偽狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種偽狂犬病毒基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：編碼偽狂犬病毒gI蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序列、以及編碼偽狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了一種偽狂犬病毒基因缺失弱毒株的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的偽狂犬病毒基因缺失弱毒株，對(duì)偽狂犬病毒有較好的免疫保護(hù)效果，適于作為防治偽狂犬病的疫苗候選株。
【專利說明】偽狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種偽狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制 備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊 髓炎為主要特征的一種烈性傳染病。PRV能感染多種宿主，但豬是該病毒主要的天然宿主、 貯存者和傳播者。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳 仔豬高死亡率，及種豬不育。PRV屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，其基因組為線狀雙鏈 DNA，長約150kb，由長獨(dú)特區(qū)（UL)、短獨(dú)特區(qū)（US)及US兩側(cè)的重復(fù)序列所組成，編碼70多 種蛋白。病毒粒子由核衣殼、外殼及囊膜三層組成。核衣殼是由6種衣殼蛋白包裹病毒基 因組形成的二十面體結(jié)構(gòu)；外殼介于核衣殼與囊膜層間，由14種蛋白組成；囊膜由15種蛋 白鑲嵌于雙層脂膜組成，其中糖蛋白11種。病毒表面蛋白決定了病毒的細(xì)胞嗜性，也是主 要的保護(hù)性抗原。一些重要的病毒基因，如tk，對(duì)病毒毒力存在顯著影響，其缺失能使病毒 致弱。
[0003] 偽狂犬最早發(fā)生于美國，我國于上世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了 PRV，60年代 初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒流行，至今偽狂犬病毒仍在我國廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國豬 群的健康，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。豬感染PRV后，有的呈隱性感染，但長期攜帶病毒；出現(xiàn) 臨床癥狀的耐過豬也能成為病毒的攜帶者，成為傳染源，這增加了 PRV防治的難度。為了控 制PRV，我國豬場(chǎng)自上世紀(jì)末開始廣泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRVBartha株活疫苗，豬偽狂 犬發(fā)病率明顯下降。但自2011年以來，許多使用PRV活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了母豬 產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等偽狂犬的臨床癥狀。童武、彭金美等人也分 別從發(fā)病豬中分離到了 PRV野毒株，并通過基因序列分析與抗體中和試驗(yàn)證實(shí)了分離的野 毒株較疫苗株和經(jīng)典毒發(fā)生了較大的變異。這表明，我國豬場(chǎng)中出現(xiàn)了 PRV變異株，而目前 使用的商品化疫苗對(duì)變異株的保護(hù)效果差，導(dǎo)致了我國豬場(chǎng)偽狂犬發(fā)病率的抬頭。為了有 效控制PRV變異株的流行，需要開發(fā)更為高效的PRV疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決目前國內(nèi)出現(xiàn)PRV變異株，而現(xiàn)有商品化PRV疫苗對(duì)變異株保護(hù)效 果差，亟需開發(fā)新的PRV疫苗的技術(shù)問題，提供一種偽狂犬病毒基因缺失弱毒株，該基因缺 失弱毒株對(duì)PRV變異株具有較好的免疫保護(hù)效果，接種2周齡內(nèi)仔豬，不出現(xiàn)PRV臨床癥 狀，安全性高，適于作為防治偽狂犬病的疫苗候選株。
[0005] 此外，還需要提供一種上述偽狂犬病毒基因缺失弱毒株的制備方法和應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了 一種偽狂犬病毒弱毒株，該弱毒株是偽狂犬病毒的 基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：編碼偽狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸 (SEQ ID NO. 2)的核苷酸序列、以及編碼偽狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸（SEQ ID NO. 3)的核苷酸序列。
[0008] 優(yōu)選的，所述弱毒株缺失的基因序列包括：偽狂犬病毒gl基因第594-1101位堿基 的核苷酸序列、以及偽狂犬病毒gE基因第1-1212位堿基的核苷酸序列。
[0009] 更優(yōu)選的，所述弱毒株缺失的基因序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。由SEQ ID NO. 1缺失基因序列可知，本發(fā)明的偽狂犬病毒弱毒株，包含偽狂犬病毒gl基因的第1至 593位堿基和gE基因的第1213至1740位堿基，不含有偽狂犬病毒基因組中g(shù)l基因的第 594至1101位堿基、gE基因的第1至1212位堿基、以及gl基因和gE基因之間的103bp連 接序列，即不含有偽狂犬病毒基因組中g(shù)l基因的第594位堿基至gE基因的1212位堿基間 的DNA序列（共計(jì)缺失1823bp，如SEQ ID NO. 1所示）。在508bp (第594至1101位堿基） 的gl基因缺失序列中，第1個(gè)堿基即gl基因第594位的"C"為編碼脯氨酸（P)的第三個(gè) 堿基，其余507個(gè)堿基的最后3個(gè)堿基是終止密碼子。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組載體，該重組載體包含偽狂犬病毒gl基因 和gE基因的部分序列，其中不包含以下基因序列：編碼偽狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨 基酸的核苷酸序列、以及編碼偽狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述重組載體還包含CMV啟動(dòng)子控制下的綠色熒光蛋白基因（EGFP基 因)，用于篩選基因缺失的重組偽狂犬病毒。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種偽狂犬病毒弱毒株的制備方法，包括以下步 驟：
[0013] (1)構(gòu)建上述重組載體，該重組載體還包含有EGFP熒光標(biāo)記基因；
[0014] ⑵提取偽狂犬病毒總DNA，將該總DNA與步驟⑴的重組載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得 含EGFP熒光標(biāo)記的重組偽狂犬病毒；
[0015] (3)構(gòu)建上述重組載體，該重組載體不包含EGFP熒光標(biāo)記基因；
[0016] (4)提取步驟（2)獲得的重組偽狂犬病毒的總DNA，將該總DNA與步驟（3)的重組 載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得不包含EGFP突光標(biāo)記的重組偽狂犬病毒，該重組偽狂犬病毒即為偽
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種疫苗組合物，所述組合物包含與佐劑或藥用 載體混合的偽狂犬病毒弱毒株。
[0018] 所述疫苗組合物適于滴鼻、注射接種。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述偽狂犬病毒弱毒株在制備預(yù)防或治療偽 狂犬病的疫苗中的應(yīng)用。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分上述偽狂犬病毒弱毒株與野毒株感染的 檢測(cè)試劑盒，包含：針對(duì)SEQ ID NO. 1所示缺失基因序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)。利用設(shè)計(jì)合成的引 物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能區(qū)分鑒別出本發(fā)明的偽狂犬病毒基因缺失弱毒株與野毒株。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分上述偽狂犬病毒弱毒株與野毒株感染的 檢測(cè)試劑盒，包含偽狂犬病毒gE蛋白抗體。通過檢測(cè)感染豬體的gE抗體，能夠區(qū)分鑒別出 本發(fā)明的偽狂犬病毒基因缺失弱毒株與野毒株的感染。
[0022] 本發(fā)明的偽狂犬病毒基因缺失弱毒株，接種11日齡仔豬，不出現(xiàn)臨床癥狀，安全 可靠，能作為有效防治偽狂犬病的疫苗候選株。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的pBIE-GFP質(zhì)粒構(gòu)建路線圖；
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1改造好的pXEGFP-C3質(zhì)粒Nhe I和Xho I雙酶切鑒定結(jié) 果圖；
[0026] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1左右重組臂的PCR結(jié)果圖；
[0027] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的pBIE-GFP質(zhì)粒用Sac I和Nhe I、Nhe I和Xba I、 Xba I和Xho I分別進(jìn)行雙酶切鑒定結(jié)果圖；
[0028] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體用不同的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后24h 的熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；
[0029] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例2PRV JS-2012-AgI/gE-EGFP毒在純化過程中不同代次在 熒光顯微鏡下的結(jié)果圖；
[0030] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒不同接毒劑量下的蝕斑形 態(tài)；
[0031] 圖 8 是本發(fā)明實(shí)施例 2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP 毒用 gBup/gBdown 引物的 PCR 鑒定結(jié)果圖；
[0032] 圖 9 是本發(fā)明實(shí)施例 2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP 毒用 gEup/gEdown 引物的 PCR 鑒定結(jié)果圖；
[0033] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用glU/gID引物的PCR鑒 定結(jié)果圖；
[0034] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用gEU/gED引物的PCR鑒 定結(jié)果圖；
[0035] 圖12是本發(fā)明實(shí)施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用glU/gED引物的PCR鑒 定結(jié)果圖；
[0036] 圖13是本發(fā)明實(shí)施例3pBIE質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖；
[0037] 圖14是本發(fā)明實(shí)施例3PRV JS-2012- Λ gl/gE毒接種細(xì)胞后在熒光及自然光下 的病變圖；
[0038] 圖15是本發(fā)明實(shí)施例3PRV JS-2012- Λ gl/gE毒用glU/gED弓丨物的PCR鑒定結(jié) 果圖；
[0039] 圖16是本發(fā)明實(shí)施例4PRV JS-2012- Λ gl/gE疫苗毒及其親本毒接種仔豬后體 溫的變化圖；
[0040] 圖17是本發(fā)明實(shí)施例4PRV JS-2012- Λ gl/gE疫苗毒及其親本毒接種仔豬后的 死亡結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京： 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。
[0042] 由于現(xiàn)有的豬偽狂犬病毒疫苗不能對(duì)目前流行的偽狂犬病毒變異毒株提供較好 的免疫保護(hù)效果，因此有必要研制PRV新型疫苗。本發(fā)明通過將偽狂犬病毒強(qiáng)毒株P(guān)RV JS-2012的gl基因及gE基因的部分基因進(jìn)行缺失，獲得毒力致弱的偽狂犬病毒基因缺失疫 苗PRV JS-2012-AgI/gE。該疫苗對(duì)仔豬具有較好的安全性。有望作為基因工程標(biāo)記弱毒 疫苗應(yīng)用于對(duì)偽狂犬病毒變異株的防治。
[0043] 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的實(shí)驗(yàn)材料如下：
[0044] 病毒和細(xì)胞：BHK-21細(xì)胞（美國細(xì)胞保藏中心ATCC，保藏號(hào)為：CCL-10)， Vero細(xì)胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，保藏號(hào)為：GN010)，偽狂犬病毒 JS-2012株（本實(shí)驗(yàn)室保存；發(fā)表文章見：童武，張青占，鄭浩，劉飛，姜一峰，單同領(lǐng)，周艷 君，童光志.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013， 21(3) : 1-7)。
[0045] 質(zhì)粒與菌株：pEGFP-Nl、pEGFP_C3和pBluescript SK(+)購自上?；羯锛夹g(shù) 有限公司；大腸桿菌DH5ci感受態(tài)；購自北京天根。
[0046] 其他試劑：MEM 和 DMEN, Invitrogen 公司產(chǎn)品；Asel、SacI、Xhol、Seal 和 T4DNA連接酶，NEB公司產(chǎn)品；Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑，promega公司產(chǎn)品；DNA片段小量 快速回收試劑盒，Omega 公司；2XGC Buffer II，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq， DL-15000，DL-2000DNA Marker購自TakaRa;其它化學(xué)試劑均是進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。
[0047] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：
[0048] BHK-21細(xì)胞在含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁長滿單層后， 棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，并以PBS洗一次，以0. 25%的胰酶將細(xì)胞消化下，加入新的含有 10%FBS的MEM培養(yǎng)基，以1:8的比例分種于細(xì)胞瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0049] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，Vero細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：
[0050] Vero細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁長滿單層后， 棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，并以PBS洗一次，以0. 25%的胰酶將細(xì)胞消化下，加入新的含有 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，以1:6的比例分種于細(xì)胞瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0051] 實(shí)施例1PRV JS-2012gI/gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pBIE-GFP的構(gòu)建
[0052] 通過PCR方法，擴(kuò)增出位于PRV JS-2012基因組中121632至123031位堿基和 124854至126372位堿基的兩條片段，用作同源重組的左、右重組臂。同時(shí)，通過內(nèi)切酶酶 切，從PEGFP-C3質(zhì)粒中切出CMV啟動(dòng)子-EGFP基因片段，從pEGFP-Nl質(zhì)粒中切出SV40po 1 yA 信號(hào)序列片段，并將左重組臂-CMV啟動(dòng)子-EGFP基因-SV40polyA信號(hào)序列-右重組臂依 序組裝于pBluescript SK(+)載體中，獲得了重組轉(zhuǎn)移載體pBIE-GFP。具體構(gòu)建過程如下 (參見圖1):
[0053] 1. 1引物設(shè)計(jì)
[0054] 根據(jù)PRV JS-2012株的全基因組序列，用01ig〇6. 0軟件設(shè)計(jì)了 2對(duì)引物PRELF/ PRELR與PRERF/PRERR(見表1)，用于來擴(kuò)增同源重組左臂與右臂，分別在左重組臂的前后 兩端加 Sac I和Ase I酶切位點(diǎn)，在右重組臂的前端加了 EcoR V和Afl II酶切位點(diǎn)，后 端加了 Xho I酶切位點(diǎn)。左重組臂（PRELF/PRELR)的長度為1416bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，右重組臂（PRERF/PRERR)的長度為1543bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所 /_J、1 ο
[0055] 表1擴(kuò)增同源重組臂的引物
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種偽狂犬病毒弱毒株，其特征在于，該弱毒株是偽狂犬病毒的基因缺失弱毒株，其 缺失的基因序列包括：編碼偽狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序列、以及編 碼偽狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序 列包括：偽狂犬病毒gl基因第594-1101位堿基的核苷酸序列、以及偽狂犬病毒gE基因第 1-1212位堿基的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序 列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
4. 一種重組載體，其特征在于，該重組載體包含偽狂犬病毒gl基因和gE基因的部分 序列，其中不包含以下基因序列：編碼偽狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序 列、以及編碼偽狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
5. -種偽狂犬病毒弱毒株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 構(gòu)建權(quán)利要求4所述重組載體，該重組載體還包含有EGFP熒光標(biāo)記基因； (2) 提取偽狂犬病毒總DNA，將該總DNA與步驟（1)的重組載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得含 EGFP熒光標(biāo)記的重組偽狂犬病毒； (3) 構(gòu)建權(quán)利要求4所述重組載體，該重組載體不包含EGFP熒光標(biāo)記基因； (4) 提取步驟（2)獲得的重組偽狂犬病毒的總DNA，將該總DNA與步驟（3)的重組載體 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得不包含EGFP突光標(biāo)記的重組偽狂犬病毒，該重組偽狂犬病毒即為偽狂犬
6. -種疫苗組合物，其特征在于，所述組合物包含與佐劑或藥用載體混合的權(quán)利要求 1至3中任一項(xiàng)所述的偽狂犬病毒弱毒株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物適于滴鼻、注射。
8. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的偽狂犬病毒弱毒株在制備預(yù)防或治療偽狂犬病的疫 苗中的應(yīng)用。
9. 一種區(qū)分權(quán)利要求1所述偽狂犬病毒弱毒株與野毒株感染的檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，包含：針對(duì)SEQ ID NO. 1所示缺失基因序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)。
10. -種區(qū)分權(quán)利要求1所述偽狂犬病毒弱毒株與野毒株感染的檢測(cè)試劑盒，其特征 在于，包含偽狂犬病毒gE蛋白抗體。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104152416SQ201410002656
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】童光志, 童武, 鄭浩, 劉飛, 梁超, 周艷君, 單同領(lǐng), 于海, 姜一峰, 高飛 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所