多形漢遜酵母突變菌株及多形漢遜酵母生產(chǎn)d-阿拉伯糖醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種多形漢遜酵母突變菌株及多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，主要是采用基因工程技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，獲得一株D-阿拉伯糖醇的高產(chǎn)突變菌株。該方法成本低、生產(chǎn)周期短、易于操作，為解決D-阿拉伯糖醇來(lái)源短缺問(wèn)題提供了新途徑。本發(fā)明提供的突變菌株通過(guò)葡萄糖分批補(bǔ)料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，其底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為51.2％，比利用出發(fā)菌株通過(guò)葡萄糖分批補(bǔ)料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率顯著提高。
【專利說(shuō)明】多形漢遜酵母突變菌株及多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖 醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用基因敲除方法敲除多形漢遜酵母酸 性磷酸酯酶基因而構(gòu)建的突變菌株，并利用該突變菌株通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿拉伯糖 醇。

【背景技術(shù)】
[0002] D-阿拉伯糖醇是一種五碳糖醇，分子式為C5H1205，分子量為152. 12,是木糖醇和核 糖醇的同分異構(gòu)體。它是一種有甜味的白色晶體，其熔點(diǎn)為l〇3°C，旋光度為130°，在空氣 中有很強(qiáng)的吸濕性。糖醇是經(jīng)糖還原的一類多元醇，由于具有低熱值、抗齲齒、不影響胰島 素水平等優(yōu)點(diǎn)，其在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 在食品領(lǐng)域中，D-阿拉伯糖醇可用作改善酒精飲料品質(zhì)的添加劑和調(diào)制糖漿的基 質(zhì)；在化工領(lǐng)域中，D-阿拉伯糖醇可用作影響高分子發(fā)泡材料合成過(guò)程的激活劑、保護(hù)顯 影材料置于高溫環(huán)境長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定劑、提高鋁電容器高溫可靠性及其電解質(zhì)溶液粘度的 增強(qiáng)劑和提高親水涂層或顆粒性固體溶解的輔助劑等；在醫(yī)藥領(lǐng)域中，D-阿拉伯糖醇可作 為藥物中間體用于生產(chǎn)1，4-二脫氧-1，4-亞胺基-D-阿拉伯糖醇，可作為α -葡萄糖苷酶 的抑制劑，也可用于防治艾滋病。
[0004] 目前，常規(guī)生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法主要是通過(guò)化學(xué)法合成，通過(guò)還原D-阿拉伯 糖或來(lái)蘇糖得到。但是該方法反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、設(shè)備要求高、環(huán)境污染嚴(yán)重、底物昂貴，致使 D-阿拉伯糖醇不能規(guī)?；a(chǎn)。針對(duì)化學(xué)合成法的缺點(diǎn)，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿拉伯糖 醇，其反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，因而從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，該方法最有潛力。生物轉(zhuǎn)化法是將細(xì) 胞生長(zhǎng)一定的濃度后添加底物（葡萄糖），利用細(xì)胞中的酶系反應(yīng)合成D-阿拉伯糖醇，該方 法產(chǎn)物單一、提取簡(jiǎn)單、對(duì)反應(yīng)設(shè)備和條件要求低。
[0005] 截止目前，可用于生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌屬（Aspergillus)、 假絲酵母屬（Candida)、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces)、擬內(nèi)袍霉屬（EndomycoPsis)、 小叢梗袍屬（Moniliella)、漢遜酵母屬（Hansenula)、畢赤母屬（pichia)、接合酵母 屬（Zygosaccharomyces)。值得注意的是，漢遜酵母屬中多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)的理想細(xì)胞工廠（Gellsissen，kunze et al.2005)。多形漢 遜酵母最適生長(zhǎng)溫度高（37?43°C )，生長(zhǎng)速率快，易于大規(guī)模高密度發(fā)酵，易于培養(yǎng)，能在 廉價(jià)培養(yǎng)基中高密度生長(zhǎng)。但是，大部分產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的酵母菌株對(duì)底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化 率較低，多數(shù)酵母菌株的轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率介于10%? 40%之間，并且普遍存在甘油及其他多元醇副產(chǎn)物。
[0006] 酵母的酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, PH01)參與無(wú)機(jī)磷的輸送，當(dāng)該酶缺失 時(shí)，胞內(nèi)的磷質(zhì)量濃度不夠，使糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶的活性受到影響，因而不能利用葡萄 糖產(chǎn)甘油。因此，當(dāng)酸性磷酸酯酶缺失時(shí)，培養(yǎng)基中葡萄糖可以主要用于D-阿拉伯糖醇的 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)（曹鈺等· 1999)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種多形漢遜酵母突變菌株以及多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿 拉伯糖醇的方法。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 一種多形漢遜酵母突變菌株，該突變菌株為酸性磷酸酯酶基因（PH01，GenBank Accession NO. AF051161)突變菌株，酸性磷酸酯酶基因突變導(dǎo)致突變菌株的酸性磷酸酯酶 活性消失。
[0010] 所述突變菌株為敲除了酸性磷酸酯酶基因的多形漢遜酵母DL-1(ATCC No. 26012)。
[0011] 一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，包括以下步驟：
[0012] 1)利用基因敲除方法構(gòu)建一株多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，該突變 菌株的酸性磷酸酯酶活性消失；
[0013] 2)采用葡萄糖分批補(bǔ)料發(fā)酵的方法，利用所述突變菌株生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯 糖醇。
[0014] 所述步驟1)具體包括以下步驟：
[0015] a)構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pMD18-PH0-kanMX，pMD18-PH0-kanMX的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，以pMD18-PH0-kanMX為模板，并分別采用PH0-L-U和pUG6-D組成的引物對(duì) 以及PUG6-U和PH0-R-D組成的引物對(duì)，利用PCR方法擴(kuò)增酸性磷酸酯酶基因敲除片段， PH0-L-U的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 2所示，pUG6-D的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 6所示， PUG6-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示，PH0-R-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，將 所述敲除片段采用電穿孔法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母DL-1 ;
[0016] b)利用高磷培養(yǎng)基顯色篩選法從轉(zhuǎn)化后的多形漢遜酵母DL-1中獲得初篩菌株， 然后以初篩菌株基因組為模板，并分別采用PH0-Y-U和pUG6-D組成的引物對(duì)以及pUG6-U 和PH0-Y-D組成的引物對(duì)，利用PCR方法篩選突變菌株，當(dāng)采用PH0-Y-U和pUG6-D組成的 引物對(duì)以及PUG6-U和PH0-Y-D組成的引物對(duì)均擴(kuò)增出片段時(shí)，所對(duì)應(yīng)的初篩菌株為突變菌 株，PH0-Y-U的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 8所示，PH0-Y-D的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 9所 /_J、1 ο
[0017] 所述高磷培養(yǎng)基的組成包括5g/L的硫酸銨、100g/L的葡萄糖、0. 5g/L的硫酸鎂， 〇. lg/L的氯化鈣、500 μ g/L的硼酸、40 μ g/L的硫酸銅，100 μ g/L的碘化鉀，200 μ g/L的氯 化鐵，400 μ g/L的硫酸錳、200 μ g/L的鑰酸銨、400 μ g/L的硫酸鋅、500mg/L的磷酸二氫鉀 以及15g/L的瓊脂；高磷培養(yǎng)基顯色篩選的顯色劑的制備方法為：將α -萘酚磷酸鹽、固藍(lán) 鹽Β和瓊脂溶解于0. 05mol/L醋酸水溶液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸鹽的濃度為 5mg/mL，固藍(lán)鹽Β的濃度為50mg/mL，瓊脂的濃度為10mg/mL，依據(jù)高磷培養(yǎng)基上菌落顏色變 化，挑選出白色菌落，得初篩菌株。
[0018] 所述步驟2)具體包括以下步驟：
[0019] 種子培養(yǎng)：將突變菌株接種于50?100mL種子培養(yǎng)基中并于28?37°C以及 100?200r/min條件下培養(yǎng)14?24h得種子液；
[0020] 發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按5?10% (v/v)的接種量接種于300?500mL發(fā)酵培養(yǎng)基 中并于28?37°C以及100?200r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基含有作為生物轉(zhuǎn)化的 底物的葡萄糖，連續(xù)培養(yǎng)期間分批補(bǔ)加葡萄糖。
[0021] 所述種子培養(yǎng)基的組成包括4?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖以及 10?20g/L的蛋白胨，pH為6. 0。
[0022] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括5?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖、10? 20g/L的蛋白胨，0. 5?2. 5g/L的硫酸鎂，1?3g/L的磷酸二氫鉀，0. 1?0. 5g/L的氯化 鈣以及〇. 75?3. 75g/L的硫酸銨，pH為6. 0,種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后連續(xù)培養(yǎng)96? 144h，連續(xù)培養(yǎng)期間每隔24?28h補(bǔ)加50?60g/L的葡萄糖。
[0023] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括10g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨， 2. Og/L的硫酸鎂，1. 5g/L的磷酸二氫鉀，0. 3g/L的氯化鈣以及2. 35g/L的硫酸銨。
[0024] 所述分批補(bǔ)加葡萄糖的具體步驟為：種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后于37°C以及 160r/min下培養(yǎng)24h，然后加入50g/L的葡萄糖，然后繼續(xù)在37°C以及160r/min下培養(yǎng)并 每隔24h加入50g/L的葡萄糖。
[0025] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0026] 本發(fā)明通過(guò)基因敲除方法構(gòu)建多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，結(jié)合葡 萄糖分批補(bǔ)料發(fā)酵方法以提高底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的 目的，顯著的提高了多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)率。本發(fā)明所述突變菌株通過(guò)葡 萄糖分批補(bǔ)料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，其底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為51. 2%，比利用 出發(fā)菌株通過(guò)葡萄糖分批補(bǔ)料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化率（33. 7 % )提高了 51. 9%。本發(fā)明所述方法成本低、生產(chǎn)周期短、易于操作，為解決D-阿拉伯糖醇來(lái)源短缺問(wèn) 題提供了新途徑。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為步驟1. 1中PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜，其中，1 :以PH0-L-U和PH0-L-D進(jìn)行 擴(kuò)增的結(jié)果（PH01基因的左同源臂）；2 :以PH0-R-U和PH0-R-D進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果（PH01基 因的右同源臂）；3 :空白對(duì)照，以ddH20為模板，以PH0-L-U和PH0-L-D為引物；M :Marker ;
[0028] 圖2為步驟1. 2中PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜，其中，1 :同源臂組合片段，2 :空白對(duì) 照，以 ddH20 為模板；M :Marker ;
[0029] 圖3為步驟2. 1中PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜，其中，1 :以pUG6-U和PH0-R-D進(jìn)行 擴(kuò)增的結(jié)果（5'截?cái)嗟腒anMX抗性基因和PH01基因右同源臂）；2:以PH0-L-U和pUG6-D 進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果（PH01基因左同源臂和3'截?cái)嗟腒anMX抗性基因）；M :Marker ;
[0030] 圖4為步驟2. 3中PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜，其中，1 :以出發(fā)菌株基因組為模板 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物為pUG6-U和PH0-Y-D ;2 :以PH01基因突變菌株基因組為模板的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，引物為PUG6-U和PH0-Y-D ;3 :以出發(fā)菌株基因組為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物為 PH0-Y-U和pUG6-D ;4 :以PH01基因突變菌株基因組為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物為PH0-Y-U 和 pUG6-D ;M :Marker。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái) 限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 本發(fā)明的目的之一是提供多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因（PH01)突變菌株。
[0033] 本發(fā)明的目的之二是提供利用該突變菌株生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法。
[0034] 本發(fā)明的目的之三是提供該突變菌株在生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇中的應(yīng)用。 [0035] 利用基因工程方法，構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pMD18-PH0-kanMX，利用PCR方法擴(kuò)增PH01 基因敲除片段，結(jié)合常規(guī)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母，利用高磷培養(yǎng)基顯色篩選方法和 PCR方法對(duì)突變菌株進(jìn)行篩選；將篩選出來(lái)的突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，利用HPLC測(cè)定發(fā)酵 液中D-阿拉伯糖醇的含量，并計(jì)算突變菌株的底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。
[0036](一）突變菌株的構(gòu)建和篩選
[0037] 本發(fā)明將以基因敲除質(zhì)粒pMD18-PH0_kanMX為模板，并利用PCR方法擴(kuò)增的PH01 基因敲除片段，采用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入多形漢遜酵母，通過(guò)篩選得到酸性磷酸酯酶基因突變 菌株。具體說(shuō)明如下：
[0038] 1、質(zhì)粒 pMD18-PH0_kanMX 的構(gòu)建
[0039] (1. 1)以多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)DL-1(ATCC No. 26012)為 出發(fā)菌株，以多形漢遜酵母DL-1的基因組DNA為模板（基因組提取方法參考Dymond JS.Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 2013 ;529:153-60)，分別利用 PH0-L-U 和 PH0-L-D 以及 PH0-R-U 和 PH0-R-D 組成 的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（PH01基因左同源臂，為470bp ;PH01基因右同 源臂，為572bp)。
[0040] 反應(yīng)體系 25 μ L :10*PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（濃度為10 μ M)各1· 5 μ L，模板（濃度為2 μ g/mL) 2· 0 μ L， ddH2015. 5μ L ；
[0041] 反應(yīng)程序：95°C 5min ;循環(huán) 30 次：94°C 30s，50°C 45s，72°C lmin ;72°C 10min。擴(kuò) 增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，可以看到所擴(kuò)增產(chǎn)物分別為470bp 和572bp左右的目的片段。
[0042] 所述引物為：
[0043] PH0-L-U :5' -GTAATATGCAAGCTGCTGG-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 2)
[0044] PH0-L-D ：
[0045] 5' -ATGAGTCCAAGAGCAGTGATGCGGCCGCGCATGAACAATTGGGCCT-3,(參見(jiàn) SEQ. ID. NO. 3)
[0046] 所述PH0-L-D由三部分組成，具體為：其3'端為用于擴(kuò)增左同源臂的序列，中間是 Notl限制性酶酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)注Notl酶切位點(diǎn)，5'端序列是引物PH0-R-U的互補(bǔ)序列。
[0047] PH0-R-U :5, -ATCACTGCTCTTGGACTCAT-3,（序列表 SEQ. ID. N0. 4)
[0048] PH0-R-D :5, -ACTTCCCCCATATGCCTT-3'（序列表 SEQ. ID. Ν0· 5)
[0049] (1.2)將步驟（1. 1)獲得的PH01基因的左同源臂和右同源臂1:1(體積比）混合 后作為模板，以PH0-L-U和PH0-R-D組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得同源臂組合片段。
[0050] 反應(yīng)體系 25 μ L :10*PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（濃度為10 μ M)各1· 5 μ L，模板（濃度為2 μ g/mL) 2· 0 μ L，， ddH2015. 5μ L ；
[0051] 反應(yīng)程序：95°C 5min ;循環(huán) 30 次：94°C 30s，52°C 45s，72°C lmin ;72°C lOmin。擴(kuò) 增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，可以看到所擴(kuò)增產(chǎn)物為1022bp左右 的目的片段。
[0052] (1. 3)將步驟（1. 2)獲得的同源臂組合片段和pMD18-T通過(guò)TA克隆方法進(jìn)行連接 獲得質(zhì)粒 pMD18-PH0(3714bp)。
[0053] (1. 4)用限制性內(nèi)切酶Notl酶切pUG6質(zhì)粒，回收約1619bp的片段（含有kanMX 抗性基因）。
[0054] (1.5)用限制性內(nèi)切酶Notl酶切pMD18-PH0并進(jìn)行脫磷酸化后與步驟（1.4) 回收的約1619bp的片段連接，得到質(zhì)粒pMD18-PH0-kanMX(即將左同源臂序列、Notl酶 切pUG6質(zhì)粒所得的1619bp序列以及右同源臂序列插入pMD18-T的t位點(diǎn)）。所述質(zhì)粒 pMD18-PH0-kanMX序列長(zhǎng)度為5333bp，具體核苷酸序列如下（序列表SEQ. ID. N0. 1)，由 PMD18-T的起始位點(diǎn)開(kāi)始：
[0055] TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTC TGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAAC TATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAA ATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGT TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATGTAATATGCAAGCTGCTGGAACGACTAGC ACTTTCGATGCAGTATAGAGACAGAAGGGGATCTTTGTAGGGCAGTTTTGGGCCGGAATACGCCTAATTCATCACAC GTGCTAAAAATTATTGTGGTGTACAATACTGCATGCAATATATTCACCCGGAATAGTAATGCTAAAATAAAAAATAA CCTTTGATACTCCACTATAAATATGGTCAATCTACCTCACTCTTGACCTCAATGTTTTCCTTTGCAACGACACTTCT AGTTGGCGCCATTGTGGCCAATGGGCTCATCTTGCACCCTGGCTACGACCAGGTTGCCACAGACCAGTATAACTTAC TCAAGTTCATGATCGGCGCTGGTCCCTTTGTCGAGCATAGTGGGTTTGGCATTCCACTTGACACTCCTCCTCATTGT GAAATTGAACAGGCCCAATTGTTCATGCGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATA TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCA CCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACT GTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGA AGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCA CGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAA TCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGC CGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCG ACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGA TGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTA CTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGAT TCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTT TAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTG ATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCA GTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGG ACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTAC AGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG TTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTA GTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTT AAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAAC GCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT TAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGGCCGCATCACTGCTCTTGGACTCATCACCGATACCGAGTTGGGA ACAGAAGACGTGGATTTCCACCGAAGTTTCAAAACCTCTGAGCTCGTTCCTCAAGGAGCCAGACTGATTATTGAGAA ACTTAACTGTTCTGACACGTCGTTTGTGAGAACCATTCTGAACGACAAGGTGTACCCTGTTCCAGGATGTTCTTCAG GACCGGGTTACTCTTGTCCACTGGAGGACTACCTGGACATTATAACTCCAGAGGTTGACTATGCCTCCGCCTGTGAG CTTCCAGACGATGCCCCTAAGGAAATTAGCTTTTACTGGGACTGGAAGCCGACCTTTGAGAACAACTAAATACCAAT GCAGAGCGAGCTGGTTCTGCGAGTTATATTCAGTAGCACTTTAGATGCTACGGAAACGAAGTTCTTGAACAATAAAA ATCGTCTGATATTCAAGAGTAAGTTCTAATTTATTGACCTATAGCTTAGATTCTCTCTGGTTGTAGCTAGCGACAC ACTCCAGTTCGACTTTCACTTGCTTGTTAGGGAATCCCACAACGCAAGATCTAGAAGGCATATGGGGGAAGTATCTC TAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATT AATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCG CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTG CGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCC CTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTC GGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCT GTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTT CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCT TCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGA AAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAA GTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATC TCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTT ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAA GCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTC GTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAA AAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCA GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATT CTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAA CTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAAC AGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATA GGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAA AAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
[0056] 質(zhì)粒 pUG6 :帶有 kanMX 篩選標(biāo)記，購(gòu)自 Eurosacrf (Frankfurt，Germany ; http://web. uni-frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf/data/pUG6.txt)(見(jiàn) Guld ener, U. , Heck, S. , Fielder, T. , Beinhauer, J. , and Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res.24 (13)，2519-2524(1996))。
[0057] pMD18_T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。
[0058] 2、突變菌株的構(gòu)建
[0059] (2. 1)以質(zhì)粒 pMD18-PH0-kanMX 為模板，分別以 PH0-L-U 和 pUG6-D 以及 pUG6-U 和 PH0-R-D組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（分別為PH01基因左同源臂和3' 截?cái)嗟腒anMX抗性基因，約1544bp，和5'截?cái)嗟腒anMX抗性基因和PH01基因右同源臂，約 1565bp)。
[0060] 反應(yīng)體系 25 μ L :10*PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（濃度為10 μ M)各1· 5 μ L，模板（濃度為2 μ g/mL) 2· 0 μ L， ddH2015. 5μ L ；
[0061] 反應(yīng)程序：95°C 5min ;循環(huán) 30 次：94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin ;72°C lOmin。擴(kuò) 增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，可以看到所擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1544bp 和1565bp左右的目的片段。
[0062] PH0-L-U :5' -GTAATATGCAAGCTGCTGG-3'
[0063] pUG6-D :5, -TCCCCTCGTCAAAAATAAG-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 6)
[0064] pUG6-U :5, -TGAAACATGGCAAAGGTAGC-3,（序列表 SEQ. ID. Ν0· 7)
[0065] PH0-R-D :5' -ACTTCCCCCATATGCCTT-3'
[0066] (2. 2)將步驟（2. 1)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（1544bp條帶以及1565bp條帶） 利用電穿孔法（電擊參數(shù)為1.(^ν，100Ω，50μΡ)轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母DL-1(感受態(tài) 細(xì)胞制備方法參考 Faber, K.N.，Haima, P·，Harder, W.，Veenhuis，M.，Ab，G·，1994. Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 25, 305 - 310.)，然后將多形漢遜酵母DL-1涂布于高磷培養(yǎng)基固體平板上，37°C恒 溫培養(yǎng)48h后，在其表面滴加一層50°C的顯色劑，37°C恒溫靜置60min后觀察菌落顏色變 化。若產(chǎn)生酸性磷酸酯酶，菌落會(huì)變?yōu)樯罴t色；若無(wú)酸性磷酸酯酶產(chǎn)生，則菌落仍為白色。 依據(jù)菌落顏色變化，挑選出白色菌落，獲得初篩突變菌株。
[0067] 所述高磷培養(yǎng)基配方：硫酸銨5g/L，葡萄糖100g/L，硫酸鎂0. 5g/L，氯化鈣0. lg/ L，硼酸500 μ g/L，硫酸銅40 μ g/L，碘化鉀100 μ g/L，氯化鐵200 μ g/L，硫酸錳400 μ g/L，鑰 酸銨200 μ g/L，硫酸鋅400 μ g/L，磷酸二氫鉀500mg/L，瓊脂15g/L。
[0068] 顯色劑：將α -萘酚磷酸鹽（Sigma)、固藍(lán)鹽B和瓊脂溶解于0. 05mol/L醋酸水溶 液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸鹽的濃度為5mg/mL，固藍(lán)鹽B的濃度為50mg/mL，瓊 脂的濃度為10mg/mL，顯色劑pH為4. 0。
[0069] (2. 3)以步驟（2. 2)獲得的初篩突變菌株的基因組為模板（基因組提取方法參 考 Dymond JS.Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 2013 ;529:153-60)，以PHO-Y-U和pUG6-D 以及pUG6-U和PHO-Y-D組成的引物對(duì)分 別進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，其中引物PHO-Y-U和PHO-Y-D分別位于左右同源臂的外側(cè)，因此只有 PH01基因發(fā)生正確突變才能擴(kuò)增出目的基因片段，如果沒(méi)有發(fā)生正確突變則不能擴(kuò)增出任 何基因片段。
[0070] 反應(yīng)體系 25 μ L :10*PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（濃度為10 μ M)各1· 5 μ L，模板（濃度為2 μ g/mL) 2· 0 μ L，， ddH2015. 5μ L ；
[0071] 反應(yīng)程序：95°C 5min ;循環(huán) 30 次：94°C 30s，50°C 45s，72°C lmin ;72°C 10min。擴(kuò) 增產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，當(dāng)采用PHO-Y-U和pUG6-D組成的引物對(duì)以及pUG6-U 和PH0-Y-D組成的引物對(duì)均擴(kuò)增出片段時(shí)，所對(duì)應(yīng)的初篩突變菌株為目標(biāo)突變菌株（記為 多形漢遜酵母Hpphol Λ )，如圖4所示，分別獲得1582bp片段和1603bp片段，而出發(fā)菌株 未能擴(kuò)增出片段。
[0072] PH0-Y-U :5, -AGCAATACCCAGACTCGA-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 8)
[0073] PHO-Y-D :5, -TAAGGATGCTGCCACTGTCA-3,（序列表 SEQ. ID. Ν0· 9)
[0074] (二）出發(fā)菌株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖一次加入法）
[0075] 1、種子培養(yǎng)
[0076] 將斜面保藏的多形漢遜酵母DL-1 (ATCC No. 26012)在37°C活化3?4h后，取一 環(huán)，接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，然后在37°C、160r/min振蕩培養(yǎng)18h得種子液。
[0077] 所述種子培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH = 6. 0。
[0078] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0079] 將種子液按5%的接種量接種至裝有500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)144h，收集發(fā)酵液。用HPLC測(cè)定胞外D-阿拉伯糖醇的含量 和葡萄糖的殘留量，計(jì)算底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為22. 1%。
[0080] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母浸粉5g/L，葡萄糖400g/L，蛋白胨10g/L，硫酸鎂 2. 5g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，氯化鈣 0· 5g/L，硫酸銨 3. 75g/L，pH = 6. 0。
[0081] 所述HPLC測(cè)定發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的殘留量的分析條件為： 色譜柱：SH1011 ;流動(dòng)相：0· 01mol/L H2S04 ;流速：0· 8mL/min ;進(jìn)樣量：5 μ L ;柱溫：50°C ;檢 測(cè)器：示差檢測(cè)器（RID)。
[0082] 根據(jù)葡萄糖到D-阿拉伯糖醇的反應(yīng)式：
[0083] D-Glucose+ATP+NAD (P) ++H20 - D-Arabitol+ADP+Pi+NAD (P) H+C02
[0084] 所述底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率=D_阿拉伯糖醇的含量八葡萄糖總加入量一葡萄糖殘 留量）X100%
[0085] (三）出發(fā)菌株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖分批補(bǔ)料）
[0086] 1、種子培養(yǎng)
[0087] 將斜面保藏的多形漢遜酵母DL-1 (ATCC No. 26012)在37°C活化3?4h后，取一 環(huán)，接種至含50mL的種子培養(yǎng)基的搖瓶中，然后在37°C、160r/min振蕩培養(yǎng)18h得種子液。
[0088] 所述種子培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，pH = 6. 0。
[0089] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0090] 將種子液按5%的接種量接種至裝有500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L三角瓶中，置于 37°C、160r/min培養(yǎng)24h后開(kāi)始添加葡萄糖，每隔24h加入50g/L的葡萄糖，連續(xù)發(fā)酵144h， 收集發(fā)酵液。用HPLC測(cè)定胞外D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的殘留量，計(jì)算底物葡萄糖 的轉(zhuǎn)化率為33. 7%。
[0091] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸鎂 2. Og/L，磷酸二氫鉀 1. 5g/L，氯化鈣 0· 3g/L，硫酸銨 2. 35g/L，pH = 6. 0。
[0092] (四）突變菌株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖一次加入法）
[0093] 1、種子培養(yǎng)
[0094] 將篩選出來(lái)的多形漢遜酵母Hpphol Λ，取一環(huán)接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的搖 瓶中，然后于37°C、160r/min振蕩培養(yǎng)18h得種子液。
[0095] 所述種子培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH = 6. 0。
[0096] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0097] 將種子液按5%的接種量接種至裝有500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)144h。用HPLC測(cè)定D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的殘留量， 計(jì)算底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為42. 7%。
[0098] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母浸粉5g/L，葡萄糖400g/L，蛋白胨10g/L，硫酸鎂 2. 5g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，氯化鈣 0· 5g/L，硫酸銨 3. 75g/L，pH = 6. 0。
[0099] (五）突變菌株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖分批補(bǔ)料）
[0100] 1、種子培養(yǎng)
[0101] 將篩選出來(lái)的多形漢遜酵母Hpphol Λ，取一環(huán)接種至含50mL的種子培養(yǎng)基的搖 瓶中，然后于37°C、160r/min振蕩培養(yǎng)18h得種子液。
[0102] 所述種子培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，pH = 6. 0。
[0103] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0104] 將種子液按5%的接種量接種至裝有500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min培養(yǎng)24h后開(kāi)始向三角瓶中添加葡萄糖，每隔24h加入50g/L的葡萄糖，連 續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)144h。用HPLC測(cè)定D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的殘留量，計(jì)算底物葡萄糖 的轉(zhuǎn)化率為51.2%。
[0105] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸鎂 2. 0g/L，磷酸二氫鉀 1. 5g/L，氯化鈣 0· 3g/L，硫酸銨 2. 35g/L，pH = 6. 0。
【權(quán)利要求】
1. 一種多形漢遜酵母突變菌株，其特征在于：該突變菌株為酸性磷酸酯酶基因突變菌 株，酸性磷酸酯酶基因突變導(dǎo)致突變菌株的酸性磷酸酯酶活性消失。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種多形漢遜酵母突變菌株，其特征在于：所述突變菌株為敲 除了酸性磷酸酯酶基因的多形漢遜酵母DL-1。
3. -種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 利用基因敲除方法構(gòu)建一株多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，該突變菌株 的酸性磷酸酯酶活性消失； 2) 采用葡萄糖分批補(bǔ)料發(fā)酵的方法，利用所述突變菌株生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述步驟1)具體包括以下步驟： a) 構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pMD18-PH0-kanMX，pMD18-PH0-kanMX的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，以pMD18-PH0-kanMX為模板，并分別采用PHO-L-U和pUG6-D組成的引物對(duì) 以及PUG6-U和PH0-R-D組成的引物對(duì)，利用PCR方法擴(kuò)增酸性磷酸酯酶基因敲除片段， PH0-L-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，pUG6-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示， PUG6-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示，PH0-R-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，將 所述敲除片段采用電穿孔法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母DL-1 ; b) 利用高磷培養(yǎng)基顯色篩選法從轉(zhuǎn)化后的多形漢遜酵母DL-1中獲得初篩菌株，然后 以初篩菌株基因組為模板，并分別采用PH0-Y-U和pUG6-D組成的引物對(duì)以及pUG6-U和 PH0-Y-D組成的引物對(duì)，利用PCR方法篩選突變菌株，當(dāng)采用PH0-Y-U和pUG6-D組成的引物 對(duì)以及PUG6-U和PH0-Y-D組成的引物對(duì)均擴(kuò)增出片段時(shí)，所對(duì)應(yīng)的初篩菌株為突變菌株， PH0-Y-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示，PH0-Y-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于： 所述高磷培養(yǎng)基的組成包括5g/L的硫酸銨、100g/L的葡萄糖、0. 5g/L的硫酸鎂，0. lg/L 的氯化鈣、500 μ g/L的硼酸、40 μ g/L的硫酸銅，100 μ g/L的碘化鉀，200 μ g/L的氯化鐵， 400 μ g/L的硫酸錳、200 μ g/L的鑰酸銨、400 μ g/L的硫酸鋅、500mg/L的磷酸二氫鉀以及 15g/L的瓊脂；高磷培養(yǎng)基顯色篩選的顯色劑的制備方法為：將α-萘酚磷酸鹽、固藍(lán)鹽B 和瓊脂溶解于〇. 〇5mol/L醋酸水溶液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸鹽的濃度為5mg/ mL，固藍(lán)鹽B的濃度為50mg/mL，瓊脂的濃度為10mg/mL，依據(jù)高磷培養(yǎng)基上菌落顏色變化， 挑選出白色菌落，得初篩菌株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述步驟2)具體包括以下步驟： 種子培養(yǎng)：將突變菌株接種于種子培養(yǎng)基中并于28?37°C以及100?200r/min條件 下培養(yǎng)14?24h得種子液； 發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中并于28?37°C以及100?200r/min條件下 連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基含有生物轉(zhuǎn)化的底物葡萄糖，連續(xù)培養(yǎng)期間分批補(bǔ)加葡萄糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述種子培養(yǎng)基的組成包括4?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖以及10?20g/L的 蛋白胨。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括5?lOg/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖、10?20g/L的蛋白 胨，0. 5?2. 5g/L的硫酸鎂，1?3g/L的磷酸二氫鉀，0. 1?0. 5g/L的氯化鈣以及0. 75? 3. 75g/L的硫酸銨，種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后連續(xù)培養(yǎng)96?144h，連續(xù)培養(yǎng)期間每隔 24?28h補(bǔ)加 50?60g/L的葡萄糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括l〇g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨，2. Og/L的硫 酸鎂，1. 5g/L的磷酸二氫鉀，0. 3g/L的氯化鈣以及2. 35g/L的硫酸銨。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述一種多形漢遜酵母生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于： 所述分批補(bǔ)加葡萄糖的具體步驟為：種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后于37°C以及160r/min下 培養(yǎng)24h，然后加入50g/L的葡萄糖，然后繼續(xù)在37°C以及160r/min下培養(yǎng)并每隔24h加 入50g/L的葡萄糖。
【文檔編號(hào)】C12N1/16GK104195059SQ201410404466
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】錢(qián)衛(wèi)東, 王婷, 毛培宏, 寧肖肖 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)