專利名稱：一株產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2-苯乙醇也稱￠-苯乙醇，是一種具有玫瑰香氣的芳香醇，天然存在于多種植物葉、花及提取的精油中，在面包、果酒、干酪及醬油等發(fā)酵食品中含量豐富。2-苯乙醇是玫瑰香型香氣的主要成分，也是多種香型的補(bǔ)充成分，其衍生酯類如乙酸苯乙酯也是重要芳香產(chǎn)品。目前全球2-苯乙醇的產(chǎn)量超過萬噸，其中大多數(shù)采用化工合成法，只有少量從植物精油中萃取?；ず铣煞ǔ杀据^低，但合成所用原料苯或苯乙烯屬于致癌物，對人體健康及環(huán)境有害。另外，化學(xué)合成2-苯乙醇中常含難以除去的聯(lián)二苯、2-氯代乙苯等副產(chǎn)物，呈不 悅氣味，對產(chǎn)品質(zhì)量及使用安全造成不良影響。因此，人們鐘愛源于生物合成的2-苯乙醇，主要通過動植物原料提取或微生物轉(zhuǎn)化法獲得。但每5噸鮮玫瑰花才可制取約I千克玫瑰精油，生產(chǎn)成本高，周期長，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足消費(fèi)需求。因而，微生物轉(zhuǎn)化法成為一條經(jīng)濟(jì)有效地生產(chǎn)途徑。在酵母細(xì)胞中，2-苯乙醇可以通過合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑合成，或通過艾氏途徑(Ehrlich pathway)合成(趙修報,唐育岐,劉天明等.￠-苯乙醇的研究進(jìn)展[J].中國釀造，2011，8:1-4.)。多種酵母具有合成2-苯乙醇的能力，如產(chǎn)朊球擬酵母、馬克斯克魯維酵母、發(fā)酵畢赤酵母、乳酸克魯維酵母、釀酒酵母及異常漢遜酵母等。少數(shù)真菌也具有合成2-苯乙醇的能力，如針層孔菌、安息香薄皮層菌、帚狀地霉、猴頭菌及黑曲霉等，但2_苯乙醇產(chǎn)率極低。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因具有食用安全、2_苯乙醇產(chǎn)率高等優(yōu)勢而成為國內(nèi)外持續(xù)研究開發(fā)的重點(diǎn)對象。崔志峰(崔志峰，車智博，楊霄等.2-苯乙醇耐受性高產(chǎn)酵母菌株的選育[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008 (36) =427-430.)和 Etschmann MCEtschmann M, Bluemkee W，Sell D, et al. Biotechnological productionof2-phenylethanol [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 59:1-8.)分別報道了酵母菌株單相分批發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，但整體來說，2-苯乙醇的合成成本仍然較高，上述研究結(jié)果獲得的酵母菌株仍難以滿足市場的需求，因此尋找更高產(chǎn)2-苯乙醇微生物菌株仍是解決上述問題的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6 菌株，2OlO 年 I2 月 2O 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC No. 4491。上述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株是從山東省濟(jì)南市長清區(qū)農(nóng)家自然發(fā)酵葡萄酒缸中分離，并經(jīng)紫外誘變篩選獲得。該菌株菌落呈白色，邊緣圓整，中央稍隆起，細(xì)胞近圓形，平均大小15 21iimX14 16iim(長X寬)，發(fā)酵產(chǎn)香味濃，產(chǎn)乙醇可達(dá)9. 8% (V/V)，酵母菌株對2-苯乙醇有較好耐受性。在水相培養(yǎng)基中當(dāng)2-苯乙醇濃度為3. 5 4. 5g/L時，菌體OD6tltl值為對照的70% 60%。在雙相培養(yǎng)基中2-苯乙醇產(chǎn)量可達(dá)到5. 8564g/L。可以作為2-苯乙醇、葡萄酒和飼料酵母生產(chǎn)菌種應(yīng)用。上述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株的培養(yǎng)方法,步驟如下(I)從試管斜面挑取I 2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/m條件下，活化振蕩培養(yǎng)16 20h，制得活化后的液態(tài)種子；(2)將步驟(I)制得的液態(tài)種子按照8 12% (v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,在28 30°C、120 160r/min條件下，培養(yǎng)50 60h，即得。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6. 0，蒸餾水定容。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下葡萄糖80. 0g/L、L-苯丙氨酸 35. Og/L、蛋白胨 10. Og/L、酵母粉 5. 0g/L,pH5. 5,蒸餾水定容。上述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株在制備2_苯乙醇中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(I)從試管斜面挑取I 2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/min條件下，活化振蕩培養(yǎng)18 22h，制得活化后的液態(tài)種子；(2)將步驟(I)制得的液態(tài)種子按照8 12% (v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/m條件下，培養(yǎng)24 48h，然后加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積18 22%的無菌油酸或無菌丙二醇2000，在28 30°C、120 160r/min條件下，繼續(xù)培養(yǎng)至50 60h,經(jīng)6000r/min下離心5 IOmin,取油相，制得2-苯乙醇。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6. 0，蒸餾水定容。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下葡萄糖80. 0g/L、L-苯丙氨酸 25. 0g/L、蛋白胨 10. 0g/L、酵母粉 5. 0g/L,pH5. 5,蒸餾水定容。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中加入無菌油酸；無菌油酸是油酸經(jīng)滅菌過程制得。有益效果I、本發(fā)明篩選出的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株具有2_苯乙醇產(chǎn)量高的特點(diǎn)，經(jīng)檢測，該菌株2-苯乙醇產(chǎn)量可達(dá)到5. 8564g/L ；2、本發(fā)明通過對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株進(jìn)行研究，優(yōu)化了培養(yǎng)基中的主要影響因素，提高了該菌株2-苯乙醇的產(chǎn)量。3、本發(fā)明篩選出的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株2_苯乙醇耐受性高，有利于該菌株在2-苯乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。


圖I是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株的菌落形態(tài)照片;圖2是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株的細(xì)胞形態(tài)(放大10倍)照片；圖3是3種芳香族氛基酸種類對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株合成2-苯乙醇的影響；圖4是不同濃度L-苯丙氛酸對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株合成2-苯乙醇的影響；
圖5是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線；圖6是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線；圖7是2_苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品聞效液相色譜圖；圖8是2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖9是發(fā)酵樣品中2-苯乙醇的高效液相色譜圖；圖10是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株代謝產(chǎn)生2_苯乙醇的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜；圖11是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株產(chǎn)2_苯乙醇樣品的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜解析結(jié)果；圖12是不同濃度2_苯乙醇條件下釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株的生長曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WHH6 菌株,2010 年 12 月 20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4491。實(shí)施例中所述2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。實(shí)施例I一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6 菌株，2OlO 年 I2 月 2O 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4491。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株具有典型的釀酒酵母特征,菌落呈白色，邊緣圓整，中央稍隆起，如圖I所示；細(xì)胞近圓形，平均大小15 21 ii mX 14 16iim(長X寬)，如圖2所示；發(fā)酵產(chǎn)香味濃，產(chǎn)乙醇可達(dá)9. 8% (v/v)。單相單菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)2-苯乙醇可達(dá)5.4003g/L (表I)?？梢宰鳛?-苯乙醇、葡萄酒和飼料酵母生產(chǎn)菌種應(yīng)用。實(shí)施例2釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株的培養(yǎng)方法,步驟如下
(I)從試管斜面挑取I 2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/min條件下，活化振蕩培養(yǎng)18 22h，制得活化后的液態(tài)種子；(2)將步驟(I)制得的液態(tài)種子按照8 12% (v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，每隔12h取樣測定一次發(fā)酵液OD66tl值及上清液中2-苯乙醇含量(結(jié)果如圖5所示)，發(fā)酵培養(yǎng)40h后每隔4h測定發(fā)酵上清液2-苯乙醇含量和菌液OD66tl值(結(jié)果如圖6所示)，即得。所述步驟(I)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L, pH6. 0,蒸懼水定容。所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下葡萄糖80. 0g/L、L-苯丙氨酸 25. Og/L、蛋白胨 10. Og/L、酵母粉 5. 0g/L,pH5. 5,蒸餾水定容。由圖5可見，當(dāng)發(fā)酵至56h時2_苯乙醇濃度達(dá)到最高,菌體光密度在60h達(dá)到最高。表明苯乙醇代謝與菌體生長量動態(tài)基本一致，但并不完全同步。由圖6可以看出，菌體光密度優(yōu)先于2-苯乙醇濃度的增長。在56h時，菌體產(chǎn)量和2-苯乙醇產(chǎn)量均達(dá)到最高值。產(chǎn)物的確認(rèn)產(chǎn)物確認(rèn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，將實(shí)施例2制得的發(fā)酵液在4°C，6000r/m離心6min，取IOOmL上清液于分液漏斗，加入40mL 二氯甲烷間斷性混勻，萃取過夜，將有機(jī)相轉(zhuǎn)入I. 5mL離心管，10000r/min離心IOmin,有機(jī)相添加無水硫酸鈉脫水,離心取上清液供氣-質(zhì)聯(lián)用檢測。氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)儀(島津GC-MS-QP2010型)，裝有DB-5MS型毛細(xì)管柱(30mX0. 25mmX0. 25 y m)，進(jìn)樣口溫度為260°C，柱溫箱起始溫度為50°C，保留2min，以5°C /min程序升溫至240°C,保留2min至終點(diǎn)。載氣為He,流速I. OmL/min,柱前壓53. 5kPa,分流比10:1。電離方式為EI，電離電壓70eV，離子源溫度200°C，質(zhì)量掃描范圍10_1500Da，連接桿溫度250°C，檢測器電壓350V。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫采用NIST27. LIB, NIST147. LIB和WILERY7. LIB標(biāo)準(zhǔn)譜庫。質(zhì)譜離子圖如圖10所示，質(zhì)譜離子圖解析結(jié)果如圖11所示。產(chǎn)物濃度的確定
采用高效液相色譜法測定2-苯乙醇濃度，高效液相色譜(日本島津LC-10AT)檢測分析條件為C18反相色譜柱(Agilent HC_C18，4. 6X250mm，5 y m)，流動相為甲醇:水=50:50 (v/v),流速 0. 7mL/min,檢測波長 260nm,進(jìn)樣量 15iiL。(I) 2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液精確稱量0. 2029g 2_苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇溶解并定容至10mL，得到濃度為20. 29g/L的2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)母液。分別準(zhǔn)確量取20. 29g/L2_苯乙醇溶液0. 2mL, 0. 4mL, 0. 6mL, 0. 8mL, I. OmL, I. 2mL, I. 4mL, I. 6mL于小燒杯，用色譜純甲醇定容至IOmLo得到2-苯乙醇濃度分別為 0. 4058g/L，0. 8116g/L, I. 2174g/L, I. 6232g/L，2. 0290g/L，2. 4348g/L，2. 8406g/L, 3. 2464g/L，制得2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液分別經(jīng)過0. 22 y m有機(jī)濾膜過濾后，進(jìn)樣測定。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖如圖7所示,2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間在12 13min之間；每一濃度重復(fù)測定6次，求均值繪制2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8所示；根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得該曲線的方程式為y=8. 8004x+2. 6141，其中峰面積為I值，濃度值為X。2-苯乙醇為揮發(fā)性化合物，為了明確樣品中2-苯乙醇在代謝及室溫放置過程中是否有揮發(fā)損失，進(jìn)行了 2-苯乙醇揮發(fā)損失實(shí)驗(yàn)。在250mL三角瓶中分裝的濃度分別為0. 4058及0. 8116g/L的2-苯乙醇水溶液50mL，8層紗布包扎，于28°C，120r/min的恒溫?fù)u床中振蕩36h及72h后測定三角瓶中的2-苯乙醇濃度，兩者結(jié)果之間無顯著性差異。這表明在發(fā)酵培養(yǎng)的56h之內(nèi)，2-苯乙醇沒有明顯的揮發(fā)損失，發(fā)酵上清液放入4°C冰箱經(jīng)過72h保存也不會影響試驗(yàn)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。(3)高效液相色譜法的精密度及加樣回收率的確定連續(xù)進(jìn)同一樣品6次，測定精密度。向某一濃度的樣品中添加不同濃度的2-苯乙 醇標(biāo)準(zhǔn)品，測定加樣回收率。(4)樣品的制備取發(fā)酵液8mL,加入IOmL離心管中，6000r/min離心6 IOmin,取上清液，用0. 22 iim水性濾膜過濾，收集濾液于ImL離心管中，制得樣品，待用。高效液相色譜分析參數(shù)C18反相色譜柱(Agilent HC-C18,4. 6X 250mm, 5 u m),流動相為甲醇水=50:50 (v/v),流速0. 7mL/min,檢測波長260nm,進(jìn)樣量15iiL。外標(biāo)法
測定2-苯乙醇含量。樣品的高效液相色譜圖如圖9所示，由圖中可以看出，在12 13min之間有一峰，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致，證明制得了 2-苯乙醇；高效液相色譜測定的樣品的峰面積帶入方程y=8. 8004x+2. 6141,峰面積為y值，換算出2-苯乙醇濃度X。氨基酸的優(yōu)選方案I米用實(shí)施例2的方法培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株,不同之處在于，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸改為L-酪氨酸。方案2米用實(shí)施例2的方法培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株,不同之處在于，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸變?yōu)長-色氨酸。通過圖3可以看出，當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中采用L-苯丙氨酸時，2-苯乙醇的產(chǎn)量最聞。關(guān)于氨基酸濃度的優(yōu)選米用實(shí)施例2的方法培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株,不同之處在于，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸濃度分別采用5. 0g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，2-苯乙醇的產(chǎn)量如圖4所示。由此可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為25g/L時，2-苯乙醇的產(chǎn)量最高。 釀酒酵母WHH6對2-苯乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)分別向各搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖80. Og/L、L-苯丙氨酸35. Og/L、蛋白胨10. Og/L、酵母粉5. Og/L, pH5. 5,蒸懼水定容)中添加不同濃度2-苯乙醇，使2-苯乙醇的濃度分別為I. 5g/L、2. 5g/L、3. 5g/L、4. 5g/L、5. 5g/L，按10% (v/v)接種量接種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6,在 28 °C、160r/min 條件下培養(yǎng)，分別在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h取樣測定酵母菌體生長量(0D_值)，比較2-苯乙醇各個濃度對菌體生長的影響，結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，在添加Og/L 5. 5g/L的2_苯乙醇時菌體生長量OD6tltl值在I. 31 0. 45之間。在水相中當(dāng)其濃度為3. 5 4. 5g/L時，菌體OD600值為對照的70% 60%,即2-苯乙醇抑制了 30% 40%酵母菌體的生長量。表明該酵母菌株對2-苯乙醇有較好耐受性，而已報道的酵母在2-苯乙醇濃度為2. 5g/L時就可抑制75%酵母菌體的生長。實(shí)施例3
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株在制備2_苯乙醇中的應(yīng)用，步驟如下(I)從試管斜面挑取2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28°C、120r/min條件下，活化振蕩培養(yǎng)20h，制得活化后的液態(tài)種子；(2)將步驟(I)制得的液態(tài)種子按照8% (v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28°C、120r/m條件下，培養(yǎng)發(fā)酵，分別在24 40h各時間點(diǎn)加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的滅菌油酸,在28°C、120r/min條件下,繼續(xù)培養(yǎng)至總時間為56h,經(jīng)6000r/min下離心IOmin,取油相,制得2-苯乙醇。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6. 0，蒸餾水定容。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下葡萄糖80. 0g/L、L-苯丙氨酸 25. 0g/L、蛋白胨 10. 0g/L、酵母粉 5. 0g/L,pH5. 5,蒸餾水定容。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的無菌油酸是油酸經(jīng)100°C間歇滅菌過程制得。產(chǎn)物濃度的確定同實(shí)施例2產(chǎn)物濃度的確定，不同之處在于樣品的制備，過程如下取發(fā)酵液8mL于IOmL離心管中，6000r/m離心IOmin,分三層。上層為有機(jī)相,經(jīng)色譜純甲醇稀釋4倍，用0. 22 y m有機(jī)濾膜過濾，收集濾液于ImL離心管中備用；中層為水相，處理方法同單水相發(fā)酵液；下層為微生物細(xì)胞，丟棄或用來測定微生物的生物量。有機(jī)相及水相發(fā)酵液2-苯乙醇測定方法與實(shí)施例2中所述的測定方法相同。有機(jī)相的選擇采用實(shí)施例3的方法，不同之處在于步驟(2)中加入10%滅菌的聚丙二醇2000。滅菌過程同實(shí)施例3。以不加有機(jī)相做為對照。水-有機(jī)溶劑兩相體系中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6菌株代謝生成2-苯乙醇濃度如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WHH6 菌株,2010 年 12 月 20 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC No. 4491。
2.權(quán)利要求I所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) WHH6菌株的培養(yǎng)方法，步驟如下 (1)從試管斜面挑取I 2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/m條件下，活化振蕩培養(yǎng)16 20h，制得活化后的液態(tài)種子； (2)將步驟(1)制得的液態(tài)種子按照8 12%(v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/min條件下，培養(yǎng)50 60h，即得。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(1)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下 酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6. O，蒸餾水定容。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下 葡萄糖80. Og/L、L-苯丙氨酸35. Og/L、蛋白胨10. Og/L、酵母粉5. 0g/L，pH5. 5，蒸餾水定容。
5.權(quán)利要求I所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) WHH6菌株在制備2_苯乙醇中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下 (1)從試管斜面挑取I 2環(huán)釀酒酵母WHH6接入液態(tài)種子培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/min條件下，活化振蕩培養(yǎng)18 22h，制得活化后的液態(tài)種子； (2)將步驟(1)制得的液態(tài)種子按照8 12%(v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 30°C、120 160r/m條件下，培養(yǎng)24 48h，然后加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積18 22%的無菌油酸或無菌丙二醇2000，在28 30°C、120 160r/min條件下，繼續(xù)培養(yǎng)至50 60h,經(jīng)6000r/min下離心5 IOmin,取油相，制得2-苯乙醇。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中液態(tài)種子培養(yǎng)基組分如下 酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6. O，蒸餾水定容。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下 葡萄糖80. 0g/L、L-苯丙氨酸25. 0g/L、蛋白胨10. 0g/L、酵母粉5. 0g/L，pH5. 5，蒸餾水定容。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中加入無菌油酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC No.4491。本發(fā)明篩選出的釀酒酵母WHH6菌株具有2-苯乙醇產(chǎn)量高的特點(diǎn)，經(jīng)檢測，該菌株2-苯乙醇產(chǎn)量可達(dá)到5.8564g/L；并且該菌株對2-苯乙醇耐受性高，有利于該菌株在2-苯乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
文檔編號C12R1/865GK102816708SQ20121030914
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者劉天明, 唐育岐, 劉欣欣 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院