出現(xiàn)條帶(見附圖1)。
[0012] 回收各陽性樣本的條帶，純化后連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，取PCR 鑒定為陽性得菌液，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測得的序列與所用毒株基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn) 序列完全一致。結(jié)果證實(shí)本試劑盒及檢測方法具有很高的特異性，能準(zhǔn)確擴(kuò)增PRV基因片 段，并能直觀區(qū)分gE基因缺失疫苗株和流行毒株。
[0013] ②靈敏度試驗(yàn) 使用本發(fā)明提供的診斷試劑盒，提取偽狂犬野毒SXHX13株DNA，紫外分光光度計(jì)測定 濃度為278pg · Γ1，按照10倍濃度梯度稀釋至ΚΓ9,用試劑盒提供的一擴(kuò)混合液和二擴(kuò)混 合液進(jìn)行套式復(fù)合PCR，擴(kuò)增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒能檢測的極限為 2. 78Xl(T4pg · ΙΛ提示本方法靈敏度高(見附圖2)。
[0014] ③穩(wěn)定性試驗(yàn) 本發(fā)明提供的診斷試劑盒保存條件為-20°C，每月1次用Batha-k61偽狂犬基因缺失 疫苗、偽狂犬野毒SXHX13株及對照進(jìn)行檢測試驗(yàn)，連續(xù)檢測6個月，檢測試劑盒存放的穩(wěn)定 性。結(jié)果顯示，6個月內(nèi)試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明試劑盒有良好的穩(wěn)定性。
[0015] ④田間試驗(yàn) 采集了陜西省臨床疑似偽狂犬組織病料和血清共65份，用本發(fā)明的試劑盒及檢測方 法進(jìn)行診斷，同時以單純檢測gD基因的PCR方法進(jìn)行平行檢測試驗(yàn)。結(jié)果本發(fā)明的檢出陽 性率為64. 6% (42/65)，單純檢測gD基因的PCR方法檢出陽性率為66. 2% (43/65)，兩種方 法符合率97. 6% (42/43)，提示兩種方法符合率高(見附圖3)。
[0016] 本發(fā)明將采用套式PCR擴(kuò)增，且目的片段較小，保證了反應(yīng)的高靈敏度。檢測總時 間控制在4小時左右，達(dá)到了快速檢測的目的。本發(fā)明能徹底解決偽狂犬流行毒株和gE基 因缺失疫苗毒株鑒別診斷問題，快速、靈敏，特異性好，非常適合偽狂犬疫情的大面積快速 檢測普查，適用于各實(shí)驗(yàn)室、動物疫病預(yù)防控制中心以及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明試劑盒及方法特異性試驗(yàn)電泳圖； 圖中Μ為DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為Batha-k61偽狂犬基因缺失疫苗株，2為偽狂 犬野毒SXHX13株，3為PCV-2毒株，4為PPV毒株，5為豬癌兔化弱毒活疫苗毒株，6為豬繁 殖與呼吸綜合征弱毒疫苗毒株，7為豬流行性腹瀉病毒SXJY12毒株。
[0018] 圖2為本發(fā)明試劑盒及方法靈敏度試驗(yàn)電泳圖； 圖中Μ為DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1-9為偽狂犬野毒SXHX13株DNA梯度稀釋，濃度 范圍為 278X10^^ · Γ1 ?278Xl(T9pg · L'
[0019] 圖3為本發(fā)明試劑盒對部分臨床樣品檢測結(jié)果； 圖中Μ為DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1-7為部分組織病料檢測結(jié)果，其中3、6為疫苗毒 陽性結(jié)果；1、2、4、5、7為偽狂犬野毒陽性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1 1、引物的設(shè)計(jì)與制備 參考GenBank上公布的PRV全基因組序列，結(jié)合本課題組數(shù)年研究測定的PRV基因序 列，用DNAStar生物軟件綜合分析比對，針對gD、gE基因設(shè)計(jì)了 8條引物PRgD-lF、PRgD-lR、 PRgE-lF、PRgE-lF、PRgD-2F、PRgD-2R、PRgE-2F 和 PRgE-2F，引物的序列如下： PRgD-lF :5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' PRgD-lR:5, - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3， PRgE-lF :5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' PRgE-lR:5, - CGACAGCAGCCAGACGC -3， PRgD-2F :5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' PRgD-2F :5, - GTCCACGCGCGCCTTGA -3， PRgE-2F :5, - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3， PRgE-2R:5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 上述引物由生工生物工程(上海）股份有限公司合成。
[0021] 2、陰、陽性對照的制備 陰性對照為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的正常PK-15細(xì)胞上清液，陽性對照為gE基因缺失疫苗株 Batha_k61細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0022] 3、試劑盒的制備 本試劑盒由以下組分組成： ①一擴(kuò)反應(yīng)混合液：由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比為7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管。
[0023] ②二擴(kuò)反應(yīng)混合液：由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · ΓΜΝΤΡ、25 μ mol · Γ1 PRgD-2F 上游弓丨物、25 μ mol · Γ1 PRgD_2R 下游弓丨物、25 μ mol · Γ1 PRgE_2F 上 游引物、25 ymol.I^PRgEIR下游引物、5U/yL rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比 為 7 :12· 5 :1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管。
[0024] ③陰性對照：為正常ΡΚ-15細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每個反應(yīng)需對照250 μ L，50個反應(yīng)共 計(jì)12500 μ L，分裝10管，每管1250 μ L。
[0025] ④陽性對照：為gE基因缺失疫苗Batha_k61株ΡΚ-15細(xì)胞培養(yǎng)液，每個反應(yīng)需對 照250 μ L，50個反應(yīng)共計(jì)12500 μ L，分裝10管，每管1250 μ L。
[0026] 本發(fā)明試劑盒保存條件為_20°C。
[0027] 實(shí)施例2 1、引物的設(shè)計(jì)與制備 同實(shí)施例1。
[0028] 2、組織病料樣品的處理與DNA提取 ①取疑似豬偽狂犬病的組織病料如扁桃體、腦或肺臟:T5g，剪碎成糊狀，加 5倍無菌 PBS，用組織研磨器充分研磨，收集懸液，4 °C、12000 r/min離心15min，取上清液100 μ L加 入到無菌ΕΡ管，同時做試劑盒中提供的陰、陽性對照，給以上各管中加入1000yL DNAzol Reagent,顛倒混勻后于4°C靜置5 min。
[0029] ②4°C、12000 r/min離心10min，上清液600 μ L轉(zhuǎn)移至另一潔凈EP管中，加入 500 μ L無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置5min。
[0030] ③4°C、12 000 r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，加入1 mL 75%乙醇沉 淀，4°C、12000 r/min離心2min，反復(fù)洗漆2次。
[0031] ④最后棄去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 3、用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測PRV。
[0033] ①吸取一擴(kuò)混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條 件為95 1：預(yù)變性51^11，941：，60;621：，6〇8;721：6〇8共進(jìn)行35個循環(huán)，最后721：延伸 10min〇
[0034] ②吸取二擴(kuò)混合液23 μ L，加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 為 95 °C 預(yù)變性 5min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s 共進(jìn)行 35 個循環(huán)，最后 72 °C 延伸lOmin ;即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0035] 實(shí)施例3 1、引物的設(shè)計(jì)與制備 同實(shí)施例1。
[0036] 2、血清樣品的處理與DNA提取 ①取分離得到待檢豬血清1〇〇 μ L加入到無菌的EP管，同時做試劑盒中提供的陰、陽性 對照，給以上各管中加入1000 μ L DNAzol Reagent,顛倒混勻后于4°C靜置5 min。
[0037] ②4°C、12000 r/min離心lOmin，上清液600yL轉(zhuǎn)移至另一潔凈EP管中，加入 500 μ L無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置5min。
[0038] ③4°C、12000 r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，加入1 mL 75%乙醇沉淀， 4°C、12000 r/min離心2min，反復(fù)洗漆2次。
[0039] ④最后棄去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 3、用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測PRV ①吸取一擴(kuò)混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性 5min，94°C，60s ;62°C，60s ;72°C ;60s 共進(jìn)行 35 個循環(huán)，最后 72 °C延伸 10 min。
[0041] ②吸取二擴(kuò)混合液23 μ L，加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 為95 °C預(yù)變性5min，94 °C 60s，65 °C 60s，72 °C 60s共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸 10 min ;即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0042] 實(shí)施例4 1、引物的設(shè)計(jì)與制備 同實(shí)施例1。
[0043] 2、全血樣品的處理與DNA提取 ①取待檢豬全血100 μ L加入到無菌無 RNA酶的EP管，同時做試劑盒中提供的陰、陽性 對照，給以上各管中加入1〇〇〇1^1^0嫩2〇11^386111:，顛倒混勻后于41€靜置5111；[11。
[0044] ②4°C、12000 r/min離心lOmin，上清液600 μ L轉(zhuǎn)移至另一潔凈ΕΡ管中，加入 500 μ L無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置5min。
[0045] ③4°C、12 000 r/min離心5min，取出EP管，棄去上清液，加入lmL 75%乙醇沉淀， 4°C、12000 r/min離心2min，反復(fù)洗漆2次。
[0046] ④最后棄去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0047] 3、用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測PRV ① 吸取一擴(kuò)混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性 5min，94 °C，60s;62°C，60s，72°C 60s 共進(jìn)行 35 個循環(huán)，最后 72 °C延伸 lOmin; ② 吸取二擴(kuò)混合液23 μ L，加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性 5 min，94 °C，60 s;65 °C，60 s;72 °C，60 s 共進(jìn)行 35 個循環(huán)，最后 72 °C延 伸10min ;即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0048] 結(jié)果判定 1、 稱取l.Og瓊脂糖，加入100mL 1XTAE緩沖液中，微波爐中加熱融化，加入5yL (100mg/mL)溴化乙錠均勻混合，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5mm，待冷卻凝固后 拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1XTAE緩沖液淹沒膠面； 2、 分別取5 μ L上述實(shí)施例2~4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液均勻混合，加入加樣孔 中，同時加5 μ L DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 3、 電壓80 V?100V，或電流40 mA?50mA，電泳30min; 4、 取出凝膠，置入紫外分析儀中觀察，或置入凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相； 5、以DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為參照，陰性對照不出條帶，陽性對照出217bp -個 條帶，說明對照成立；樣品中出現(xiàn)217bp、354bp兩個條帶，即為偽狂犬野毒株感染；樣品出 217bp -個條帶，即為gE基因缺失疫苗毒株。
【權(quán)利要求】
1. 鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒， 其特征在于，該試劑盒由一擴(kuò)反應(yīng)混合液、二擴(kuò)反應(yīng)混合液、陰性對照和陽性對照組成； 所述一擴(kuò)反應(yīng)混合液由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比為7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管； 所述二擴(kuò)反應(yīng)混合液由滅菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol.I/MNTPJS μπιο?·!/1 PRgD-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-2R 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2R下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶組成，每個反應(yīng)體積比為7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共計(jì) 23 μ L，50 個反應(yīng)共計(jì) 1150μ L，裝成 1 管； 所述陰性對照為ΡΚ-15正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液； 所述陽性對照為gE基因缺失疫苗株Batha_k61細(xì)胞培養(yǎng)液； 其中，所述的引物 PRgD-lF 序列為：5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' 所述的引物 PRgD-lR 序列為：5' - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3' 所述的引物 PRgE-lF 序列為：5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' 所述的引物 PRgE-lR 序列為：5' - CGACAGCAGCCAGACGC -3' 所述的引物 PRgD_2F 序列為：5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' 所述的引物 PRgD_2F 序列為：5' - GTCCACGCGCGCCTTGA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列為：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列為：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列為：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列為：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3'。
2. 如權(quán)利要求1所述鑒別偽狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)診斷試劑盒的檢驗(yàn)方法，其特征在于：包括下列步驟 ： 1. DNAzol Reagent試劑法提取待檢樣品DNA，空氣中自然干燥，用40 μ L 8mmol · L WaOH 溶解； 2) 取一擴(kuò)混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，均勻混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C，預(yù)變性5 min，94 °C 60 s，62°C 60 s，72 °C 60 s共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸 10 min ; 3) 取二擴(kuò)混合液23 μ L，加入二擴(kuò)產(chǎn)物2 μ L，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 °C 預(yù)變性5 min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸10 min ； 4) 10 g 瓊脂糖凝膠中電泳； 5) 結(jié)果分析：陰性對照不出條帶，陽性對照出217bp -個條帶，說明對照成立；樣品中 出現(xiàn)217bp -個條帶，即為gE基因缺失疫苗毒株；樣品出現(xiàn)217bp、354bp兩個條帶，即為偽 狂犬流行毒株感染。
【文檔編號】C12Q1/70GK104152586SQ201410404463
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】吳旭錦, 朱小甫 申請人:咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院