一株布魯氏菌弱毒株及其疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株布魯氏菌弱毒株及其疫苗。該疫苗株通過抗菌素與A因子血清相結合的馴化和篩選技術，篩選出一株粗糙型牛種布魯氏菌弱毒株RA343。該粗糙型弱毒株的安全性顯著提高，但仍保留了對布魯氏菌病良好的免疫效果。利用該弱毒株制備成布魯氏菌病疫苗，將改變布魯氏菌疫苗免疫動物與野毒株感染動物難以區(qū)分的現(xiàn)狀，并有效提高現(xiàn)有疫苗的安全性。
【專利說明】一株布魯氏菌弱毒株及其疫苗
[0001]【技術領域】本發(fā)明涉及一株布魯氏菌弱毒株及其疫苗。該疫苗為牛、羊和豬對布魯氏菌病的預防用活疫苗，屬獸用生物制品領域。
技術背景
[0002]布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布魯氏菌(Brucella)引起的以流產和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖和生產性能具有嚴重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的目標之一。目前全世界范圍內消除該病的主要方法是撲殺與免疫相結合，對布病發(fā)生相對比較嚴重的中國，由于撲殺的成本高，疫苗預防成為本病主要控制手段。
[0003]根據布魯氏菌表型的差異，可將布魯氏菌分為光滑型(S)和粗糙型(R)兩類，目前在我國使用的布病活疫苗均為光滑型菌株，其免疫帶來的主要問題是使用后無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染的動物，這在很大程度上限制了布魯氏菌疫苗的使用和推廣，也給布病的有效防治和清除帶來了一定的難度。
[0004]雖然布魯氏菌存在兩種不同的表型，在凝集類抗體水平上無交叉反應，但卻具有良好的交叉保護性，并且不同種來源的布魯氏菌相互之間同樣存在交叉保護能力。如果用粗糙型布魯氏菌疫苗免疫的動物，其血清只與粗糙型抗原發(fā)生凝集反應，而與光滑型血清不反應，以此可以區(qū)分疫苗生產用菌株和野毒株?；谏鲜鲈颍藗儗Υ植谛筒剪斒暇呙缰甑难邪l(fā)從未間斷過。到目前為止，成功開發(fā)出具有良好免疫原性的粗糙型布魯氏菌疫苗株卻鮮有報道。
[0005]最早使用過的粗糙型布魯氏菌疫苗是用45/20菌株制備的，但該菌株極不穩(wěn)定，經常會出現(xiàn)從R型到S型的變異，造成毒力返強，因而該疫苗已基本不再使用。90年代美國科學家通過利福平誘變獲得了粗糙型布魯氏菌RB51菌株，該菌株具有良好的免疫力，已在美國和拉美的多個國家廣泛使用。但其安全性仍有爭議。
[0006]已有的研究證實布魯氏菌細胞壁脂多糖(LPS)中的O鏈組成決定了其光滑型或粗糙型的表型，O鏈的某些成分缺失，會導致菌株由光滑型變成粗糙型。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個與布魯氏菌光滑型表型相關的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。但到目前為止，國內外尚無轉基因獲得的重組布魯氏菌弱毒株及其疫苗被批準和應用。

【發(fā)明內容】

[0007] 2007—2012年間，本實驗室陸續(xù)從我國不同省份和地區(qū)牛、羊、犬和鹿等動物體內分離到牛種布魯氏菌41株，羊種布魯氏菌74株，犬種布魯氏菌9株。研究過程中，我們初步發(fā)現(xiàn)了一株牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)分離株，其毒力介于強毒和疫苗毒之間，專利 申請人:已對其進行了全面的生化檢定，并分別用小鼠和豚鼠測定了其毒力。結果發(fā)現(xiàn)其毒力介于強毒和弱毒之間，測定為中等毒力布魯氏菌，命名為AbortUS343。本發(fā)明本發(fā)明采用低濃度氯霉素(lug/ml)與光滑型牛種布魯氏菌抗血清(A因子血清)相結合的誘導方法，篩選獲得了一株遺傳穩(wěn)定的粗糙型布魯氏菌命名為RA343。RA343株安全性高，免疫效果好，用該菌制備的疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分。
[0008]本發(fā)明的技術方案
[0009]1.一株牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)弱毒菌株RA343,其特征在于采用氯霉素與A因子血清相結合的篩選方法，篩選獲得了一株不干擾布病臨床診斷的粗糙型牛種布魯氏菌，用該菌制備的疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分，牛種布魯氏菌(Brucella abortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號為:CGMCC N0.8886。
[0010]2.一種布魯氏菌活疫苗的生產方法，其特征在于用胰大豆肉湯作為布魯氏菌CGMCC N0.8886株的培養(yǎng)基；培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的按1%~2%接入布魯氏菌CGMCCN0.8886株種子菌液，37°C ，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入獸用生物制品常用的凍干保護劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經冷凍真空干燥，即成為粗糙型RA343株牛種布魯氏菌病疫苗。
[0011]本發(fā)明是通過以下步驟實現(xiàn)的:
[0012]1.篩選中等毒力布魯氏菌分離株從41株牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)田間分離株中，通過有限稀釋法和菌落結晶紫染色獲得10株形態(tài)穩(wěn)定的候選株。再參照《獸用生物制品規(guī)程》(中華人民共和國農業(yè)部編.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程.2000年版，化學工業(yè)出版社，2001)中布魯氏菌病活疫苗種毒毒力測定方法，采用豚鼠脾臟含菌量測定10株候選菌株的毒力，篩選毒力適中的布魯氏菌(A343株)作為誘導的候選株。
[0013]2.對候選分離株進行誘導和馴化首先將A343在含低濃度氯霉素(I μ g/ml)的TSA培養(yǎng)基上傳代，共傳了 35代，其結果是菌落結晶紫染色的陽性率由A343 (FO)低于1%到A343(F40)6%左右。然后用光滑型牛種布魯氏菌抗血清(A因子血清)進一步馴化，將不與A因子血清發(fā)生凝集的細菌反復傳代，待該細菌的粗糙型菌落比例達90%左右時，改用雙倍效價的A因子血清(牛種布魯氏菌特異性血清，本實驗室制備和保存)繼續(xù)誘導。最終將獲得的遺傳穩(wěn)定的粗糙型布魯氏菌，命名為RA343株。
[0014]3.對粗糙型布魯氏菌RA343進行詳細的菌種檢定包括形態(tài)和生化特性，血清學和PCR反應特異性，以及對豚鼠的毒力。
[0015]4.制備疫苗按布病疫苗的經典方法制備粗糙型布魯氏菌病活疫苗，用于預防動物布魯氏菌病。
[0016]發(fā)明的詳細描述
[0017]1.中等毒力布魯氏菌分離株的篩選
[0018](I)根據形態(tài)和穩(wěn)定性初步篩選將本實驗室自2007年-2012年從田間分離的牛種布魯氏菌41株，通過有限稀釋法培養(yǎng)單個菌落，挑選菌落大小均勻，結晶紫染色菌落陽性率低于1%的候選布魯氏菌10株，用于豚鼠測毒。
[0019](2)通過對測定豚鼠毒力再次篩選參照《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》中布魯氏菌疫苗種毒毒力測定方法，采用豚鼠脾臟含菌量測定10株候選菌株的毒力，將10株布魯氏菌分別在TSA平板上增殖培養(yǎng)后，收集菌體，用無菌生理鹽水將各細菌濃度調節(jié)到lX109CFU/ml。取350~400g雌性豚鼠50只，分為10組，5只/組，對應10株候選菌。將候選菌株分別以Iml/只腹股溝皮下注射各試驗組豚鼠，14日后觀察臟器病變情況，同時取脾臟，混合稱重，制成乳劑，接種TSA平板，根據細菌生長數量計算每I克脾臟含菌量。結果只有I株(A343)分離株毒力最低，為1.2父10\^/^，其余9株均在6父10\^/^以上。本發(fā)明中選取A343作為本發(fā)明中誘導的原始菌種，標注為A343(F0)。
[0020]2.A343株的誘導和馴化
[0021](I)氯霉素的誘導將篩選出的A343株在含氯霉素(I μ g/ml)的TSA培養(yǎng)基上傳代，在往下一代傳代時，采用有限稀釋法進行，并同時對平板上的菌落進行結晶紫染色。選取結晶紫染色著色程度最明顯的菌落繼續(xù)傳代，如果未出現(xiàn)結晶紫染色陽性的菌落，則隨機挑取。以此方法共傳了 35代，其結果是菌落結晶紫染色的陽性率由A343 (FO)低于1%到A343(F40)6% 左右。
[0022](2)光滑型牛種布魯氏菌抗血清(A因子血清)的馴化挑取單個A343(F40)菌落接種到TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，用無菌生理鹽水調節(jié)菌液濃度約20~30億CFU/ml (此時0D600 = 0.1)。取0.5ml菌液加入0.5ml A因子血清(無菌過濾，含2個凝集單位/ml)，充分混勻后，37°C靜置孵育2h，再轉移到4°C冰箱靜置12h。輕吸上層未凝集的菌液20 μ 1，轉移接種到新鮮TSB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復誘導篩選30代。每5代通過有限稀釋法獲得單個菌落，并進行菌落結晶紫染色，挑取結晶紫著色的單菌落繼續(xù)傳代。到第30代，即A343(F35+30)，A343結晶紫染色能著色的菌落比例約90%。將A因子血清效價調整為4個凝集單位/ml，按上述方法繼續(xù)誘導。對第6代(總傳代為第71代)菌落進行結晶紫染色，此時所有菌落全能著色。在此基礎上仍用4個凝集單位/ml的A因子血清繼續(xù)誘導6代(總傳代為第77代)，將獲得的遺傳穩(wěn)定的粗糙型布魯氏菌命名為牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)RA343 株。 [0023]3.粗糙型布魯氏菌RA343株菌種檢定
[0024](I)形態(tài)和生化特性RA343株菌菌落邊緣整齊、圓潤，露滴狀，斜光照射，逆光觀察微帶藍色乳光。染色形態(tài)為球桿菌，單個散在，不形成芽孢和莢膜。菌體大小在0.3~
0.6μπι之間。革蘭氏染色為陰性。該菌的生長不依賴于CO2，能在含硫瑾和堿性復紅的培養(yǎng)基上生長，H2S試驗強陽性。
[0025](2)特異性
[0026]I)血清學特異性以RA343株菌的培養(yǎng)物制成抗原，與光滑型布魯氏菌陽性血清(中監(jiān)所，201101批)應不出現(xiàn)凝集，與粗糙型血清(本實驗室制備)應出現(xiàn)凝集。
[0027]2)PCR特異性合成如下4條引物(序列1、序列2、序列3和序列4)，將其配成引物混合儲存液，各引物濃度均為25 μ M0
[0028]Fer1:5， -GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’
[0029]Rer1:5，-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3，
[0030]Fabortus: 5，-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3，
[0031 ] R15711:5 ’ -TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3 ’
[0032]模板:以RA343株菌的培養(yǎng)菌落或試劑盒提取RA343株菌的基因組DNA。
[0033]PCR反應體系:50μ L的反應體系中，含5 μ L10XBuffer，8 μ L2.5mMdNTPs，混合引物儲存液2 μ L，Taq酶2U，模板DNAl μ L (或挑取菌落少許)。
[0034]PCR 反應程序:95V 5min 后，按 94°C Imin、60。。1.5min、72°C 1.5min 進行 28 個循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0035]結果:擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，應出現(xiàn)2條特異性PCR條帶，大小分別為178bp和494bp (見圖1)。
[0036](3)毒力用無菌生理鹽水將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48_72h的RA343株菌培養(yǎng)物洗下，稀釋成每毫升含活菌10億CFU的懸液，腹股溝皮下注射體重350~400g的豚鼠(Hartley品系)5只，Iml/只。經14~15日后剖殺，取脾臟，混合稱重，制成乳劑，接種TSA平板，根據其生長的菌落數，計算每克脾臟的含菌量，結果脾臟含菌為8.9 X IO3CFU,不超過20萬CFU (強毒株的判斷標)。
[0037](4)粗糙型特性熱凝集試驗、吖啶黃凝集試驗、菌落結晶紫染色試驗結果符合粗糙型布魯氏菌的特點，即熱凝集試驗陽性，吖啶黃凝集試驗陽性，能被結晶紫染色。
[0038](5)安全檢驗將RA343活菌用生理鹽水稀釋成Iml含活菌10億CFU，皮下注射體重18~20g的小白鼠5只，每只0.1ml,觀察6日，均全部健活。
[0039](6)免疫原性用生理鹽水將RA343稀釋成每毫升含50億CFU菌的懸液，皮下注射體重350~400g的豚鼠10只，每只0.1mlo 30日后,用3個最小感染量的強毒牛種布魯氏菌2308株菌(即為CVCC788株，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏和供應)約30個CFU接種攻毒，攻毒后30天剖殺，取脾臟搗碎作布魯氏菌分離培養(yǎng)，80%以上的豚鼠均未分離到細菌。
[0040](7)遺傳穩(wěn)定性RA343在TSA培養(yǎng)基上傳30代，每5代對其形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、粗糙型特性、毒力、PCR特異性、安全性及免疫原性進行檢驗，結果均未發(fā)生改變(表I)。
[0041]表1布魯氏菌RA343株遺傳穩(wěn)定性測定結果
[0042]
【權利要求】
1.一株牛種布魯氏菌弱毒菌株RA343，其特征在于采用氯霉素與A因子血清相結合的篩選方法，篩選獲得了一株不干擾布病臨床診斷的粗糙型牛種布魯氏菌，用該菌制備的疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分，牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號為=CGMCCN0.8886。
2.—種布魯氏菌活疫苗的生產方法,其特征在于用胰大豆肉湯作為布魯氏菌CGMCCN0.8886株的培養(yǎng)基；培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的按I %~2%接入布魯氏菌CGMCCN0.8886株種子菌液，37°C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入獸用生物制品常用的凍干保護劑，充分混勻、 分裝疫苗瓶中后經冷凍真空干燥，即成為粗糙型RA343株牛種布魯氏菌病疫苗。
【文檔編號】A61P31/04GK103981139SQ201410240895
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權日:2014年6月3日
【發(fā)明者】丁家波, 朱良全, 王芳, 馮忠武, 蔣卉, 毛開榮, 陳光華, 王楠, 寧宜寶, 李慧嬌, 王忠田, 張廣川, 程君生 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所