一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白活性檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代生活水平的提高和生活方式的改變，肥胖的發(fā)生率越來(lái)越高，同時(shí)肥胖所伴隨的脂質(zhì)增加，異位沉積增多使得肥胖相關(guān)的疾病發(fā)病率逐年增高。因此，有效的降低肥胖伴隨的脂質(zhì)沉積是當(dāng)今醫(yī)學(xué)面臨的重要挑戰(zhàn)。
[0003]肥胖是由于能量攝入與能量消耗不平衡導(dǎo)致脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)多甘油三酯(TG)，細(xì)胞體積異常增大的結(jié)果，其根源是脂代謝異常。而脂代謝異常的實(shí)質(zhì)是指脂蛋白和載脂蛋白的異常，載脂蛋白作為脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，不僅在結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)、穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要作用，而且還具有調(diào)節(jié)脂蛋白代謝關(guān)鍵酶的活性，參與脂蛋白受體的識(shí)別的作用，它參與了人體脂類代謝的全過(guò)程。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與脂代謝中有重要作用的載脂蛋白，如 ApoAK ApoA2、ApoA4、ApoB48、ApoBlOO、ApoCl、ApoC2、ApoC3 和 ApoE 等。
[0004]ApoA5是2001年發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，目前的研宄證實(shí)其與肥胖及代謝綜合征的發(fā)生有著密切的關(guān)系。已有的研宄證實(shí)，ApoA5能顯著降低血液中TG，同時(shí)ApoA5能夠被脂肪細(xì)胞攝取，滯留于脂滴表面，并降低脂肪細(xì)胞中的TG，因此，ApoA5被認(rèn)為是能夠有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積的載脂蛋白，未來(lái)有可能運(yùn)用于肥胖患者，達(dá)到降低血液中的脂質(zhì)的目的。而目前ApoA5主要是通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來(lái)獲得，因此檢測(cè)合成的ApoA5的生物學(xué)活性至關(guān)重要，可為進(jìn)一步研宄ApoA5對(duì)脂質(zhì)的調(diào)控奠定基礎(chǔ)，為其將來(lái)運(yùn)用于臨床有重要的意義。
[0005]目前，檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法較少。因此，提供一種檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒。該檢測(cè)方法通過(guò)觀察HL-1心肌細(xì)胞對(duì)ApoA5的攝取情況可準(zhǔn)確檢測(cè)ApoA5的生物學(xué)活性。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法，包括如下步驟:
[0009]將HL-1心肌細(xì)胞與ApoA5孵育，經(jīng)固定、打孔后，與ApoA5第一抗體孵育，再與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育，觀察所述熒光標(biāo)記在HL-1心肌細(xì)胞中的位置，獲得ApoA5生物學(xué)活性。
[0010]研宄發(fā)現(xiàn)HL-1心肌細(xì)胞對(duì)ApoA5的攝取主要通過(guò)細(xì)胞膜上的受體介導(dǎo)來(lái)完成，其中低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I(LRPl)在攝取ApoA5的過(guò)程中起主要作用。本發(fā)明將ApoA5與HL-1心肌細(xì)胞充分孵育后，采用免疫熒光標(biāo)記ApoA5，通過(guò)激光共聚焦技術(shù)來(lái)觀察HL-1心肌細(xì)胞對(duì)ApoA5的攝取情況，若ApoA5分布在HL-1心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明ApoA5具有生物學(xué)活性，能夠通過(guò)受體介導(dǎo)進(jìn)入HL-1心肌細(xì)胞中。
[0011]為了使HL-1心肌細(xì)胞攝取具有生物學(xué)活性的ApoA5，需將HL-1心肌細(xì)胞與ApoA5進(jìn)行孵育。在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，與ApoA5孵育的時(shí)間為12?24小時(shí)，溫度為37。。。
[0012]作為優(yōu)選，與ApoA5孵育的時(shí)間為12小時(shí)，溫度為37°C。
[0013]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，固定采用的試劑為多聚甲酸。
[0014]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，打孔采用的試劑為TritonX-100。
[0015]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，與ApoA5第一抗體孵育的時(shí)間為8?24小時(shí)，溫度為4°C。
[0016]作為優(yōu)選，與ApoA5第一抗體孵育的時(shí)間為12小時(shí)，溫度為4°C。
[0017]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育具體為:在15?30°C、避光條件下與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育30?40分鐘。
[0018]作為優(yōu)選，與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育具體為:在20°C、避光條件下與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育30分鐘。
[0019]作為優(yōu)選，ApoA5的濃度為600?3000ng/mL。
[0020]優(yōu)選地，ApoA5的濃度為 600 ?1800ng/mL。
[0021]更優(yōu)選地，ApoA5的濃度為600ng/mL。
[0022]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，觀察為采用激光共聚焦技術(shù)觀察。
[0023]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，固定的時(shí)間為15?25分鐘。
[0024]作為優(yōu)選，固定的時(shí)間為20分鐘。
[0025]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，打孔的時(shí)間為5?15分鐘。
[0026]作為優(yōu)選，打孔的時(shí)間為10分鐘。
[0027]在打孔和與ApoA5第一抗體孵育之間還包括加入BSA的操作，用以封閉雜質(zhì)蛋白與一抗結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，封閉的時(shí)間為30分鐘。
[0028]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，熒光標(biāo)記為CY3標(biāo)記。但本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為可行的熒光標(biāo)記均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不作限定。
[0029]在與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育和觀察所述熒光標(biāo)記在HL-1心肌細(xì)胞中的位置之間還包括對(duì)細(xì)胞核染色的步驟。
[0030]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，染色采用的染色液為DAPI。
[0031]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，染色的時(shí)間為10分鐘。
[0032]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的試劑盒，包括HL-1心肌細(xì)胞、ApoA5、固定劑、打孔劑、ApoA5第一抗體、焚光標(biāo)記的ApoA5第二抗體。
[0033]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，固定劑為多聚甲酸。
[0034]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，打孔劑為TritonX-100。
[0035]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，焚光標(biāo)記為CY3標(biāo)記。
[0036]本發(fā)明提供了一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒。該方法包括:將HL-1心肌細(xì)胞與ApoA5孵育，經(jīng)固定、打孔后，與ApoA5第一抗體孵育，再與熒光標(biāo)記的ApoA5第二抗體孵育，觀察所述熒光標(biāo)記在HL-1心肌細(xì)胞中的位置，獲得ApoA5生物學(xué)活性。通過(guò)檢測(cè)實(shí)例可知，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法通過(guò)觀察HL-1心肌細(xì)胞對(duì)ApoA5的攝取情況可準(zhǔn)確檢測(cè)ApoA5的生物學(xué)活性。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1示實(shí)施例1中加入ApoA5第一抗體的試驗(yàn)孔細(xì)胞的激光共聚焦圖片；
[0038]圖2示實(shí)施例1中未加ApoA5第一抗體的陰性對(duì)照孔細(xì)胞的激光共聚焦圖片；
[0039]圖3示實(shí)施例3中細(xì)胞激光共聚焦圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0040]本發(fā)明公開了一種非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0041]本發(fā)明提供的非診斷目的檢測(cè)ApoA5生物學(xué)活性的方法及試劑盒中所用試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。ApoA5的來(lái)源為湖南遠(yuǎn)泰生物生物技術(shù)有限公司。
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0043]實(shí)施例1ΑροΑ5生物學(xué)活性的檢測(cè)
[0044]ApoA5的攝