偽狂犬病毒、偽狂犬病疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了狂犬病毒、偽狂犬病疫苗及其制備方法。其中，偽狂犬病毒以保藏號CGMCC?No.8057保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該偽狂犬病毒具有較強的毒力，免疫原性好，毒價較高，利用該偽狂犬病毒生產(chǎn)的疫苗安全性好，免疫保護(hù)期長。
【專利說明】偽狂犬病毒、偽狂犬病疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及偽狂犬病毒和偽狂犬病疫苗及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]偽狂犬病(PorcinePseudorabies)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的發(fā)生在多種家畜和野生動物體內(nèi)的一種急性傳染病，以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要發(fā)病癥狀。偽狂犬病最早在1813年發(fā)生于英國的牛群中。Aujeszky、Schmiedhoffer和Sangirg相繼發(fā)現(xiàn)并分離出PRV。成年豬常表現(xiàn)為隱性感染，妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)、死胎以及呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，無奇癢。新生仔豬感染后除了出現(xiàn)神經(jīng)癥狀外，還可侵害消化系統(tǒng)。本病呈世界性分布。豬既是本病原的原發(fā)感染宿主，又是病毒的長期貯存者和排毒者，在偽狂犬病的傳播上起著重要作用。偽狂犬病給豬養(yǎng)殖業(yè)造成的危害僅次于豬瘟。
[0003]20世紀(jì)60年代以后，據(jù)報道，由于強毒株的出現(xiàn)，該病現(xiàn)已遍及歐洲、東南亞、南美洲、中美洲及非洲等50多個國家和地區(qū)，僅芬蘭、挪威等少數(shù)國家仍無偽狂犬病的報道。我國周邊一些國家如泰國、韓國、日本、菲律賓、老撾、馬來西亞、新加坡、越南等均有偽狂犬病的流行。偽狂犬病的傳播和蔓延，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，全世界每年因偽狂犬病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元，因此該病引起了世界各國的高度重視。
[0004]到目前為止，已有北京、河南、上海、廣東、廣西、江蘇、江西、福建、浙江、安徽、四川、陜西、甘肅、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、臺灣等20多個省(市)、自治區(qū)和香港特區(qū)報道發(fā)現(xiàn)了該病。PR在中國主要為地方性流行，特別對種豬場和集約化豬場危害嚴(yán)重，目前該病在我國的流行仍在不斷地蔓延擴(kuò)大，已經(jīng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，成為影響我國畜牧業(yè)特別是豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制約因素。
[0005]鑒于上述，生產(chǎn)一種安全性及免疫原性好，且免疫保護(hù)期長的偽狂犬病疫苗是預(yù)防和控制偽狂犬病的一種行之有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的目的在于提出一種偽狂犬病毒和偽狂犬病疫苗及其制備方法。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種偽狂犬病毒，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病毒以保藏編號CGMCC N0.8057保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述的偽狂犬病毒是從經(jīng)過正常免疫的患有豬偽狂犬病的病豬體內(nèi)篩選分離得到，其毒價TCID5tl為107 5/ml，因此，所述的偽狂犬病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗毒種。
[0008]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)提出了上述偽狂犬病毒在制備偽狂犬病疫苗中的用途，在本發(fā)明一個實施例中，根據(jù)偽狂犬病毒交叉免疫保護(hù)試驗證明，所述的偽狂犬病毒具有很好的交叉免疫保護(hù)作用。因此利用該偽狂犬病毒生產(chǎn)偽狂犬病疫苗，可以有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。[0009]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種偽狂犬病疫苗，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病疫苗包括滅活的偽狂犬病毒以及佐劑。從而有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的上述實施例的偽狂犬病疫苗還包括如下附加技術(shù)特征:
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述的偽狂犬病疫苗是通過β-丙內(nèi)酯滅活的，由此可以有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，同時可以進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述的偽狂犬病疫苗所采用的佐劑為MARC0L52。從而有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0013]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，在所述的偽狂犬病疫苗中，所述偽狂犬病毒與所述佐劑的比例為(2:3)~(2:4)，由此可以提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，同時可以進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0014]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種制備偽狂犬病疫苗的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括對所述的偽狂犬病毒進(jìn)行滅活，以便獲得經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒；以及將所述經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合，以便獲得所述偽狂犬病疫苗。由此，可以有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明上述實施例的制備偽狂犬病疫苗的方法還包括如下附加技術(shù)特征:
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在對所述偽狂犬病毒進(jìn)行滅活之前，包括按照下列步驟獲得偽狂犬病毒培養(yǎng)液:將所 述偽狂犬病毒接種于形成有ST細(xì)胞層的培養(yǎng)容器中，并在35.5~37.5攝氏度下進(jìn)行培養(yǎng)，收集所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物；將所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行凍融裂解，以便獲得裂解混合物；分離所述裂解混合物的上清液，以便獲得所述偽狂犬病毒培養(yǎng)液。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述的ST細(xì)胞指的是豬睪丸細(xì)胞。所述的ST細(xì)胞層是在濃度為5%~10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得。由此，有效的提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0017]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，對所述偽狂犬病毒進(jìn)行滅活包括:在4攝氏度下，利用終濃度為1:3000的β -丙內(nèi)酯對偽狂犬病毒培養(yǎng)液進(jìn)行滅活處理24小時；以及在37攝氏度下，使所述丙內(nèi)酯發(fā)生水解，以便獲得含有滅活偽狂犬病毒的溶液。由此，提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0018]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，將所述經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合包括:將含有滅活偽狂犬病毒的溶液與MARC0L52白油佐劑按照體積比為2:3進(jìn)行混合乳化，以便獲得所述偽狂犬病疫苗。由此，提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0019]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人分離了一株偽狂犬病毒，該病毒在經(jīng)過滅活后可以用作制備豬偽狂犬病疫苗，用于防止豬感染偽狂犬病。
[0021]在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種偽狂犬病毒，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病毒以保藏編號CGMCC N0.8057保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，偽狂犬病毒是從經(jīng)過正常免疫的患有豬偽狂犬病的病豬體內(nèi)篩選分離得到，其毒價TCID5tl為107_ 5/ml，因此，分離得到的偽狂犬病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗毒種，根據(jù)本發(fā)明一個實施例，偽狂犬病毒交叉免疫保護(hù)試驗證明，該偽狂犬病毒具有很好的交叉免疫保護(hù)作用。因此可以利用該偽狂犬病毒生產(chǎn)偽狂犬病疫苗，有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)提出了上述偽狂犬病毒在制備偽狂犬病疫苗中的用途，在本發(fā)明一個實施例中，根據(jù)偽狂犬病毒交叉免疫保護(hù)試驗證明，所述的偽狂犬病毒具有很好的交叉免疫保護(hù)作用。因此利用該偽狂犬病毒生產(chǎn)偽狂犬病疫苗，可以有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0023]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種偽狂犬病疫苗，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病疫苗包括滅活的偽狂犬病毒以及佐劑。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病疫苗的免疫持續(xù)期至少可以維持6個月，從而有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該偽狂犬病疫苗可在2攝氏度-8攝氏度下保存12個月，從而有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，可以采用的滅活劑種類并不受特別限制，只要可以有效破壞偽狂犬病毒的核酸結(jié)構(gòu)即可，但不破壞偽狂犬病毒的免疫原結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明一個實施例，所采用的滅活劑為丙內(nèi)酯，丙內(nèi)酯可以有效破壞偽狂犬病毒的DNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到滅活偽狂犬病毒的目的。但丙內(nèi)酯并不破壞偽狂犬病毒的衣殼蛋白，進(jìn)而保護(hù)了偽狂犬病毒的免疫原性。由此，進(jìn)一步提高了偽狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保護(hù)期。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所采用的滅活劑丙內(nèi)酯終濃度并不受特別限制，只要能夠有效滅活偽狂犬病毒即可。根據(jù)本發(fā)明一個實施例，所采用的丙內(nèi)酯的終濃度為1:3000。由此，有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保護(hù)期。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，偽狂犬病疫苗所采用的佐劑為MARC0L52。從而有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。根據(jù)本發(fā)明實施，所采用的佐劑的種類并不受特別限制，只要可以有效增強偽狂犬病毒抗原表面面積，并能延長偽狂犬病毒抗原在體內(nèi)保留時間，使偽狂犬病毒抗原與淋巴系統(tǒng)細(xì)胞有充分接觸時間，從而保證接種偽狂犬病疫苗后，可以產(chǎn)生充足的抗體，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受偽狂犬病毒的傷害。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，采用MARC0L52白油佐劑效果優(yōu)于其他佐劑。由此，提高制備偽狂犬病疫苗的安全性、免疫原性及免疫保護(hù)期。
[0027]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，在所述的偽狂犬病疫苗中，所述偽狂犬病毒與所述佐劑的比例為(2:3)~(2:4)，從而提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0028] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備偽狂犬病疫苗的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括對偽狂犬病毒進(jìn)行滅活，以便獲得經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒；以及將經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合，以便獲得偽狂犬病疫苗。由此，有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在對偽狂犬病毒進(jìn)行滅活之前，包括按照下列步驟獲得偽狂犬病毒培養(yǎng)液:將偽狂犬病毒接種于形成有ST細(xì)胞層的培養(yǎng)容器中，并在35.5~37.5攝氏度下進(jìn)行培養(yǎng)，收集所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物；將細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行凍融裂解，以便獲得裂解混合物；分離裂解混合物的上清液，以便獲得偽狂犬病毒培養(yǎng)液。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，ST細(xì)胞指的是豬睪丸細(xì)胞。ST細(xì)胞層是在濃度為5%~10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得。由此，有效的提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。根據(jù)本發(fā)明一個實施例，在偽狂犬病毒接種于ST細(xì)胞單層之前，先將偽狂犬病毒稀釋至濃度為0.3%，接種后，在35.5~37.5攝氏度下進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘，使得偽狂犬病毒充分吸附于ST細(xì)胞。從而有利于得到毒價高的偽狂病毒培養(yǎng)液，進(jìn)而提高制備偽狂犬病疫苗的安全性及免疫保護(hù)期。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，對所述偽狂犬病毒進(jìn)行滅活的條件并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，可以在4攝氏度下，利用終濃度為1:3000的β-丙內(nèi)酯對偽狂犬病毒培養(yǎng)液進(jìn)行滅活處理24小時；以及在37攝氏度下，使所述β -丙內(nèi)酯發(fā)生水解，以便獲得含有滅活偽狂犬病毒的溶液。由此，提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，當(dāng)有75%~80%的ST細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時，收集所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞病變指的是ST細(xì)胞單層出現(xiàn)空洞，細(xì)胞變圓、聚集、溶解和脫落。從而有利于得到毒價高的偽狂犬病毒培養(yǎng)液，進(jìn)而獲得優(yōu)異性能的偽狂犬病疫苗。根據(jù)本發(fā)明一個實施例，所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過凍融，以便得到細(xì)胞毒液。根據(jù)本發(fā)明的實施例，凍融次數(shù)并不受特別限制，只要可以將ST細(xì)胞充分裂解即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，分離裂解混合物的上清液的方式并不受特別限制，只要可以有效將含有偽狂犬病毒的細(xì)胞毒液與細(xì)胞殘余碎片物分離即可。 用連續(xù)流離心的方式分離裂解混合物，從而有利于得到毒價高的偽狂犬病毒培養(yǎng)液，從而進(jìn)一步提高所獲得的偽狂犬病疫苗的免疫原性，及安全性。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所采用的滅活劑丙內(nèi)酯終濃度并不受特別限制，只要可以有效滅活偽狂犬病毒即可。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所采用的丙內(nèi)酯的終濃度為1:3000。由此可以有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保護(hù)期。根據(jù)本發(fā)明的實施例，滅活劑滅活的時間及溫度并不受特別限制，只要可以有效破壞偽狂犬病毒的核酸結(jié)構(gòu)即可。根據(jù)本發(fā)明具體實施例，在4攝氏度下滅活偽狂犬病毒的培養(yǎng)液24小時，以便得到充分滅活的偽狂犬病毒的培養(yǎng)液。由此，有效提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保護(hù)期。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒的培養(yǎng)液置于37攝氏度水浴中，使β_丙內(nèi)酯水解，從而有效提高偽狂犬疫苗的安全性。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，在水浴中水解的時間并不受特別限制，只要可以使得偽狂犬病毒的培養(yǎng)中的丙內(nèi)酯充分水解即可，由于丙內(nèi)酯本身對機(jī)體有傷害，但其水解產(chǎn)物對機(jī)體并無危害。所以滅活偽狂犬病毒之后將丙內(nèi)酯充分水解，可以有效降低偽狂犬疫苗接種動物后產(chǎn)生不良的副反應(yīng)。由此，進(jìn)一步提高偽狂犬疫苗的安全性。根據(jù)本發(fā)明一個實施例，在偽狂犬病毒的培養(yǎng)液中整個滅活過程中，需要不間斷攪拌偽狂犬病毒培養(yǎng)液。從而進(jìn)一步提高偽狂犬病毒培養(yǎng)液的滅活效果，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗的安全性。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，取部分經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒培養(yǎng)液，接種于ST細(xì)胞單層培養(yǎng)器中，經(jīng)過盲傳三代，若無細(xì)胞病變，及表明偽狂犬病毒培養(yǎng)液滅活完全。
[0035]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，將經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合包括:將含有滅活偽狂犬病毒的溶液與MARC0L52白油佐劑按照體積比為2:3進(jìn)行混合乳化，以便獲得偽狂犬病疫苗。由此，提高偽狂犬病疫苗的免疫原性，從而進(jìn)一步提高偽狂犬病疫苗安全性及免疫保護(hù)期。
[0036]根據(jù)本發(fā)明實施，所采用的佐劑的種類并不受特別限制，只要可以有效增強偽狂犬病毒抗原表面面積，并能延長偽狂犬病毒抗原在體內(nèi)保留時間，使偽狂犬病毒抗原與淋巴系統(tǒng)細(xì)胞有充分接觸時間，從而保證接種偽狂犬病疫苗后，可以產(chǎn)生充足的抗體，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受偽狂犬病毒的傷害。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，米用MARC0L52白油佐劑效果優(yōu)于其他佐劑。由此，可以顯著提高制備偽狂犬病疫苗的安全性、免疫原性及免疫保護(hù)期。
[0037]下面參考具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行描述，需要說明的是，這些實施例僅僅是描述性的，而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0038]實施例1偽狂犬病毒株獲得及特性鑒定
[0039]取江蘇某豬場發(fā)病豬的腦組織，剪碎研磨，用無菌生理鹽水1:5稀釋，置于離心管中反復(fù)凍融3次，3000轉(zhuǎn)/mi n離心30min，取病料上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾，經(jīng)ST細(xì)胞培養(yǎng)、病毒毒力測定、血清中和試驗和PCR鑒定，證實為豬偽狂犬病病毒，命名為偽狂犬病病毒SH株。
[0040]實施例2制備偽狂犬病疫苗
[0041]1、將ST細(xì)胞接種于含有5%~10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)ST細(xì)胞長滿單層時，取按實施例1分離獲得的偽狂犬病毒接種于含有ST細(xì)胞單層的培養(yǎng)器中。
[0042]2、將按實施例1分離獲得的偽狂犬病毒稀釋至百分濃度為0.3%，將稀釋后的偽狂犬病毒液接種于含有ST細(xì)胞單層的培養(yǎng)器中。在37攝氏度下條件下控制細(xì)胞吸附偽狂犬病毒30分鐘，然后加入含2%的新生牛血清DMEM的細(xì)胞維持液于37攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)36~48h，顯微鏡下觀察，當(dāng)75%~80%細(xì)胞病變時，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，以便得到裂解混合物。
[0043]3、離心分離裂解混合物，以便獲得偽狂犬病毒上清液。取上清液細(xì)胞毒液測定毒價，按每頭份病毒含量為TCID5(l106_5/ml時為合格,將合格的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，加入終濃度為1:3000的β-丙內(nèi)酯，在4攝氏度下滅活24小時，然后置于37攝氏度的水浴中水解2小時，滅活期間不斷攪拌，獲得滅活后的病毒液。
[0044]4、將滅活后的病毒液用DMEM液1:10稀釋后，接種生長致密的ST細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔)，接種量為每孔0.1mlo另外每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同時設(shè)立陰性對照孔，37攝氏度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變(CPE )。盲傳3代，如果無細(xì)胞病變(CPE )則表明滅活完全。
[0045]5、將檢驗合格的細(xì)胞毒液與MARC0L52白油佐劑按照2:3混合乳化，得到偽狂犬病疫苗。[0046]在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。[0047]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種偽狂犬病毒,其以保藏號CGMCC N0.8057保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒在制備偽狂犬病疫苗中的用途。
3.一種偽狂犬病疫苗，其特征在于，包含: 滅活的權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒；以及 佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述偽狂犬病毒是被β-丙內(nèi)酯滅活的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述佐劑為MARCOL52。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述偽狂犬病毒與所述佐劑的比例為(2:3)~(2:4)。
7.一種制備偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于，包括: 對權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒進(jìn)行滅活，以便獲得經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒；以及 將所述經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合，以便獲得所述偽狂犬病疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在對所述偽狂犬病毒進(jìn)行滅活之前，包括按照下列步驟獲得偽狂犬病毒培養(yǎng)液:. 將所述偽狂犬病毒接種于形成有ST細(xì)胞層的培養(yǎng)容器中，并在35.5~37.5攝氏度下進(jìn)行培養(yǎng)； 收集所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物； 將所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行凍融裂解，以便獲得裂解混合物；以及 分離所述裂解混合物的上清液，以便獲得所述偽狂犬病毒培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，對所述偽狂犬病毒進(jìn)行滅活包括: 在4攝氏度下，利用終濃度為1:3000的β-丙內(nèi)酯對偽狂犬病毒培養(yǎng)液進(jìn)行滅活處理24小時；以及 在37攝氏度下，使所述β -丙內(nèi)酯發(fā)生水解，以便獲得含有滅活偽狂犬病毒的溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將所述經(jīng)過滅活的偽狂犬病毒與佐劑混合包括: 將含有滅活偽狂犬病毒的溶液與MARCOL52白油佐劑按照體積比為2:3進(jìn)行混合乳化，以便獲得所述偽狂犬病疫苗。
【文檔編號】A61P31/22GK103468645SQ201310388419
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】熊煒, 高楊, 鄭杰, 劉俊生, 劉延亭 申請人:北京中聯(lián)康生物科技有限公司