人胚肺成纖維細(xì)胞株在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2對(duì)狂犬病毒易感，使用此細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒疫苗可得到一種抗原純度高、免疫效果好、安全性高、價(jià)格低的人用二倍體細(xì)胞狂犬病毒滅活純化疫苗。
【專利說明】人胚肺成纖維細(xì)胞株在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用
[0001]發(fā)明所屬領(lǐng)域:
[0002]本發(fā)明屬于疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，本發(fā)明涉及人胚肺成纖維細(xì)胞株在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用，以及人胚肺成纖維細(xì)胞株在制備治療狂犬病的滅活疫苗中的應(yīng)用
【背景技術(shù)】:
[0003]狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患的自然疫源性疾病，狂犬病是中國法定報(bào)告中死亡數(shù)和病死率最高的傳染性疾病。據(jù)2003年世界狂犬病調(diào)查報(bào)告顯示，中國的發(fā)病人數(shù)僅次于印度，居世界第二位，中國衛(wèi)生部已將狂犬病列為2類傳染病加以管理，但近年來中國狂犬病疫情一直呈上升趨勢(shì)，疫情形勢(shì)十分嚴(yán)峻?？袢∩袩o有效的治療措施，接種安全可靠的狂犬病疫苗是預(yù)防和控制狂犬病最重要的手段之一。
[0004]目前世界大量生產(chǎn)的狂犬疫苗有四種:第一種以美國為代表的二倍體細(xì)胞狂犬疫苗，但細(xì)胞難培養(yǎng)，且代次高，更重要的疫苗成本高，難廣泛普遍使用；第二種以法國為代表的Vero細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)的凍干滅活疫苗，但不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤和細(xì)胞DNA。第三種和第四種以中國為代表的地鼠腎細(xì)胞和日本的雞胚、鴨胚疫苗，由于細(xì)胞來源于普通動(dòng)物，無法保證細(xì)胞不攜帶外源因子，也不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性和細(xì)胞的DNA，并且動(dòng)物器官的可用量是限制工業(yè)化生產(chǎn)的因素。
[0005]實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，在人體試驗(yàn)中所使用的任何疫苗的免疫原性都無法和人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株相比。人二倍體細(xì)胞為正常核型細(xì)胞，無致癌性，并且由于人二倍體細(xì)胞疫苗(human diploid cell vaccine簡(jiǎn)稱HDCV)所具有的高免疫性和良好的耐受性，目前已經(jīng)成為評(píng)價(jià)任何一種人用新疫苗的標(biāo)準(zhǔn)疫苗。文獻(xiàn)報(bào)道，二倍體狂犬疫苗暴露前面免疫一劑即可達(dá)到其他狂犬疫苗5劑的效果，暴露后免疫也表現(xiàn)出明顯高于普通狂犬疫苗的保護(hù)效果，被認(rèn)為是狂犬病疫苗的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但HDCV的一個(gè)缺點(diǎn)是人二倍體細(xì)胞(HDC)不容易培養(yǎng)，而且狂犬病在HDC上培養(yǎng)的病毒滴度相對(duì)較低，僅能在有限的細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)，這使得疫苗的價(jià)格非常昂貴。所以現(xiàn)在僅在歐美發(fā)達(dá)國家使用。在發(fā)展中國家，由于其昂貴的價(jià)格而限制了這種疫苗的使用。
[0006]國內(nèi)狂犬疫苗主要為地鼠腎細(xì)胞疫苗和VeiO細(xì)胞疫苗。地鼠腎細(xì)胞來源于普通動(dòng)物，無法保證細(xì)胞不攜帶外源因子，且動(dòng)物器官的可用量是限制工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一 ；Ver0細(xì)胞來源于非洲綠猴腎細(xì)胞，細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性存在著潛在隱患，且細(xì)胞殘余DNA難以有效去除，安全得不到保證，也是國內(nèi)多家狂犬疫苗生產(chǎn)企業(yè)限制產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。近年來國內(nèi)狂犬病疫苗廠家因現(xiàn)有狂犬病疫苗免疫原性不強(qiáng)，中和抗體產(chǎn)生緩慢，Vero細(xì)胞DNA不能有效去除等問題而對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量形成制約，國內(nèi)廠家正在積極研制更高標(biāo)準(zhǔn)的替代品，作為黃金標(biāo)準(zhǔn)的人二倍體細(xì)胞疫苗成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0007]中國專利201210137898.8公開了利用人二倍體細(xì)胞W1-38制備的細(xì)胞狂犬病疫苗和制備方法；中國專利201310009682.8公開了利用人二倍體細(xì)胞MRC-5制備的細(xì)胞狂犬病疫苗和制備方法；中國專利200510080058.2公開了利用人二倍體細(xì)胞MRC-5，W1-38制備的細(xì)胞狂犬病疫苗和制備方法；中國專利201010253554.4公開了利用人二倍體細(xì)胞KMB-17制備的細(xì)胞狂犬病疫苗和制備方法。中國專利201210371784.X公開了一種人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2，但是此細(xì)胞否對(duì)狂犬病病毒敏感還不清楚，也不知此細(xì)胞是否可應(yīng)用于生產(chǎn)狂犬病疫苗。
[0008]從已有技術(shù)來看，無論是國外建立的細(xì)胞株MRC-5，WI_38，還是國內(nèi)建立的細(xì)胞株2BS、KMB-17，在病毒疫苗中已使用多年，安全性不容置疑。但缺點(diǎn)是產(chǎn)量低，細(xì)胞代數(shù)高，限制了病毒的產(chǎn)量提高和進(jìn)一步使用。更重要的是狂犬病病毒在現(xiàn)有的二倍體細(xì)胞上培養(yǎng)的病毒滴度相對(duì)較低，僅能在有限的細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)，使工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)難已實(shí)施。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2對(duì)狂犬病毒易感，使用此細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒疫苗可得到一種抗原純度高、免疫效果好、安全性高、價(jià)格低的人用二倍體細(xì)胞狂犬病毒滅活純化疫苗。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株在制備治療狂犬病的滅活疫苗中的應(yīng)用
[0011]本發(fā)明公開了人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株在中國專利201210371784.X已公開，為人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2,保藏于國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏機(jī)構(gòu)-中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中國典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編430072，電話:027_68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。
[0013]本發(fā)明還公開了人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2在制備治療狂犬病的滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明所述的人胚肺二倍體細(xì)胞狂犬病純化疫苗是將狂犬病毒接種至Walvax-2細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒并經(jīng)濃縮滅活純化而制成。所述的狂犬病毒毒種包括CTN-1V5株、aG株、PM株、PV株、CVS株、SAD株、ERA株、Flury LEP株、Flury HEP株、Vnukovo32株、KisslingCV株。這些病毒樣品在菌種保藏機(jī)構(gòu)如ATCC，中國藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心等都有保藏，研究者可通過購買獲取。本發(fā)明所使用的參比細(xì)胞如MRC-5，W1-38在菌種保藏機(jī)構(gòu)如ATCC, CCTCC等都有保藏，研究者可通過購買獲取。
[0015]本發(fā)明還公開了利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2制備狂犬滅活疫苗的方法，該方法包括下列步驟，
[0016]I)人胚肺二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)；
[0017]2)在人胚肺二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種，培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0018]3)病毒液收獲、合并；
[0019]4)澄清、超濾濃縮；
[0020]5)病毒液滅活、純化；
[0021]6)稀釋分裝并加入保護(hù)劑后凍干制成純化疫苗；
[0022]本發(fā)明所述的Walvax-2細(xì)胞為貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，具有典型的人二倍體細(xì)胞體外培養(yǎng)特征，細(xì)胞成纖維狀成片成束生長，形態(tài)良好，呈有限生命代次，培養(yǎng)至58代次體外培養(yǎng)告終。根據(jù)《中國藥典三部》——“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”建立原始、主代、工作代三級(jí)細(xì)胞庫，并進(jìn)行了全面的檢定，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2適應(yīng)在細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器工藝上或在微載體上進(jìn)行很好的適應(yīng)，可進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)。
[0023]目前，國內(nèi)使用的狂犬疫苗主要為VeiO細(xì)胞狂犬疫苗和地鼠腎細(xì)胞狂犬疫苗，較之這兩種疫苗，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。[0024]I)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株，經(jīng)過嚴(yán)格的生物學(xué)檢測(cè)，質(zhì)量符合藥典要求。采用人二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)，細(xì)胞基質(zhì)安全、穩(wěn)定，沒有外源因子和潛在致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。
[0025]2)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株從中國大陸人取材建系，遺傳背景資料清晰，遺傳資源利益方產(chǎn)權(quán)清晰，在低代次大量凍存細(xì)胞，可使用較低代次的細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，因此不存在細(xì)胞基質(zhì)的瓶頸；
[0026]3)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株適應(yīng)在細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器工藝上進(jìn)行，更有利于生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大；
[0027]4)疫苗制備的整個(gè)過程中均不使用用抗生素，沒有抗生素殘留問題
[0028]5)采用的純化方式可進(jìn)一步提高疫苗的純度，提高疫苗的安全性，有效減少副反應(yīng)的發(fā)生率。
[0029]采用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2生產(chǎn)的狂犬滅活疫苗與MRC_5，W1-38，KMB-17，2BS細(xì)胞生產(chǎn)的狂犬滅活疫苗相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:
[0030]I)對(duì)現(xiàn)用于狂犬病疫苗用毒種具有很好的適應(yīng)性?？袢∫呙缟a(chǎn)的毒株CTN-1V5在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2可快速適應(yīng)，傳代10代，病毒滴度升至
7.0logLD5ciAil以上，縮短病毒的適應(yīng)周期一半還多，在不影響病毒免疫原性的前提下快速提高病毒產(chǎn)量，節(jié)約人力物力。
[0031]2) Walvax-2細(xì)胞制備的狂犬滅活疫苗和MRC-5細(xì)胞株制備的狂犬滅活疫苗效果比較，病毒平均滴度提高23.09%，平均效價(jià)提高39.66%。
[0032]3)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株適應(yīng)在細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器工藝上或在微載體上進(jìn)行很好的適應(yīng)，可進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)；
[0033]4)所制備的疫苗安全性高，免疫效果好，使用方便，純度高，適合大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]實(shí)施例lWalvax-2細(xì)胞株的制備
[0036]1.1.實(shí)驗(yàn)材料的獲得:在獲得國家衛(wèi)生管理部門和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)后，對(duì)捐贈(zèng)孕婦的夫婦年齡、職業(yè)及健康狀況，胎兒父母系三代進(jìn)行調(diào)查，選擇無腫瘤疾病歷史，無先天性異常和遺傳缺陷家族史的胎兒。征得胎兒父母及其親屬同意后，簽訂《捐贈(zèng)者同意書》。
[0037]1.2.初代培養(yǎng):胚胎水囊引產(chǎn)后及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，無菌條件下取出肺組織，撕去肺組織表面的膜，剪切成I~2mm3的組織塊，PBS清洗3~4次；將組織塊移入三角瓶；加胰蛋白酶消化30min,加血清中和，IOOOrpm離心5min棄胰蛋白酶,用細(xì)胞完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分:MEM+10%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0038]1.3.傳代培養(yǎng):棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞面，用胰蛋白酶消化后加入完全培養(yǎng)液終止消化；以1:2或1:4的分種比例進(jìn)行傳代；待細(xì)胞長成致密單層后繼續(xù)傳代，直至生命線。
[0039]1.4.細(xì)胞凍存:細(xì)胞生命線傳代過程中，在第6代，第8代，第10代，第14代，第20代分別大量凍存細(xì)胞做種子細(xì)胞庫或工作細(xì)胞庫。其中第6代為原始細(xì)胞細(xì)胞庫，第14代為主細(xì)胞庫，第20代為工作細(xì)胞庫.凍存細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)蘇，檢測(cè)其活性繼續(xù)傳代至生命線，傳代58次。
[0040]1.5.細(xì)胞傳代消化:細(xì)胞培養(yǎng)3-4天后，PBS洗細(xì)胞面后胰蛋白酶消化5_10min，去胰蛋白酶，加入20~30ml培養(yǎng)液終止消化；分瓶繼續(xù)在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)。
[0041]1.6.細(xì)胞特性研究:傳代過程中，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行研究。本發(fā)明從所建系且符合國家藥典要求的細(xì)胞中篩選到一株人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株，命名為Walvax-2，保藏于國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏機(jī)構(gòu)-中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCC201055，保藏日期是2010年7月13日。中國典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編 430072，電話:027-68752319, Email: cctcciwhu.edu.cn。
[0042]1.7.Walvax-2細(xì)胞株對(duì)多種人類病毒敏感,如手足口病的病毒,狂犬病病毒。特別是狂犬病病毒，病毒不但易感，且病毒產(chǎn)量聞。將病毒分別接種Walvax-2細(xì)胞株,在35_37°C常規(guī)培養(yǎng)下，就能生產(chǎn)大量的病毒疫苗原液；病毒原液通過滅活，濃縮，去雜質(zhì)，加入佐劑，就形成狂犬滅活疫苗。
[0043]實(shí)施例2狂犬病毒CTN-1V5病毒及aG病毒分別在細(xì)胞Walvax-2上的適應(yīng)
[0044]2.1常規(guī)方法復(fù)蘇Walvax-2細(xì)胞，使用含10%小牛血清的MEM傳代至25-30代使用，長成單層后消化，分散呈單個(gè)細(xì)胞，加完全培養(yǎng)液后離心并去上清，細(xì)胞沉淀用無血清培養(yǎng)液懸浮制得分散為單個(gè)細(xì)胞的人胚肺二倍體細(xì)胞懸液；
[0045]2.2將新鮮狂犬病毒CTN-1V5毒種按0.0001-1M0I接種入分散為單個(gè)細(xì)胞的人胚肺二倍體細(xì)胞懸液中，在36°C吸附90分鐘，補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至合適體積共8毫升，30-40°C培養(yǎng)，2-5天成致密單層，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，換含5%小牛血清、1%蔗糖液的MEM維持液維持5天收獲上清，補(bǔ)加5-30%牛血清置低溫凍存，并標(biāo)為人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒Pl代；
[0046]2.3帶毒細(xì)胞消化傳代，依1:1-1:3的傳代比率傳代，生長2_5天細(xì)胞成致密單層后換病毒維持液，30-40°C培養(yǎng)3-7天，收獲上清凍存，標(biāo)為人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒P2代；
[0047]2.4再次帶毒細(xì)胞消化傳代，依1:1-1:3的傳代比率傳代，生長2_5天細(xì)胞成致密單層后換病毒維持液，30-40°C培養(yǎng)3-7天，收獲上清凍存，標(biāo)為人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒P3代；
[0048]2.5接種步驟2.4)收獲的病毒，重復(fù)步驟2.2，2.3，2.4為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過4_5個(gè)循環(huán)，傳代10-15次，獲得對(duì)人二倍體細(xì)胞敏感的狂犬疫苗毒種。
[0049]按照《中華人民中和國藥典》鼠腦接種法進(jìn)行滴度檢測(cè)，采用ll_13g昆明小鼠，鼠腦接種0.03ml/只,觀察14天計(jì)算半數(shù)致死量。
[0050]表一:CTN_1V5病毒及aG病毒分別在細(xì)胞Walvax-2和MRC-5上的適應(yīng)情況
[0051]
【權(quán)利要求】
1.人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2在制備狂犬滅活疫苗中的應(yīng)用。
2.人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞株Walvax-2在制備治療狂犬病的滅活疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103468650SQ201310464748
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】楊喆, 馬波, 李偉, 何麗芳, 王麗麗, 陳敏, 王馨, 尹孝兵, 任正勇, 高顯專, 胡超 申請(qǐng)人:云南沃森生物技術(shù)股份有限公司