專利名稱：阪崎腸桿菌的高特異性基因片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種基于阪崎腸桿菌(Cronobacterspp. ) 16S rDNA特異性基因序列的檢測方法，還涉及基于此序列并應(yīng)用磁珠與巢式PCR技術(shù)的檢測方法。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌是一種食源性條件致病菌，可引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、壞死性結(jié)腸炎和菌血癥等疾病，甚至能導(dǎo)致較高的致死率和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥，及發(fā)育障礙(Nazarowecwhite M. , J. M. Farber.Enterobacter sakazakii:A review[J]. InternationalJournal of Food Microbiology, 1997, 34 (2) : 103-113.)。根據(jù)臨床病例顯示，阪崎腸桿菌主要的感染人群為新生兒和免疫力低下的嬰幼兒，以及免疫力受損的成年人及老人，其感染致死率高達409Γ80%。目前，尚不清楚阪崎腸桿菌的污染來源，然而，根據(jù)流行病學(xué)研究表 明，臨床病例中的大多數(shù)病例感染源都是配方奶粉。奶粉中的阪崎腸桿菌的污染問題的嚴(yán)重性引起了世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國對嬰幼兒配方奶粉及食品中阪崎腸桿菌的污染情況的高度重視。2002年國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(ICMSF)將阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長期慢性實質(zhì)性后遺癥”的一種致病菌。FAO和WHO認為阪崎腸桿菌的所有種都是致病的(Organization World Health. Enterobacter sakazakii and other microorganisms inpowdered infant formula:meeting report. [J]. Microbiological risk assessmentseries,no.6. ΓΟηΙinelhttp ://www.who, int/foodsafety/pubIications/micro/enterobacter sakazakii/en/. 2004.)。2004年，我國在安徽阜陽發(fā)生的“大頭娃娃”事件中的奶粉樣品首次檢出阪崎腸桿菌后，制定了針對阪崎腸桿菌在嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中的檢測國家標(biāo)準(zhǔn)，同時在出入境檢驗檢疫中也制定了“奶粉中阪崎腸桿菌的檢測方法”的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。之后，在我國對境內(nèi)生產(chǎn)的奶制品以及進口奶制品的檢查中，多次檢測出多個品牌的奶制品中含有阪崎腸桿菌，其中不乏美贊臣、惠氏、美素等深受中國消費者信賴的國際知名品牌。不只是在我國，在歐美等發(fā)達地區(qū)，奶粉中含有阪崎腸桿菌的事件也層出不窮，2004年美贊臣就曾因阪崎腸桿菌不合格而召回配方奶粉產(chǎn)品?？梢姡嫫槟c桿菌并沒有特定的區(qū)域局限性，這也為預(yù)防阪崎腸桿菌感染帶來了困難，因此，對阪崎腸桿菌進行靈敏而準(zhǔn)確的檢測也顯得尤為重要。目前，國內(nèi)外針對奶粉樣品中阪崎腸桿菌的檢測方法仍以常規(guī)培養(yǎng)方法作為標(biāo)準(zhǔn)，由于其檢測周期長達5-7天，操作復(fù)雜，檢測效率低，難以應(yīng)付現(xiàn)在對于檢測過程高通量、高靈敏度、高效率的要求。盡管后期陸續(xù)開發(fā)出了 PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測手段，并且也被我國的“奶粉中阪崎腸桿菌的檢測方法”的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所采用，但是這兩種方法有著較高的假陽性率，最終仍需要采用培養(yǎng)計數(shù)的方法加以確認。在細菌基因組中，編碼16S rRNA的rDNA基因具有適宜分析的長度(約為15kb)，并且同時具有良好的進化保守性和與進化距離相匹配的良好變異性，即由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，所以成為細菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識序列。在過去的研究中，已經(jīng)有了一些以阪崎腸桿菌的16S rDNA基因的為目的基因進行的PCR檢測技術(shù)(Lehner A等人，Gene based analysis of Enterobacter sakazakii strains from differentsource and development of a PCR assay for identification. [J]Molecular andCellular Probes, 2006. 20 (I) : 11—17)、熒光定量 PCR 檢測技術(shù) Malorny B 等人，Detection of Enterobacter sakazakii strains by real-time PCR[J]. Journal ofFood Protection. 2005,68(8) :1623-1627)以及熒光探針檢測技術(shù)(Almeida C 等人，Development and application of a novel peptide nucleic acid oribe for thespecific detection of Cronobacter genomospecies(Enterobacter sakazakii)inpowered infant formula [J]. AppI. Environ. Microbiol, 2009, 75 (9) : 2925-2930),但是目前普遍認為阪崎腸桿菌各菌株之間序列差異較大，16SrDNA基因特異性相對較差，仍存在特異性不高或靈敏度低等問題。因此，為了滿足檢測要求，急需建立一套更加高效、實用并且準(zhǔn)確的阪崎腸桿菌檢測手段和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了阪崎腸桿菌特異性基因片段一 16S rDNA基因的序列片段，并通過制備用于所述特異性基因片段捕獲的核酸探針磁珠，結(jié)合巢式PCR方法對所捕獲富集的目的序列進行檢測驗證，實現(xiàn)對阪崎腸桿菌的快速檢測，為食品安全的監(jiān)控提供了一種高效、準(zhǔn)確的檢測手段和方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下在本發(fā)明的第一方面，提供了高特異性的阪崎腸桿菌(Cronobacter spp. ) 16SrDNA基因片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列為SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了以如第一方面所述的核苷酸序列為目的序列的檢測方法，優(yōu)選地，所述方法為以如第一方面所述的核苷酸序列為目的序列的核酸探針磁珠與巢式PCR方法相結(jié)合的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法可以包括下列步驟(I)以如第一方面所述的核苷酸序列作為目的序列，設(shè)計核酸探針與兩對引物，并將所述核酸探針的5,末端進行氨基化修飾，其中所述第二對引物的擴增片段的序列包含于所述第一對引物的擴增片段的序列之中；(2)將表面羧基化的磁珠與5'末端氨基化的所述核酸探針進行偶聯(lián)，制備獲得表面包被有核酸探針的核酸探針磁珠；(3)將檢測樣本進行沸水浴處理，裂解所述檢測樣本中的阪崎腸桿菌，釋放基因組DNA ；(4)將所述核酸探針磁珠加入處理后的所述檢測樣本中以捕獲包含如第一方面所述的核苷酸序列的目的基因，之后通過磁分離將所述核酸探針磁珠所捕獲的目的基因從所述檢測樣本中分離出來；和
(5)以分離出的目的基因為模板，利用所述第一對引物和所述第二對引物進行巢式PCR檢測，確定所述檢測樣品中是否含有阪崎腸桿菌16S rDNA基因。在本發(fā)明的檢測的方法中，所述核酸探針的序列可以為PB :5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。在本發(fā)明的檢測方法中，所述第一對引物可以為CsppFl :5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACACA G-3 ' (SEQ IDN0:4)。在本發(fā)明的檢測方法中，所述第二對引物可以為CsppF2 5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5 ' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID N0:6)。在本發(fā)明的檢測方法中，所述方法可包括下列步驟
(a)制備權(quán)利要求2中的所述核酸探針、所述第一對引物和所述第二對引物，并將所述核酸探針的5,末端進行氨基化修飾；(b)將表面羧基化的磁珠與將5'末端氨基化的所述核酸探針進行偶聯(lián)，制備獲得表面包被有所述核酸探針的磁珠；(c)將檢測樣本進行沸水浴5-15分鐘，優(yōu)選地8-12分鐘，更優(yōu)選地10分鐘，裂解所述檢測樣本中的阪崎腸桿菌，釋放基因組DNA序列；Cd)在90-10(TC，優(yōu)選地92_98°C，更優(yōu)選地95°C水浴條件下，將表面包被有所述核酸探針的磁珠加入所述檢測樣本中，混勻后自然冷卻至室溫，將所獲得的混合物在磁力架上進行磁分離，棄上清，并用ddH20洗滌磁珠3-5次后，用20 μ L ddH20重懸磁珠并轉(zhuǎn)移到PCR管中，沸水浴5分鐘后立即進行磁珠分離并獲取上清作為檢測模板；和(e)以所述檢測模版為模板，用所述第一對引物和所述第二對引物進行巢式PCR檢測，確定檢測樣品中是否含有阪崎腸桿菌16S rDNA基因。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種以如第一方面所述的核苷酸序列作為目的序列的核酸探針。本發(fā)明的核酸探針序列可以為PB :5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG ACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種以如第一方面所述的核苷酸序列作為目的序列的引物。本發(fā)明的引物為CsppFl 5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ IDNO: 3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3 ' (SEQ ID NO: 4)或 CsppF2 :5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5 ' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括以如第一方面所述的核苷酸序列作為目的序列設(shè)計的核酸探針與兩對引物，其中第二對引物的擴增片段的序列包含于第一對引物的擴增片段的序列之中并且優(yōu)選地所述核酸探針的5,末端進行氨基化修飾。在本發(fā)明的試劑盒中，所述核酸探針的序列可以為PB :5^ TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。
在本發(fā)明的試劑盒中，所述第一對引物可以為CsppFl 5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACAC AG-3 ' (SEQ IDN0:4)。在本發(fā)明的試劑盒中，所述第二對引物可以為CsppF2 5 ! -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5' -AATGAGTGAAAGGCGTTA CCG-3' (SEQ IDN0:6)。在本發(fā)明的第六方面，提供了如第一方面所述的核苷酸序列、如第二方面所述的檢測方法、如第三方面所述的核酸探針或、如第四方面所述的引物或如第五方面所述的試劑盒在阪崎腸桿菌的檢測中的用途。在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述阪崎腸桿菌的檢測可以為對食品或保健品中阪崎腸桿菌的檢測。
在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述食品可以為乳制品，米制品或調(diào)味料。在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述乳制品可以為牛奶、奶粉或奶酪，更優(yōu)選地為配方奶粉。在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述配方奶粉可以為嬰幼兒配方奶粉或老年配方奶粉在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述米制品可以為米粉。在本發(fā)明的在阪崎腸桿菌的檢測中的用途中，所述調(diào)味料可以為醬油。本發(fā)明具有如下有益效果I、本發(fā)明的高特異性的阪崎腸桿菌(Cronobacter spp. ) 16S rDNA基因片段的核苷酸序列，對阪崎腸桿菌各菌株都有很好的特異性，以該核苷酸序列為目的序列進行的檢測特異性高，假陽性率低；2、本發(fā)明采用核酸探針磁珠捕獲并分離檢測樣本中的阪崎腸桿菌的特異性目的基因，從而消除了檢測樣本中可能含有的PCR抑制因子對檢測的影響并且由于對目的基因進行了富集，因此同時也提高了之后進行的PCR檢測的靈敏度；3、本發(fā)明采用了核酸探針磁珠捕獲并分離檢測樣本中的目的基因序列以及與巢式PCR相結(jié)合的方法對檢測樣本中的阪崎腸桿菌的特異性目的基因進行檢測，在整個檢測過程中，核酸探針捕獲，巢式PCR中的第一輪擴增和第二輪擴增都對目的基因有較高的特異性，因此將核酸探針分離與巢式PCR相結(jié)合將顯著地減少假陽性率，從而大大增加了檢測的準(zhǔn)確度。


圖I核酸探針特異性檢測斑點雜交驗證圖譜，其中1-32均為阪崎腸桿菌，33-55為非阪崎腸桿菌，M:DL2000DNA Marker ；N :陰性對照。圖2巢式PCR引物特異性擴增檢測驗證圖譜，其中1-32均為阪崎腸桿菌，33-55為非阪崎腸桿菌，M:DL2000DNAMarker ；N :陰性對照。圖3不同菌體濃度純培養(yǎng)物樣本檢測圖譜。圖4不同菌體濃度的奶粉樣本檢測圖譜。
圖5含有高濃度雜菌的不同濃度阪崎腸桿菌的奶粉樣本的檢測圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例I :特異性基因片段的獲取I、利用16S rDNA通用引物，以阪崎腸桿菌基因組DNA作為模板，擴增獲得目的序列；2、通過測序得到詳細序列信息，將獲得的序列利用NCBI的Blast工具比對分析篩選獲得保守性高的片段，以阪崎腸桿菌匹配率高達98%以上，而非阪崎腸桿菌的匹配率低于80%為標(biāo)準(zhǔn)；
3、選取兩端的序列，并以引物末端的最后堿基只與阪崎腸桿菌序列匹配，而不與非阪崎腸桿菌序列匹配為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計特異性擴增引物，并利用設(shè)計的引物對阪崎腸桿菌和非阪崎腸桿菌的基因組DNA進行擴增檢測驗證；4、對選取的不同序列的結(jié)果進行比較和選擇，最終獲得了對不同阪崎腸桿菌菌株均具有高特異性的一段16S rDNA基因片段，其序列為TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCGCATTCCTGATTACGGAGAAATGCAGCAGCATGTCTGTTTCAATTTTCAGCTTGTTCCGGATTGTTAAAGAGCAAATATCTCAAACGTGACTTTACAGTCAGTTTTGAGATATTAATCGGTAACGCCTTTCACTCATTACCAGCAGGTGGCGTCCCTTAGGGGATTCGAACCCCTGTTACCGCCGTGAAAGGGCGGTGTCCTGGGCCTCTAGACGAAAGGGACTTCGCTTTCGCAGACAACCCTGCTTCTTTACTTTCTATCAGACAATCTGTGTGAGCACGCGAGG (SEQ ID NO :1)。實施例2 :核酸探針特異性驗證I、設(shè)計特異性核酸探針以實施例I中所篩選獲得的特異性序列作為模板，設(shè)計阪崎腸桿菌特異性捕獲探針，探針的序列如下PB 5/ -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。2、探針特異性檢測驗證采用Southern Blotting雜交印跡實驗對核酸探針的特異性識別、捕獲進行驗證，詳細步驟如下分別取32株阪崎腸桿菌和23株非阪崎腸桿菌(其中包括常見腸道致病菌和益生菌)，并提取每株菌的基因組DNA，95°C熱變性5min后，迅速置于冰水浴中(將其處理為單鏈);分別取熱變性處理的基因組DNA點樣于NC膜，并以ddH20與生物素分別作為陰性和陽性對照，干燥后置于烘箱中68°C處理2h ;將NC膜浸入3%(w/v)的BSA中封閉Ih后，PBS洗滌2遍后，浸入含有用生物素標(biāo)記的核酸探針PB的雜交液中，42 °C孵育雜交4h后，PBS洗滌3遍；加入(1:5000稀釋)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素溶液中，37°C孵育Ih后，PBS洗滌3遍；將膜放入新鮮配制的DAB顯色液中進行顯色，37°C避光顯色10-15min后進行觀察。雜交反應(yīng)結(jié)束見圖I。由此可見本發(fā)明中的核酸探針對阪崎腸桿菌具有非常好的特異性。實施例3 :PCR引物特異性驗證I、引物的設(shè)計以實施例I中所篩選獲得的特異性序列為目的序列作為模板，設(shè)計阪崎腸桿菌特異性擴增引物，引物序列如下
CsppFl :5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3' (SEQ ID N0:3)CsppRl :5' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3' (SEQ ID NO:4)CsppF2 5/ -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:5)CsppR2:5' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)2、引物特異性的驗證以上述32株阪崎腸桿菌和23株非阪崎腸桿菌的基因組DNA為模板，通過巢式PCR擴增檢測驗證引物CsppFl/CsppRl和CsppF2/CsppR2的特異性。步驟如下取各菌株基因組DNA模板進行巢式PCR第一輪擴增，PCR反應(yīng)體系(20 μ L):2XTaqmix 2yL3_CsppFl/CsppRl (I μ M)各取 I μ L，基因組 DNA lyLjjC7yL。PCR 反應(yīng)條 件為:預(yù)變性95°C 5min ;95°C變性30s，63。。退火30s，72。。延伸30s ;最后充分延伸IOmin0第二輪PCR擴增，取第一輪PCR產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪PCR擴增的模板，PCR體系中換用引物CsppF2/CsppR2進行擴增，其他條件不變。PCR完成后，取5 μ L第二輪PCR擴增產(chǎn)物在濃度為I. 5%(w/v)的瓊脂糖凝膠中進行電泳(電泳條件為5V/cm)，利用凝膠成像系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，見圖2。由此可見本發(fā)明中的引物對對阪崎腸桿菌也具有非常好的特異性。實施例4 :核酸探針與表面羧基化磁珠的偶聯(lián)將Y末端氨基化修飾的核酸探針與表面羧基化修飾的磁珠進行偶聯(lián)(磁珠購自上海奧潤微納新材料科技有限公司，ISOnm粒徑，其表面活化，以及與探針偶聯(lián)按照產(chǎn)品說明書進行操作)，制備獲得能夠特異性捕獲、富集阪崎腸桿菌的核酸探針磁珠。實施例5 :核酸探針磁珠的樣本檢測應(yīng)用I、對不同濃度的阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物樣本進行檢測利用核酸探針磁珠捕獲不同濃度梯度的阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物樣本，結(jié)合PCR技術(shù)檢測該方法在純培養(yǎng)物樣本檢測中的靈敏度。用無菌的0.01M PBS梯度稀釋阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物菌體，得到菌體濃度梯度為:108, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°CFU/mL的樣本，每個2mL的離心管中各裝ImL不同濃度的菌體稀釋液作為待檢測樣本。將離心管置于沸水浴IOmin,以裂解細胞釋放基因組DNA ;在951水浴條件下(以保持基因組DNA雙鏈變性狀態(tài))，向每個離心管中加入O. 4mg核酸探針磁珠進行序列捕獲，混勻后待其自然冷卻至室溫；將離心管置于磁力架進行磁分離，棄上清，并用ddH20洗滌磁珠3次后，各用20 μ L ddH20重懸磁珠并轉(zhuǎn)移到新的PCR管中，沸水浴5min后立即進行磁分離取上清；以分離得到的上清作為擴增模板，用于巢式PCR檢測驗證，步驟如上所述，電泳結(jié)果見圖3。2、對不同濃度阪崎腸桿菌的奶粉樣本進行檢測奶粉樣本的制備按照Ig奶粉(已驗證不含阪崎腸桿菌)用9mL無菌水充分溶解混勻；將新鮮培養(yǎng)的阪崎腸桿菌菌體在奶粉樣品中進行梯度稀釋，分別得到濃度為108，IO7, IO6，IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°CFU/mL的奶粉樣本，每個2mL的離心管中各裝ImL不同濃度的菌體稀釋液作為待檢測樣本。磁珠捕獲及PCR檢測步驟同上所述，電泳檢測結(jié)果見圖4。3、對含有高濃度雜交的不同濃度阪崎腸桿菌的奶粉樣本進行檢測為了模擬并考察樣本中可能存在的高濃度雜菌是否會影響該方法的檢測靈敏度，通過向不同濃度阪崎腸桿菌的奶粉樣本中，添加高濃度的雜菌(108CFU/mL的沙門氏菌ATCC13311)，并利用核酸探針磁珠和巢式PCR進行捕獲和檢測，PCR電泳檢測圖譜見圖5。
4、對調(diào)味料樣本的檢測從市場采集、購買了 50份調(diào)味料樣本(包括散裝銷售的樣本)，根據(jù)上述方法進行樣本處理及檢測。檢測結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表I。表I
樣本總數(shù)陽性樣本數(shù)陰性樣本數(shù)陽性率
*>0 1614 32%同時對這50份調(diào)味料樣本進行了傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)檢測，結(jié)果與采用本發(fā)明的方法進行檢測的結(jié)果完全一致。 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細結(jié)構(gòu)特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細結(jié)構(gòu)特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細結(jié)構(gòu)特征以及方法才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.高特異性的阪崎腸桿菌(Cronobacterspp. ) 16S rDNA基因片段的核苷酸序列,所述核苷酸序列為SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。
2.以如權(quán)利要求I的核苷酸序列為目的序列的檢測方法，所述方法為以如權(quán)利要求I的核苷酸序列為目的序列的核酸探針磁珠與巢式PCR方法相結(jié)合的檢測方法。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于包括下列步驟 (O以如權(quán)利要求I所述的核苷酸序列作為目的序列，設(shè)計核酸探針與兩對引物，并將所述核酸探針的5,末端進行氨基化修飾，其中所述第二對引物的擴增片段的序列包含于所述第一對引物的擴增片段的序列之中； (2)將表面羧基化的磁珠與5,末端氨基化的所述核酸探針進行偶聯(lián)，制備獲得表面包被有核酸探針的核酸探針磁珠； (3)將檢測樣本進行沸水浴處理，裂解所述檢測樣本中的阪崎腸桿菌，釋放基因組DNA ； (4)將所述核酸探針磁珠加入處理后的所述檢測樣本中以捕獲包含如權(quán)利要求I所述的核苷酸序列的目的基因，之后通過磁分離將所述核酸探針磁珠所捕獲的目的基因從所述檢測樣本中分離出來；和， (5)以分離出的目的基因為模板，利用所述第一對引物和所述第二對引物進行巢式PCR檢測，確定所述檢測樣品中是否含有所述目的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸探針的序列為PB:5'TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO: 2);所述第一對引物為 CsppFl 5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3'(SEQ ID N0:4)和 / 或所述第二對引物為 CsppF2 :5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQID N0:5)和 CsppR2 :5' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (a)制備權(quán)利要求2中的所述核酸探針、所述第一對引物和所述第二對引物，并將所述核酸探針的5,末端進行氨基化修飾； (b)將表面羧基化的磁珠與將5,末端氨基化的所述核酸探針進行偶聯(lián)，制備獲得表面包被有所述核酸探針的磁珠； (c)將檢測樣本進行沸水浴5-15分鐘，優(yōu)選地8-12分鐘，更優(yōu)選地10分鐘，裂解所述檢測樣本中的阪崎腸桿菌，釋放基因組DNA序列； Cd)在90-10(TC，優(yōu)選地92-98°C，更優(yōu)選地95°C水浴條件下，將表面包被有所述核酸探針的磁珠加入所述檢測樣本中，混勻后自然冷卻至室溫，將所獲得的混合物在磁力架上進行磁分離，棄上清，并用ddH20洗滌磁珠3-5次后，用20 μ L ddH20重懸磁珠并轉(zhuǎn)移到PCR管中，沸水浴5分鐘后立即進行磁珠分離并獲取上清作為檢測模板；和 Ce)以所述檢測模版為模板，用所述所述第一對引物和所述第二對引物進行巢式PCR檢測，確定檢測樣品中是否含有所述目的序列。
6.以如權(quán)利要求I所述的核苷酸序列作為目的序列的核酸探針，優(yōu)選地，所述核酸探針為 SEQ ID NO:2。
7.以如權(quán)利要求I所述的核苷酸序列作為目的序列的引物，優(yōu)選地，所述引物為SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4 或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
8.一種試劑盒，所述試劑盒包括以如權(quán)利要求I所述核苷酸序列作為目的序列的核酸探針與兩對引物，其中第二對引物的擴增片段的序列包含于第一對引物的擴增片段的序列之中并且優(yōu)選地所述核酸探針的5'末端進行氨基化修飾，優(yōu)選地，所述核酸探針的序列為SEQ ID NO:2 ;所述第一對引物為SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4和/或所述第二對引物為SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
9.如權(quán)利要求I所述的核苷酸序列、如權(quán)利要求2-5中任一項所述的檢測方法、如權(quán)利要求6所述的核酸探針、如權(quán)利要求7所述的引物或權(quán)利要求8所述的試劑盒在阪崎腸桿菌的檢測中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述阪崎腸桿菌的檢測為對食品或保健品中的阪崎腸桿菌的檢測，優(yōu)選地，所述食品為乳制品，米制品或調(diào)味料，其中所述乳制品優(yōu)選地為牛奶、奶粉或奶酪，更優(yōu)選地為配方奶粉，最優(yōu)選地為嬰幼兒配方奶粉或老年配方奶粉，所述米制品優(yōu)選地為米粉，所述調(diào)味料優(yōu)選地為醬油。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于阪崎腸桿菌(Cronobacter spp.)16S rDNA基因序列，結(jié)合磁珠及巢式PCR技術(shù)對阪崎腸桿菌進行特異性檢測的方法。本發(fā)明的優(yōu)點是利用阪崎腸桿菌16S rDNA基因序列的特異性探針及引物，結(jié)合磁珠到達對樣本中阪崎腸桿菌目的基因進行快速、特異地捕獲和富集，最后通過巢式PCR技術(shù)進行擴增檢測，提高檢測的靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102816761SQ20121030811
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者李林, 楊曉慧, 許恒毅, 徐鋒 申請人:無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司