專(zhuān)利名稱(chēng)：一株海洋真菌分枝孢子菌屬真菌球孢枝孢及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌一分枝孢子菌屬真菌球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥一直都是人類(lèi)難以攻克的一個(gè)難題，尋找生理活性強(qiáng)的物質(zhì)成為人類(lèi)攻克疾病的主要工作之一。海洋微生物代謝產(chǎn)物研究是近年來(lái)國(guó)際上新興的研究課題。由于對(duì)陸生動(dòng)植物的藥源發(fā)現(xiàn)越來(lái)越稀少，海洋已成為人類(lèi)開(kāi)墾新藥的處女地。海洋約占地球總面積71%，蘊(yùn)藏著極其豐富的生物資源，是有機(jī)物質(zhì)的最大生產(chǎn)者。在各種天然生物活性分子的來(lái)源中，海洋微生物是最有潛能的。不像陸生植物，海洋微生物能夠產(chǎn)生鹵代次生代謝產(chǎn)物。自1928年青霉素的首次發(fā)現(xiàn)使之在細(xì)菌感染的治療中有一很大突·破，真菌便成為治療疾病的藥物的重要來(lái)源之一。隨之在1971年分離得到的環(huán)孢霉素推動(dòng)了其在免疫藥理學(xué)方面的進(jìn)一步發(fā)展。海洋真菌的代謝產(chǎn)物不僅對(duì)于藥物的開(kāi)發(fā)必不可少，同時(shí)它在植物保護(hù)方面也非常重要，使海洋真菌的研究前景更加廣泛。目前研究較多的抗腫瘤、抑制乙酰膽堿酯酶、抗細(xì)菌和抗氧化等海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物已成為具有生物醫(yī)學(xué)意義的天然化合物豐富來(lái)源，均具有廣闊的藥用前景。故從海洋真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)高活性的物質(zhì)對(duì)于發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物非常的重要，對(duì)疾病的攻克也具有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌——分枝孢子菌屬真菌球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—株具有抗腫瘤活性的海洋真菌-球孢枝孢菌(Cladosporium
sphaerospermum) 100102A,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)=CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。所述球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌落特征如下涂布或劃線(xiàn)接種于平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，28°C培養(yǎng)48 h后長(zhǎng)出圓形、墨綠色、直徑約
0.3^0. 5 cm的菌落；該菌株菌體生長(zhǎng)特征如下在液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48 h后呈顆粒狀貼壁生長(zhǎng)；該菌株生理生化特性如下革蘭氏染色陽(yáng)性。本發(fā)明所述球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A由浙江省東海海域采集的海水中分離和篩選得到的菌株。菌株的篩選純化方法為將采集的海水運(yùn)用稀釋涂布法涂于土豆平板培養(yǎng)基上，28 V培養(yǎng)至菌落數(shù)量不再增加，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)2d，以菌株形態(tài)特征區(qū)別進(jìn)行挑選，即得該菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行菌種鑒定。所述的平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基的組成相同，組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖10 30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為水，ρΗ7· 2 8. O。本發(fā)明經(jīng)篩選獲得的球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,涂布或劃線(xiàn)接種在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，28°C培養(yǎng)48 h后長(zhǎng)出圓形、墨綠色、直徑約O. fO. 3 cm的菌落。將所述的球抱枝抱菌(Cladosporiumsphaerospermum) 100102A 的 16sRNA 部分核苷酸序列與美國(guó)國(guó)立生物信息中心(National Center for Biotechnology InformationUSA, NCBI)的基因庫(kù)中的微生物16sRNA序列比對(duì)，將其命名球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum) 100102A。該菌株的16s rRNA的部分核苷酸序列如下TCCGTAGGGGTAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTTGACCCCGGCCCTCGGGCCGGGATGTTCACAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTCCGGGCGGGGGCCCCGGGTGGACATTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAATTTAATTAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCGACGCGGTCCGCCGCGCGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTTCGTCCCCTCAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGCCGCGGGAGGCCACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA 本發(fā)明還涉及所述的菌球孢枝孢菌100102A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物為治療肝癌或神經(jīng)癌的藥物。具體的，所述應(yīng)用為所述球孢枝孢菌100102A提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述提取物為正丁醇提取物，由如下方法獲得球孢枝孢菌100102A(CCTCC No M 2012290)接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)1Γ30天，得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取濾液用正丁醇萃取，萃取液濃縮得浸膏，浸膏以乙醇水體積比為2 8^10 0為流動(dòng)相，進(jìn)行HP-20大孔樹(shù)脂層析過(guò)柱，梯度洗脫，收集乙醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物；所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨1.5 3 g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比I :1 4的混合液，pH 7 8。所述人工海水每100 ml 組成為=NaCl 2.448 g, Na2SO4 0.3917 g，KCl 0. 0664 g,KBr 0.0096 g，SrCl2 0. 0024 g，MgCl ·6Η20 0.4981 g, CaCl2 .H2O 0.1102 g, NaHCO3 0.0192g, H3BO3 0.0026 g, NaF 0.0004 g,蒸餾水 100 ml。所述菌株在培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面培養(yǎng)活化，然后經(jīng)種子培養(yǎng)、獲得種子菌株再接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)。所述的斜面培養(yǎng)基組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為水，pH7. 2^8. O。所述的平面種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 15g/L，蛋白胨1.5 4g/L，酵母膏
0.5^1. 5g/L，瓊脂15 20g/L，溶劑為水人工海水體積比I :廣4的混合液，pH7. 2^8. O。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 15g/L，蛋白胨1.5 3g/L，酵母膏
0.8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比I :1 4的混合液，pH7 8. O。具體的，所述提取物可由如下方法獲得(I)將海洋真菌球孢枝孢菌CCTCC No M 2012290菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于25 35°C培養(yǎng)2Γ48 h，得到活化后的菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖10 30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為水，PH7. 2 8. O ；(2)將步驟(I)活化培養(yǎng)后海洋真菌孢枝孢菌CCTCC No M 2012290菌體接種至液體種子培養(yǎng)基中，于25 35°C條件下培養(yǎng)16 48h，得到種子菌；所述液體種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 15 g/L，蛋白胨1.5 4 g/L，酵母膏O. 5 1. 5 g/L，溶劑為水人工海水體積比I Γ4的混合液，ρΗ7· 2 8. O ；(3)將步驟(2)種子菌株以19Γ10%的體積比的接種量，移種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 35°C、15(T250 r/min振蕩條件下培養(yǎng)14 30天，得到發(fā)酵液；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨1.5 3 g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比I Γ4的混合液，pH 7 8 ；(4)將步驟(3)的發(fā)酵液于4°C條件下細(xì)胞破碎、離心 或者過(guò)濾，分離除去菌體，取濾液用正丁醇萃取后收集上層萃取液，濃縮揮干制得的油狀提取物總浸膏；(5)將步驟(4)的油狀提取物總浸膏進(jìn)行HP-20大孔樹(shù)脂柱處理，以乙醇水體積比為2 8^10 0為流動(dòng)相，梯度洗脫，收集乙醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明的海洋真菌菌株一球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、容易培養(yǎng)；(2)該菌株的代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性；(3)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性高，其培養(yǎng)所得的發(fā)酵液總浸膏對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)有一定的抗腫瘤活性。對(duì)其總浸膏進(jìn)行過(guò)HP-20大孔樹(shù)脂柱處理，收集得到的小極性部位對(duì)H印G2和PC12細(xì)胞的抑制活性在濃度200 μ g/ml時(shí)抑制率可達(dá)95%以上，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。


圖I為平板培養(yǎng)基上球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌落形態(tài)；圖2為光學(xué)顯微鏡下球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌體形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :菌株的篩選、純化及鑒定( I)將自東海海域采集的海水運(yùn)用稀釋涂布法涂于土豆平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)至菌落數(shù)量不再增加，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)2d，以菌株形態(tài)特征區(qū)別進(jìn)行挑選，即得該菌株。所述土豆平板培養(yǎng)基按如下組成配制土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml ；(2)對(duì)篩選獲得的菌株100102A進(jìn)行16sRNA的PCR產(chǎn)物核苷酸序列比對(duì)，將其命名為球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。實(shí)施例2 :菌株的活化及大規(guī)模培養(yǎng)
(I)將實(shí)施例I中篩選獲得的菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)24 48h，得到活化后的菌株，所述斜面培養(yǎng)基按如下組成配制土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml。(2)將步驟(I)活化培養(yǎng)后的菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中，于28°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)24 48h，得到種子液，所液體種子培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖IOg,蛋白胨2g，酵母膏Ig,蒸懼水400ml,人工海水600ml, ρΗ7· 5。(3)將步驟(2)種子液以8%的體積比的接種量，移種到大規(guī)模液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、15(T250 r/min振蕩條件下培養(yǎng)21d，得到發(fā)酵液。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖IOg,蛋白胨2g,酵母膏Ig,蒸懼水400ml,人工海水600ml, pH7. 5。實(shí)施例3 :海洋真菌球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A在抗腫 瘤活性中的應(yīng)用(I)將實(shí)施例2中培養(yǎng)所得的發(fā)酵液先于超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行菌體破碎20min,然后于4°C條件下離心(9000r/min, 15min)(或者過(guò)濾也可)，除去菌體，用等體積正丁醇進(jìn)行萃取，對(duì)萃取相進(jìn)行旋蒸，所得浸膏即為該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物總浸膏。(2)將實(shí)施例2所得的發(fā)酵液總浸膏進(jìn)行粗略的分離，取IOg總浸膏進(jìn)行上柱(柱高170cm，直徑lcm，填料HP-20大孔吸附樹(shù)脂)，用乙醇水體積比為2 : 8，4 : 6，6 : 4，8 2,10 O的洗脫劑分別進(jìn)行沖洗，每個(gè)梯度沖洗500ml，對(duì)沖洗所得液體進(jìn)行旋蒸處理，最終得5個(gè)部位，分別標(biāo)為A、B、C、D、E。(3)將步驟(I)所得的發(fā)酵液總浸膏以及步驟(2)所得的5個(gè)部位A、B、C、D、E進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)定。具體步驟如下選取兩株腫瘤細(xì)胞，分別為腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12細(xì)胞)和肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，培養(yǎng)48h，待測(cè)樣品(總浸膏、5個(gè)部位A、B、C、D、E)加入O. 1%DMS010 μ L溶解后，用無(wú)血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?00 μ L至試驗(yàn)組中，使得最終發(fā)酵液總浸膏的濃度分別為50 μ g/ml、100μ g/ml、200y g/ml、400y g/ml、800y g/ml，5 個(gè)部位 A、B、C、D、E 的濃度均為 200 μ g/ml，陰性對(duì)照組加等量不含樣品的無(wú)血清培養(yǎng)基，空白對(duì)照組則為無(wú)細(xì)胞和樣品的無(wú)血清培養(yǎng)基，依托泊苷(VP-16)作為陽(yáng)性對(duì)照品，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，腫瘤細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱(37°C )培養(yǎng)48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150 μ L，振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀充分振蕩使得MTT紫色產(chǎn)物完全溶解，測(cè)490nm的A值，根據(jù)公式抑制率=(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)-(A樣品組-A空白對(duì)照組)/ (A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)即可求得抑制率。(4)根據(jù)步驟(I) - (3)所得的數(shù)據(jù)見(jiàn)表廣3。表I :菌株發(fā)酵液浸膏對(duì)!fepG2細(xì)胞的抑制作用
藥物濃度(μ g/ml)I抑制率(％)
5036.30 —
TOO36.78 —
20037.01 —
40045.94 —
800丨51.20 —表2 :菌株發(fā)酵液浸膏對(duì)PC12細(xì)胞的抑制作用
權(quán)利要求
1.一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌-球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum)100102A,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。
2.如權(quán)利要求I所述的球孢枝孢菌100102A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為治療肝癌或神經(jīng)癌的藥物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述球孢枝孢菌100102A提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取物為正丁醇提取物，由如下方法獲得球孢枝孢菌100102A接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)1Γ30天，得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取濾液用正丁醇萃取，萃取液濃縮得浸膏，浸膏以乙醇水體積比為2 8^10 0為流動(dòng)相，進(jìn)行HP-20大孔樹(shù)脂層析過(guò)柱，梯度洗脫，收集乙醇體積濃度80%以上的洗脫液，旋蒸濃縮揮干，即得所述正丁醇提取物；所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨I. 5 3 g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比I :1 4的混合液，pH 7 8。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌——分枝孢子菌屬真菌球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)MNP100102A及其應(yīng)用。該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)CCTCC NoM 2012290，保藏日期2012年7月18日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明菌株?duì)I養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、容易培養(yǎng)；(2)該菌株的代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性；(3)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性高，其培養(yǎng)所得的發(fā)酵液總浸膏對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)有一定的抗腫瘤活性，對(duì)其總浸膏進(jìn)行過(guò)HP-20大孔樹(shù)脂柱處理，收集得到的小極性部位對(duì)HepG2和PC12細(xì)胞的抑制活性在濃度200μg/ml時(shí)抑制率可達(dá)95%以上，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。
文檔編號(hào)C12P1/02GK102911877SQ20121030828
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者王鴻, 謝燕瑾, 葉建軍, 潘超 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)