一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種家畜疫病感染與免疫的鑒別檢測(cè)器具，特別是涉及一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，檢測(cè)膜上含有強(qiáng)毒檢測(cè)線T1“│”，疫苗毒檢測(cè)線T2“│”和質(zhì)控線C“│”印跡。鑒別檢測(cè)時(shí)，在檢測(cè)膜顯現(xiàn)三條紅色條帶“│││”為豬偽狂犬強(qiáng)毒感染；兩條紅色條帶“││”為豬偽狂犬疫苗毒疫苗免疫；只顯現(xiàn)一條紅色條帶“│”為豬偽狂犬病毒陰性。本鑒別檢測(cè)試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，敏感性高，反應(yīng)譜廣，可檢測(cè)現(xiàn)有疫苗毒株和和多數(shù)流行強(qiáng)毒株，且操作簡(jiǎn)便、快速，可廣泛用于豬偽狂犬病毒感染與免疫的鑒別檢測(cè)，易于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種家畜疫病感染與免疫的鑒別檢測(cè)器具，特別是涉及一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙。

【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病((Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多種動(dòng)物共患傳染病，可感染牛、豬、犬、羊、狐貍和貓等。豬是偽狂犬病的傳染源和自然貯存宿主，豬感染PRV后表現(xiàn)為發(fā)熱，仔豬神經(jīng)癥狀、高死亡率，大中豬呼吸道癥狀，母豬流產(chǎn)等臨床特點(diǎn)。在2010年，偽狂犬病是我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行疫病控制最為理想的疾病之一，許多豬場(chǎng)已經(jīng)達(dá)到免疫無(wú)感染狀態(tài)。然而在2011年，一些Bartha-K61疫苗免疫的豬場(chǎng)出現(xiàn)了變異的豬偽狂犬病病毒，表明傳統(tǒng)的gE基因缺失疫苗不能提供足夠的免疫保護(hù)。河南省豬群偽狂犬病的感染率自2005年以來(lái)呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)，臨床上以散發(fā)或非典型病例為主。但是，從2011年底開始，我省部分豬場(chǎng)突發(fā)偽狂犬疫情，很快在省內(nèi)各地爆發(fā)，廣泛流行；而且，部分豬場(chǎng)附近的羊、犬、貓、狐貍等動(dòng)物也出現(xiàn)感染死亡狀況。因此，現(xiàn)階段我國(guó)豬偽狂犬病的防控變得更為棘手和復(fù)雜。
[0003]PRV 屬于抱疫病毒科(Herpesviridae), a_ 抱疫病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的成員，基因組為線性雙鏈DNA，大小約150 kb。整個(gè)PRV基因組至少含有70個(gè)基因，編碼70-100余種蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)PRV可編碼11個(gè)糖蛋白:gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL、gM和gN。gB、gH、gL和gM皰疹病毒科中保守，而且gB、gH和gL對(duì)所有皰疹病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行復(fù)制都是必需的。gB蛋白能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，與免疫保護(hù)相關(guān)。PRV gE蛋白最早被稱為gl蛋白。1960年代篩選制備的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE缺失。在二十世紀(jì)80年代中期，通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建了 gE缺失的PRV突變株；在此基礎(chǔ)上，將TK進(jìn)行缺失使PRV病毒得到進(jìn)一步致弱。許多gE缺失疫苗均能夠預(yù)防攻毒感染或減輕攻毒感染造成的臨床癥狀。雖然當(dāng)前也存在gC和gG缺失的PRV疫苗，但在許多國(guó)家僅允許豬群使用gE缺失疫苗。從1990年代到2011年底，我國(guó)80%以上豬群均使用了gE基因缺失疫苗Bartha進(jìn)行免疫接種。gE疫苗和gE抗體診斷配套使用用于PRV凈化的前提是所有流行毒株均表達(dá)gE蛋白，而且流行株感染的動(dòng)物均產(chǎn)生gE蛋白的抗體。目前幾乎所用PRV野毒株均表達(dá)gE蛋白。通過gE基因缺失疫苗與gE抗體診斷方法的聯(lián)合使用，一些歐洲國(guó)家如德國(guó)、奧地利、瑞典、丹麥和英國(guó)及美國(guó)已成功在家養(yǎng)豬群中凈化了豬偽狂犬病。我國(guó)政府在2011年制訂了《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》，提出到2015年，原種豬場(chǎng)豬偽狂犬病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)；到2020年，全國(guó)所有種豬場(chǎng)豬偽狂犬病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)。然而病原體的凈化是一項(xiàng)長(zhǎng)期而且艱巨的任務(wù)。如果要實(shí)現(xiàn)完全凈化或接近凈化狀態(tài)可能需要100年時(shí)間甚至更長(zhǎng)；例如美國(guó)的豬偽狂犬病首次出現(xiàn)在1909年，其凈化計(jì)劃始自1989年，到2005年絕大多數(shù)凈化項(xiàng)目得以完成。即便如此，野豬群中PRV病毒的存在對(duì)家豬再次感染PRV造成了很大的威脅。因此，建立簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感的鑒別診斷方法區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物及病毒感染動(dòng)物十分必要。
[0004]偽狂犬病的鑒別診斷方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)等，其中ELISA試劑盒是市場(chǎng)上最為常用的鑒別診斷商品。商品化的ELISA試劑盒分別使用間接或阻斷ELISA，由于臨床血清較為復(fù)雜，間接ELISA的特異性相對(duì)于阻斷ELISA稍差。阻斷ELISA使用臨床豬血清阻斷gE蛋白特異性單抗的結(jié)合，特異性與敏感性較高；然而，阻斷ELISA也存在先天的缺點(diǎn)。阻斷ELISA使用的單抗針對(duì)的是在豬體內(nèi)具有免疫優(yōu)勢(shì)的表位，一旦PRV病毒在gE基因發(fā)生變異就有可能使得單抗識(shí)別無(wú)效。雖然阻斷ELISA仍然能夠特異檢測(cè)出我國(guó)新出現(xiàn)的變異的PRV病毒抗體，但單抗識(shí)別無(wú)效的可能性依舊存在。所以，依據(jù)現(xiàn)階段的PRV變異毒株開發(fā)新的鑒別診斷方法勢(shì)在必行。免疫層析試紙是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型體外檢測(cè)技術(shù),是理想的即時(shí)檢測(cè)(point-of-care test,P0CT)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，其具有更加靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，尤其是可實(shí)現(xiàn)“傻瓜式”操作，即不需要任何附加儀器設(shè)備即可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，并在1-5分鐘內(nèi)判定結(jié)果，廣泛應(yīng)用于各種分析物的定性和半定量快速檢測(cè)，包括抗原、半抗原、抗體和核酸等，已成為當(dāng)今最快速敏感的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從1995年開始系統(tǒng)開展免疫試紙快速檢測(cè)技術(shù)研究,率先在國(guó)際上研制成功動(dòng)物疫病病原和抗體檢測(cè)膠體試紙產(chǎn)品一一雞傳染性法氏囊病快速診斷試紙和豬旋毛蟲抗體檢測(cè)紙，建立了動(dòng)物疫病快速檢測(cè)試紙研發(fā)技術(shù)平臺(tái)，截至目前已成功開發(fā)出動(dòng)物疫病抗原、抗體以及藥物殘留檢測(cè)等系列快速檢測(cè)試紙產(chǎn)品，大大推動(dòng)了該技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。本發(fā)明針對(duì)PRV野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷的關(guān)鍵技術(shù)問題，篩選鑒定可區(qū)分PRV強(qiáng)、疫苗毒株的高親和力配對(duì)單克隆抗體，建立基于免疫層析試紙的蛋白芯片技術(shù)平臺(tái)，研制豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙，建立適用于養(yǎng)殖基層和臨床檢測(cè)的快捷、簡(jiǎn)便的豬偽狂犬野毒感染和疫苗免疫聯(lián)檢技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬偽狂犬病毒野毒感染的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為我國(guó)豬偽狂犬防控與凈化提供技術(shù)支撐，對(duì)豬偽狂犬疫情監(jiān)測(cè)和防控有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:研制適用于豬偽狂犬感染與免疫鑒別檢測(cè)的豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙，本試紙?zhí)禺?、敏感、快捷、?jiǎn)便，易在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，金標(biāo)墊為吸附膠體金標(biāo)記抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAbl的玻璃纖維，檢測(cè)膜為印跡強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl、疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜，由樣品端至手柄端的排列為強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl/疫苗毒檢測(cè)線T2/質(zhì)控線C:“I I I ”，強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl為抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體gE蛋白mAb2印跡“ I ”，疫苗毒檢測(cè)線T2為抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl或抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAb3印跡“ I ”，質(zhì)控線C為抗小鼠IgG抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA印跡“ I ”。鑒別檢測(cè)時(shí)，豬偽狂犬強(qiáng)毒感染在檢測(cè)膜顯現(xiàn)強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl，疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C三條紅色條帶“I I I ”，豬偽狂犬疫苗毒疫苗免疫在檢測(cè)膜顯現(xiàn)疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C兩條紅色條帶“ I I ”，無(wú)豬偽狂犬病毒則只顯現(xiàn)質(zhì)控線C 一條紅色條帶“丨”。
[0007]以豬偽狂犬病毒gB和gE重組蛋白為免疫抗原，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)鑒定抗豬偽狂犬病毒gB和gE蛋白單克隆抗體，利用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)篩選區(qū)分豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒的單克隆抗體，以疊加酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選識(shí)別不同抗原表位的單克隆抗體。用于膠體金標(biāo)記的單克隆抗體mAbl和疫苗毒檢測(cè)線T2的單克隆抗體mAb3均特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒疫苗株，分別識(shí)別豬偽狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位，用于強(qiáng)毒檢測(cè)線T2的單克隆抗體mAb2特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株gE蛋白，但不與疫苗毒株反應(yīng)。同時(shí)，以IPMA篩選與豬偽狂犬病毒反應(yīng)譜廣的單克隆抗體，膠體金標(biāo)記單克隆抗體mAbl和疫苗毒檢測(cè)線T2單克隆抗體mAb3可識(shí)別豬偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒疫苗以及多數(shù)流行強(qiáng)毒株，強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl單克隆抗體mAb2可識(shí)別多數(shù)豬偽狂犬病毒流行強(qiáng)毒株。以豬偽狂犬病毒疫苗毒Bartha株為免疫抗原制備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl,可用于疫苗毒檢測(cè)線T2印跡。以小鼠IgG為免疫抗原制備羊抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2，pAb2和金黃色葡萄球菌SPA均可用于質(zhì)控線C印跡。
[0008]本發(fā)明有益的積極效果:豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙實(shí)現(xiàn)了豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒的同步聯(lián)檢，可有效鑒別豬群豬偽狂犬強(qiáng)毒感染與疫苗免疫，并且操作簡(jiǎn)單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監(jiān)測(cè)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。檢測(cè)試紙條具有下列各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn):
(I)強(qiáng)毒和疫苗毒聯(lián)檢。豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)膜上含有識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒的疫苗毒檢測(cè)線和識(shí)別強(qiáng)毒但不識(shí)別疫苗毒的強(qiáng)毒檢測(cè)線，可同步進(jìn)行豬偽狂犬病毒的強(qiáng)毒株和疫苗毒株聯(lián)檢，實(shí)現(xiàn)豬偽狂犬的強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)。
[0009](2)特異性強(qiáng)，敏感性高。豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙以可區(qū)分豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒的高親和力配對(duì)單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，單克隆抗體的特異性強(qiáng)和敏感性高，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對(duì)標(biāo)記抗體的反應(yīng)性影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，鑒別檢測(cè)試紙具有較高的特異性和敏感性。
[0010](2)操作簡(jiǎn)便快速。使用鑒別檢測(cè)試紙時(shí)無(wú)需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0011](3)顯示檢測(cè)結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。鑒別檢測(cè)試紙以顯示紅棕色“ I ”、“ I I ”和“I I I ”印跡作為檢測(cè)的陰性、疫苗毒和強(qiáng)毒陽(yáng)性標(biāo)記，即在檢測(cè)膜上顯示一條棕紅色條帶“ I ”為豬偽狂犬病毒陰性，表示被檢測(cè)樣品無(wú)疫苗毒疫苗或強(qiáng)毒感染，兩條棕紅色條帶“ I I ”為豬偽狂犬病毒疫苗毒陽(yáng)性，表示被檢樣品為疫苗毒疫苗免疫，三條棕紅色條帶“I I I ”為豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒陽(yáng)性，表示被檢樣品為強(qiáng)毒感染，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性誤判。
[0012](4)成本低，投資少。使用鑒別檢測(cè)試紙，不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0014]圖1是豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2是豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖中，1.支撐板，2.樣品墊，3.金標(biāo)墊，4.檢測(cè)膜，5.吸水墊，6.強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl印跡，7.疫苗毒檢測(cè)線T2印跡，8.質(zhì)控線C印跡，9-1.樣品端保護(hù)膜，9-2.手柄端保護(hù)膜，10.標(biāo)記線。
[0017]【具體實(shí)施方式】豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙可廣泛應(yīng)用于豬群豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒感染和疫苗免疫的鑒別檢測(cè)。制備豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙，首先需制備豬偽狂犬病毒免疫抗原，進(jìn)而制備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體和單克隆抗體，并篩選區(qū)分豬偽狂犬強(qiáng)毒和疫苗毒的單克隆抗體，識(shí)別豬偽狂犬強(qiáng)毒和疫苗毒的單克隆抗體mAbl用于制備膠體金標(biāo)記物，識(shí)別豬偽狂犬強(qiáng)毒而不識(shí)別疫苗毒的單克隆抗體mAb2用于印制強(qiáng)毒檢測(cè)線印跡“ I ”，識(shí)別豬偽狂犬強(qiáng)毒和疫苗毒的多克隆抗體pAbl或單克隆抗體mAb3用于印制疫苗毒檢測(cè)線印跡“ I ”，其次需制備羊抗小鼠IgG抗體或金黃色葡萄球菌SPA，用于印制質(zhì)控線印跡“ I ”。
[0018](I)豬偽狂犬病毒免疫抗原的制備。
[0019](1.1)豬偽狂犬病毒gB重組蛋白的制備
以PCR擴(kuò)增PRVgB蛋白的中和表位富集區(qū)，將目的基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建gB基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gB，經(jīng)I mol/L IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中高效表達(dá)gB重組蛋白,Western blot檢測(cè)表明gB表達(dá)蛋白均能被PRV陽(yáng)性血清特異識(shí)別，具有良好的反應(yīng)性。采用Ni柱親和層析純化及稀釋復(fù)性技術(shù)獲得純度約90%的gB重組蛋白15mg/L。
[0020](1.2)豬偽狂犬病毒gE重組蛋白的制備
以PCR擴(kuò)增PRVgE蛋白的表位富集區(qū)，將目的基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建gB基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gE，經(jīng)0.4 mol/L IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中高效表達(dá)gE重組蛋白，Western blot檢測(cè)表明gE表達(dá)蛋白均能被PRV強(qiáng)毒陽(yáng)性血清特異識(shí)別，具有良好的反應(yīng)性。采用Ni柱親和層析純化技術(shù)獲得純度約90%的gE重組蛋白12mg/L。
[0021](2)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體的制備。
[0022](2.1)雜交瘤細(xì)胞株的建立。
[0023]分別將豬偽狂犬病毒gB和gE重組蛋白與弗氏免疫佐劑等量混合，充分乳化，以50mg-100 mg/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15-30天；第3次加強(qiáng)免疫后3_4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75%酒精浸泡5-10 min，無(wú)菌取其脾臟；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，1000 r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將I X 18的脾細(xì)胞與2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，1000 r/min離心10 min，棄上清，在37°C的水浴中將0.7-1 ml的40%_50%PEG 4000 (pH8.5-9.0)緩緩加入細(xì)胞，溫育I min后，緩慢加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15 ml,以終止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, 1000 r/min離心10 min，棄上清，將細(xì)胞重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板(100 ml-200 ml/孔)，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7-10天后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。以豬偽狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒感染倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，經(jīng)甲醇固定后，5%脫脂奶37°C封閉I h ;加待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清50mL/孔，設(shè)HAT培養(yǎng)基和小鼠免疫血清為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；加1:500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(50 mL/孔)，37°C作用30 min ;每步反應(yīng)后均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌；以底物AEC室溫顯色10-20 min，用水沖洗中止顯色后，在顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。選取強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的克隆孔進(jìn)行連續(xù)3次有限稀釋克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存細(xì)胞，分別建立抗豬偽狂犬病毒gB蛋白和gE蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8株和12株。
[0024](2.2)單克隆抗體的制備:以體內(nèi)誘生腹水制備單抗。取經(jīng)降殖烷或液體石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞17個(gè)/只，7 d?10 d后抽取腹水，離心后取上清，分裝，凍存。
[0025](2.3)單克隆抗體的鑒定 (2.3.1)單克隆抗體的抗體效價(jià)
以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水的單抗效價(jià)，單抗上清和腹水的ELISA效價(jià)分別在1:640和1: 5 X 15以上，IPMA效價(jià)分別在1:16和1:8000以上。
[0026](2.3.2)單克隆抗體的特異性
用PRV標(biāo)準(zhǔn)毒株、流行毒株和疫苗毒株感染倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，以免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定單抗與PRV流行毒株的反應(yīng)性，篩選獲得同時(shí)特異識(shí)別PRV標(biāo)準(zhǔn)毒株、流行毒株和疫苗毒株的gB蛋白單克隆抗體6株，而特異識(shí)別PRV標(biāo)準(zhǔn)毒株和流行毒株但不識(shí)別疫苗毒株的單克隆抗體8株。以免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)檢測(cè)上述14株單克隆抗體與疫苗株和流行毒株的反應(yīng)譜，證明用于膠體金標(biāo)記和疫苗毒檢測(cè)線T2的gB蛋白單克隆抗體可識(shí)別豬偽狂犬病毒疫苗毒株以及多數(shù)流行強(qiáng)毒株，用于強(qiáng)毒檢測(cè)線的gE蛋白單克隆抗體可識(shí)別多數(shù)豬偽狂犬病毒流行強(qiáng)毒株，均具有較廣的PRV反應(yīng)譜。
[0027](2.3.3)單克隆抗體識(shí)別抗原表位分析
以阻斷ELISA或疊加ELISA對(duì)PRV單克隆抗體識(shí)別的抗原表位進(jìn)行分析，篩選獲得分別識(shí)別豬偽狂犬病毒gB蛋白不同抗原表位的單克隆抗體mAbl和mAb3，其分別用于膠體金標(biāo)記和疫苗毒檢測(cè)線T2印跡；獲得特異識(shí)別豬偽狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株和流行毒株，而不與疫苗毒疫苗株反應(yīng)的gE蛋白單克隆抗體mAb2，用于強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl印跡。
[0028](2.3.3.1)阻斷ELISA:以HRP分別標(biāo)記單克隆抗體，ELISA阻斷試驗(yàn)鑒定單克隆抗體識(shí)別抗原表位的特異性，首先在gB或gE重組蛋白包被的酶標(biāo)板中逐行加入未標(biāo)記的單抗，設(shè)PRV陽(yáng)性血清、陰性血清和PBS對(duì)照，37°C作用I h ;然后逐列加入HRP標(biāo)記的單抗，37°C作用I h ;以底物TMB進(jìn)行顯色，讀取各檢測(cè)孔的OD45tl值。顯著抑制酶標(biāo)單抗結(jié)合的未標(biāo)記單抗識(shí)別相同或相近的抗原表位，而對(duì)酶標(biāo)單抗結(jié)合無(wú)明顯影響的未標(biāo)記單抗則識(shí)別不同的抗原表位。
[0029](2.3.3.2)疊加ELISA:首先利用包被抗原的酶標(biāo)板以間接ELISA測(cè)定各單抗的工作濃度，繪制抗原飽和曲線。在疊加ELISA試驗(yàn)中，根據(jù)抗原飽和曲線適當(dāng)稀釋單抗，并配對(duì)加入酶標(biāo)板各孔，37°C孵育I h?2 h ;分別加入酶標(biāo)二抗和TMB進(jìn)行顯色，讀取各孔OD45tl值，按下列公式計(jì)算疊加系數(shù)(AI):AI=[2'0D1+2/ (OD^OD2)-1] '100%，其中0D1+2為配對(duì)單抗孔的OD45tl值，OD OD 2為兩個(gè)獨(dú)立單抗孔的OD 45(|值。兩個(gè)單抗的Al值小于40%判為識(shí)別相同或相近抗原表位；AI值大于40%判為識(shí)別不同抗原表位。
[0030](2.4)單克隆抗體的純化:以辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化單抗IgG。取I mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl調(diào)至pH 4.5 ；于室溫?cái)嚢柘拢鸬渭尤?3 mL辛酸，4°C靜置2 h，15000 r/min離心30 min，棄沉淀；在離心上清中加入 1/10 體積 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4)，以 0.1 mol/L NaOH 調(diào)至 pH 7.4 ;于冰浴條件下加入飽和硫酸銨至終濃度45%,4°C靜置2 h, 10000 r/min離心30 min,棄上清；以適量PBS重懸沉淀，對(duì)PBS透析過夜，換液3次。以分光光度計(jì)法或考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定純化單克隆抗體IgG的蛋白含量在lmg/ml以上，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定小鼠腹水和純化IgG的抗體效價(jià)在1:5X 15和1:4000以上，分裝，凍存。
[0031](3)抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體的制備。
[0032]以50 mg~100 mg/kg體重的豬偽狂犬疫苗經(jīng)肌肉注射免疫健康仔豬3~4次,末次免疫10天后，前腔靜脈采血，以IPMA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1:1000以上時(shí)，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集高免血清，以無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)提取免疫豬血清IgG，取I份免疫血清加
2份 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.2)混合，加入無(wú)水 Na2SO4至終濃度 18%, 37°C水浴 30min, 4000r/min離心20min,棄上清，以適量PBS (pH7.2)重懸沉淀，加終濃度16%的Na2SO4, 37。。沉淀30min，4000r/min離心20min，棄上清，再以適量PBS (pH7.2)重懸沉淀，以終濃度14%的Na2SOjX淀，4000r/min離心20min，棄上清，以適量PBS(pH7.2)重懸沉淀，對(duì)PBS (ρΗ7.2)過夜透析，換液2~3次，測(cè)定抗體效價(jià)和蛋白濃度(10-20 mg/ml )，所制備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體PAbl可用于檢測(cè)試紙疫苗毒檢測(cè)線T2印跡的印制。
[0033](4)兔抗小鼠IgG多克隆抗體的制備
以純化的小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康新西蘭兔，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，皮下多點(diǎn)注射50 mg/只，每次加強(qiáng)免疫間隔3 W，以弗氏不完全佐劑乳化抗原肌肉注射，最后一次加強(qiáng)免疫2 w后，以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)高于1:40時(shí)，采集高免兔全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨法純化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)單抗純化，辛酸用量為45 mL/mL血清，測(cè)定抗體效價(jià)和蛋白濃度(10-20 mg/ml )，所制備兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2可用于檢測(cè)試紙質(zhì)控線C印跡的印制。
[0034](5)單克隆抗體的膠體金標(biāo)記
(5.1)膠體金的制備:取100 mL超純水置于500 mL潔凈的錐形瓶，加入I mL 1% (w/V)氯金酸煮沸；在攪拌狀態(tài)下迅速加入新鮮配制的I mL 1% (w/v)檸檬酸鈉溶液，煮沸約3min至溶液顏色由黃色變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸2 min;待溶液涼至室溫，補(bǔ)超純水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0，4°C避光可保存數(shù)月。
[0035](5.2)最適標(biāo)記蛋白濃度測(cè)定:取待標(biāo)記抗PRV單抗IgG對(duì)20 mmol/L硼酸鈉溶液(pH 8.0) 4°C過夜透析。在微孔板中以25 mL超純水以1:2.1:4.1:8……倍比稀釋待標(biāo)記PRV單抗；各孔加入125 mL膠體金溶液，RT靜置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液；各孔顏色隨蛋白濃度的降低而由紅色變?yōu)樗{(lán)色。以顏色未變藍(lán)的單抗最高稀釋度的蛋白濃度為膠體金最適標(biāo)記濃度，膠體金標(biāo)記時(shí)，蛋白濃度增加20%。
[0036](5.3)單克隆抗體的膠體金標(biāo)記:取2 mL最適蛋白濃度的待標(biāo)記單抗IgG,加入10mL膠體金溶液(pH 9.0),迅速混勻，室溫作用10 min?15 min ;加入1/10體積含10% (w/V)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸鈉溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ；4°C15000 g離心30min，小心移去上清；以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，同上離心,棄上清；重復(fù)洗滌I次，以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037](6)檢測(cè)膜的制備
將硝酸纖維素檢測(cè)膜切成2.5X30 cm2的長(zhǎng)條，置于XYZ 3000噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，并以壓條固定；用PBS (pH 7.2)將特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株但不與疫苗毒株反應(yīng)的gE蛋白單抗、特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白單抗或多抗IgG和兔抗鼠IgG稀釋至1.0 mg/mL,并分別放于忙存池；利用B1jet Quanti 3000以1.0 mL/cm分別將抗PRV gE蛋白單抗、gB蛋白單抗或PRV多抗IgG溶液和兔抗鼠IgG溶液噴點(diǎn)于檢測(cè)膜中央，形成強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl、疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C印跡，檢測(cè)線與質(zhì)控線相距0.5 cm ;置42°C干燥箱30 min或室溫自然干燥；將檢測(cè)膜置塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0038](7)結(jié)合墊的制備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長(zhǎng)條，置于XYZ 3000噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，并以壓條固定；取ImL 膠體金標(biāo)記物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)疊氮鈉的 20 mmol/L 硼酸鈉溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm將抗膠體金標(biāo)記物溶液噴點(diǎn)于玻璃棉；置50°C干燥箱30 min干燥；將膠金墊置塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0039](8)樣品墊的制備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長(zhǎng)條，以將含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)疊氮鈉的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉條；置50°C干燥箱30 min干燥；將樣品墊置塑料袋，加干燥劑RT密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0040](9)吸水墊的制備
將玻璃棉切成2.5X30 cm2的長(zhǎng)條，將吸水墊置塑料袋，加干燥劑RT密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0041](10)支撐板的制備
將雙面膠貼于PVC支撐板，切成7.5X30 Cm2的長(zhǎng)板，制備支撐板。
[0042](11)試紙的組裝
利用LM5000試紙裝配儀或手工將上述材料裝配成試紙板。先將檢測(cè)膜粘貼于支撐板中央，然后將膠金墊和樣品墊依次粘貼于檢測(cè)膜的樣品端，各層間重疊I mm?2 mm，再將吸水墊粘貼于檢測(cè)膜的另一端，與檢測(cè)膜重疊I mm?2 mm，在樣品端以白色塑膠膜包裹樣品墊和膠金墊，塑膠膜上印有檢測(cè)方向及檢測(cè)溶液上限標(biāo)記，在手柄端以藍(lán)色塑膠膜包裹吸水墊。
[0043](12)切割與包裝
利用CM4000切割儀將裝配好的試紙板切成寬度為0.3 cm的試紙條，將試紙條分裝入塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存。
[0044]( 13)豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙的實(shí)施結(jié)構(gòu)
參見圖1，圖2，圖中，I為支撐板用不吸水薄片條，實(shí)施中可采用塑膠薄片條或采用不吸水的硬質(zhì)紙片材，反應(yīng)試劑載體吸附層由2，3，4，5，組合而成，從樣品端2開始，到手柄端5依次粘貼在支撐層I上面；其中2為樣品端樣品墊，實(shí)施中可使用玻璃纖維棉簡(jiǎn)稱玻璃棉，3為吸附膠體金標(biāo)記識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒株gB蛋白單克隆抗體mAbl的金標(biāo)玻璃纖維棉，可采用精制玻璃纖維棉，簡(jiǎn)稱為金標(biāo)墊，4為檢測(cè)膜，實(shí)施中可采用硝酸纖維素膜，5為手柄端吸水墊，采用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，試紙條總長(zhǎng)8 cm,寬度0.4cm，6為用特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株但不與疫苗毒株反應(yīng)的gE蛋白單克隆抗體mAb2在硝酸纖維素膜上印制的強(qiáng)毒檢測(cè)線印跡“ I ”，7為特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白單克隆抗體mAb3或抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl在硝酸纖維素膜上印制的疫苗毒檢測(cè)線印跡“ I ”，8為兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA在硝酸纖維素膜上印制的質(zhì)控線印跡“ I ”，在檢測(cè)膜上的強(qiáng)毒檢測(cè)線印跡、疫苗毒檢測(cè)線印跡和質(zhì)控線印跡組合排列為“ III”。9為保護(hù)膜，覆蓋在玻璃棉及金標(biāo)玻璃棉的保護(hù)膜為9-1，覆蓋在吸水層濾紙上的保護(hù)膜為9-2。在玻璃棉和金標(biāo)玻璃棉交界處對(duì)應(yīng)位置的白色保護(hù)膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm處的保護(hù)膜上印有一條標(biāo)記線10,在標(biāo)記線10右邊印有箭頭和Max字樣，手柄端保護(hù)膜可用黃色或其它顏色，2，3，4，5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
[0045]( 14)豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙實(shí)施檢測(cè)反應(yīng)原理
當(dāng)豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙樣品端插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸作用帶動(dòng)待檢PRV抗原及金標(biāo)抗體mAbl —起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲透到濾紙層中，在擴(kuò)散過程中金標(biāo)抗體mAbl與待檢PRV強(qiáng)毒株或疫苗毒株抗原相結(jié)合，形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，PRV強(qiáng)毒株的金標(biāo)復(fù)合物可同時(shí)與檢測(cè)膜上的強(qiáng)毒檢測(cè)印跡mAb2和疫苗毒檢測(cè)印跡mAb3結(jié)合，生成紅棕色“ I I ”標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體不能與檢測(cè)印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在檢測(cè)膜上與質(zhì)控印跡中的PAb2或SPA結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記“ I ”，兩種標(biāo)記組合疊加，形成三條紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“ I I I”，表示樣品中含有豬偽狂犬強(qiáng)毒；而？1^疫苗毒株的金標(biāo)復(fù)合物不能與檢測(cè)膜上的強(qiáng)毒檢測(cè)印跡mAb2結(jié)合，只能與疫苗毒檢測(cè)印跡mAb3結(jié)合，生成紅棕色“ I ”標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體不能與檢測(cè)印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在檢測(cè)膜上與質(zhì)控印跡中的pAb2或SPA結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記“ I ”，兩種標(biāo)記組合疊加，形成兩條紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“ I I ”，表示樣品中只含有豬偽狂犬疫苗毒；當(dāng)樣品中不含豬偽狂犬病毒抗原時(shí)，沒有金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物形成，不能與強(qiáng)毒檢測(cè)印跡和疫苗毒檢測(cè)印跡結(jié)合，則生成陰性標(biāo)記“ I ”。如果檢測(cè)膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。
[0046](15)豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙檢測(cè)實(shí)例操作方法
(15.1)檢測(cè)樣品溶液的制備:采集待檢豬拭子(咽拭和肛拭)、病(死)豬組織、糞便和疫苗等不同檢測(cè)樣本，加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單混懸或研磨
(15.2)試紙檢測(cè):將豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙樣品端浸入待檢溶液10 S?20 S ;取出試紙水平放置5 min?10 min觀察結(jié)果。
[0047](15.3)檢測(cè)結(jié)果判定:試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(強(qiáng)毒檢測(cè)線、疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“III ”為PRV強(qiáng)毒陽(yáng)性，表示待檢樣品中含有PRV強(qiáng)毒抗原；兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I ”為PRV疫苗毒陽(yáng)性，表示待檢樣品中含有PRV疫苗毒抗原；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線)“ I ”為PRV陰性，表示待檢樣品未檢出PRV抗原；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0048]實(shí)施例一，豬偽狂犬強(qiáng)毒感染快速診斷，采集病(死)豬的病變組織，包括腦、肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒等，以1:5或1:10加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單研磨，制備待檢溶液，以豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙按(15)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，鑒別診斷病(死)豬強(qiáng)毒感染或疫苗免疫。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(強(qiáng)毒檢測(cè)線、疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I I”為PRV強(qiáng)毒陽(yáng)性，表示待檢豬為PRV強(qiáng)毒感染；兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I ”為PRV疫苗毒陽(yáng)性，表示待檢豬為PRV疫苗免疫；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線)“ I ”為PRV陰性，表示待檢豬無(wú)強(qiáng)毒感染或疫苗免疫；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0049]實(shí)施例二，生豬的豬偽狂犬病毒檢驗(yàn)檢疫，采集生豬拭子(咽拭和肛拭)或糞便，以1:5或1:10加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單混懸，制備待檢溶液，以豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙按(15)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，鑒別檢測(cè)生豬的強(qiáng)毒感染或疫苗免疫情況。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(強(qiáng)毒檢測(cè)線、疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I I ”為PRV強(qiáng)毒陽(yáng)性，表示待檢生豬或環(huán)境為PRV強(qiáng)毒污染；兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I ”為PRV疫苗毒陽(yáng)性，表示待檢生豬或環(huán)境無(wú)PRV強(qiáng)毒污染，為PRV疫苗免疫；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線)“ I ”為PRV陰性，表示待檢生豬無(wú)強(qiáng)毒感染或疫苗免疫；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0050]實(shí)施例三,豬偽狂犬疫苗毒疫苗的質(zhì)量檢測(cè)，以1:5或1:10加適量PBS或水溶解豬偽狂犬疫苗毒活疫苗等，制備待檢疫苗溶液，以豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒株鑒別檢測(cè)試紙按(15)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，檢測(cè)豬偽狂犬疫苗毒疫苗的病毒含量和鑒別檢測(cè)疫苗的強(qiáng)毒污染情況。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(強(qiáng)毒檢測(cè)線、疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I I ”為PRV強(qiáng)毒陽(yáng)性，表示待檢疫苗為PRV強(qiáng)毒污染；兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測(cè)線和質(zhì)控線)“ I I ”為PRV疫苗毒陽(yáng)性，表示待檢疫苗無(wú)PRV強(qiáng)毒污染，疫苗毒檢測(cè)線的顯色強(qiáng)度與PRV疫苗含量成正比；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線)“ I ”為PRV陰性，表示待檢疫苗無(wú)PRV強(qiáng)毒污染，同時(shí)也不含疫苗毒；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒和疫苗毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，其特征是:金標(biāo)墊吸附膠體金標(biāo)記抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAbl，檢測(cè)膜的強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl為抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體mAb2印跡“ | ”，疫苗毒檢測(cè)線T2為抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl或gB蛋白單克隆抗體mAb3印跡“ | ”，質(zhì)控線C為抗小鼠IgG抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA印跡“ I ”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別檢測(cè)試紙，其特征是:豬偽狂犬強(qiáng)毒感染時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl，疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C三條紅色條帶“ I I |”，豬偽狂犬疫苗毒免疫時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)疫苗毒檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C兩條紅色條帶“ I I ”，無(wú)豬偽狂犬病毒則只顯現(xiàn)質(zhì)控線C 一條紅色條帶“丨”。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別檢測(cè)試紙，其特征是:單克隆抗體mAbl和mAb3均特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株和疫苗毒疫苗株，分別識(shí)別豬偽狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位，單克隆抗體mAb2特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株gE蛋白，但不與疫苗毒株反應(yīng)。
4.根據(jù)要求I或3所述的鑒別檢測(cè)試紙，其特征是:鑒別檢測(cè)試紙的豬偽狂犬病毒反應(yīng)譜廣，疫苗毒檢測(cè)線T2可檢測(cè)豬偽狂犬疫苗株以及多數(shù)流行強(qiáng)毒株，強(qiáng)毒檢測(cè)線Tl可檢測(cè)多數(shù)豬偽狂犬病毒流行強(qiáng)毒株，可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬偽狂犬病毒主要流行毒株與疫苗株的鑒別檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK104459144SQ201410763138
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】喬松林, 楊繼飛, 李青梅, 郭軍慶, 邢廣旭, 柴書軍, 萬(wàn)博, 解偉濤, 王寅彪, 劉肖, 鄧瑞廣, 張改平 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院