專利名稱：用于測定堿性磷酸酶和消除血紅蛋白干擾的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種用于通過光學(xué)測量測定一個樣品中的堿性磷酸酶的方法，該方法通過特定波長組合的手段消除了游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾，本發(fā)明還涉及到一種在堿性磷酸酶的測定中消除游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾的方法以及特定波長的組合在消除游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾中的使用。
溶血作用已知可以嚴重干擾一些用于測定分析的診斷方法。溶血作用被理解為紅血球的任何的損壞，例如，通過機械，滲透壓，化學(xué)和酶對紅血球細胞膜的作用而造成的損壞。作為溶血作用的后果，血色素血紅蛋白(Hb)被釋放并且不能從樣品中去除。血紅蛋白的存在是有問題的，這是因為，一方面，在一些情況下血紅蛋白的吸收光譜同被檢測的物質(zhì)和指示劑(生色原)的吸收光譜有較大的重疊，這可導(dǎo)致在光度檢測中的錯誤。在另一方面，血紅蛋白還可以同樣品成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而形成也可導(dǎo)致失敗的測量的物質(zhì)。
近來，基于血紅蛋白而制造的血液代用品(Blutersatzmittel)被越來越頻繁的用于醫(yī)療目的，例如在大量失血后使用。血液代用品中的血紅蛋白可以是天然的或合成的。通常還使用了類似Hb的化合物。同溶血作用相比，在以血液代用品進行的治療中血液、血清或血漿中的Hb成分可能高于2000mg/dl。因此含有血液代用品的樣品中的干擾通常比發(fā)生溶血的樣品更加顯著，這是因為從一開始血紅蛋白或其合成的類似物就處于游離狀態(tài)。
游離的血紅蛋白所造成的干擾在對堿性磷酸酶的光度測定中尤其嚴重。在415nm下測量4-硝基酚的形成(吸光度的增加)以測定堿性磷酸酶。血紅蛋白在415nm下也有吸收。血紅蛋白的存在在兩方面干擾了堿性磷酸酶的測定一方面，在堿性環(huán)境中，Hb的光譜以一種時間依賴的方式變化(吸光度增加)，另一方面，超過一特定的Hb含量時測量設(shè)備將達到光度計的極限。
此前的工藝中已有多種在血清或血漿樣品的分析中消除血紅蛋白光譜和化學(xué)影響的方法發(fā)表。
由于在自動分析儀上操作簡單，除第一種測量波長(主波長(HauptmeBwellenlnge))外，通常還使用第二種測量波長(次波長(HebenmeBwellenlnge))以消除諸如血紅蛋白、膽紅素和脂血這樣的干擾物質(zhì)的干擾效應(yīng)或至少使該效應(yīng)最小化。在Clin.Chem.25/6，951-959(1979)中Hahn等人提及次波長必須被選擇以使其接近生色原的最小吸收和干擾物質(zhì)的最大吸收。但是，使用所提及的測量程序以消除堿性磷酸酶測定中的干擾是不可能的。
Jay和Provasek在C1in.Chem.39/9，1804-1810(1993)中述及堿性磷酸酶測定中的溶血作用干擾是由于Hb光譜的時間依賴的變化所導(dǎo)致。該干擾可通過數(shù)學(xué)校正算法確定(測定樣品中Hb濃度，在一定量下，校正堿性磷酸酶的測定值，該定量與測定的Hb量相等)。
Jay和Provasek提及的數(shù)學(xué)校正消除了可達至少800mg/dL Hg的干擾，然而，使用戶困撓的是，需要另外測定Hb含量，隨后還需額外的數(shù)學(xué)校正步驟。
Jay和Provasek(見上文)還描述了通過速率空白法消除干擾的方法。
通過速率空白(rate-blank)測量以校正溶血作用干擾也在EP-A-0695805中有描述。在該方法中，在對樣品中的一個組分進行實際的光度測定之前對樣品進行預(yù)反應(yīng)以測定樣品的溶血作用的程度。隨后獲得的測量值以一個數(shù)值對進行校正，用于校正的該數(shù)值通過將溶血程度同干擾物質(zhì)在測量誤差中的作用量相聯(lián)系而確定。
Hb干擾可以通過速率空白測量而消除，但最高只限于Hb含量為ca.1200mg/dl，這是由于在更高的Hb含量下達到了光度計的極限。這對于消除溶血作用的干擾可能足夠，但根本不足以消除血液代用品所造成的干擾。
另一種在白蛋白測定中消除血紅蛋白干擾的方法也被公布(PCT申請WO 97/45728)，該方法通過主波長和次波長的特定組合達到了對血紅蛋白干擾的消除。但是，在該PCT申請中所提及的波長組合不能用于堿性磷酸酶測定，這是由于在這些波長下不能獲得4一硝基酚的測量信號。
待審的出版物WO 97/45733述及可以通過在單獨的紫外測試中使用波長546和570可以消除血紅蛋白的干擾。但是，該方法只能用于使用340nm主測量波長的的酶學(xué)紫外測試。盡管單獨通過使用次波長546或570nm可以達到對Hb干擾的完全消除，但這對于酶學(xué)生色原的測試，例如波長在415nm范圍內(nèi)的堿性磷酸酶的檢測是不可能的。
美國專利5,766,872提及577nm的次波長可在淀粉酶的測定中降低溶血作用的干擾。但是，被引用的測量數(shù)據(jù)表明在Hb含量為500mg/dl時測出的數(shù)值有達到8％的明顯偏差。這對于消除溶血作用的干擾可能足夠，但有可能在較高的Hb含量(例如在以血液代用品進行治療時的Hb含量)下，由于使用ca.415nm為主波長，這一測出的數(shù)值的偏差將變得更大并且對Hb干擾的消除不足。
在先前的領(lǐng)域中，在高濃度的Hb存在下，例如在含有血液代用品的樣品中，沒有任何方法已知可用于無干擾地測定堿性磷酸酶。
因此，本文目的為開發(fā)一種改進的方法以用于樣品中的堿性磷酸酶的測定，該方法能較大地克服先前工藝的不足。本文還特別意圖提供一種簡單并且對用戶友好的方法以消除在測定堿性磷酸酶時血紅蛋白和基于血紅蛋白的血液代用品所造成的干擾。
通過一種方法該目的已經(jīng)達到，該方法用于通過光學(xué)測量測定樣品中的堿性磷酸酶，它在權(quán)利要求中有更詳盡描述。該方法的特征在于使用450±10nm作為主測波長以及使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一種作為次測波長。在優(yōu)選情況下，只使用所述的次測波長中的一種。
令人驚奇的是，當(dāng)變化主波長和刺激波長時，堿性磷酸酶的Hb干擾可被有效地消除。對于Hb干擾的令人滿意的消除，僅僅變化主波長或僅僅變化次波長是不夠的。
由于4-硝基酚的吸收譜，測量堿性磷酸酶不僅可以在415nm下進行，而且在450±10nm也可進行。盡管此時主吸收波長不在檢測反應(yīng)通常的最大吸收處而是在其側(cè)翼，但獲得的測出信號對堿性磷酸酶的精確測定是足夠的。
新的主測量波長450±10nm的選擇已經(jīng)導(dǎo)致了血紅蛋白干擾的輕微減低，但只有將主波長450±10nm同次波長480±10nm、546±10nm或575±10nm中的至少一種進行組合才能令人驚奇地獲得對干擾的完全消除。次波長570nm被證明是特別適合的。次波長450±10nm已經(jīng)證明非常適合于消除以ICFF法測定堿性磷酸酶時的血紅蛋白干擾(實施例2)。
其它的次波長如340，376，505，600，660和770nm已經(jīng)證明不適合消除血紅蛋白干擾。
本發(fā)明的方法使得血紅蛋白或類血紅蛋白的化合物對堿性磷酸酶測定的干擾能夠首次以簡單的方式被消除，Hb含量可達到至少3000mg/dl。對Hb干擾的消除的上限決定于光度計的效能。因此本發(fā)明的方法可預(yù)期獲得對含量高達6500mg/dl的血紅蛋白的干擾的消除。本發(fā)明可進一步應(yīng)用于堿性磷酸酶的多種檢測試劑，如實施例1-3所示。
本發(fā)明的方法適用于任何存在有游離的血紅蛋白的樣品的測定。在本發(fā)明的理解中，術(shù)語游離的血紅蛋白被用于區(qū)分存在于完整的紅血球中的血紅蛋白。含有游離的血紅蛋白的樣品的例子為發(fā)生溶血的血清或血漿樣品或含有血液代用品的樣品。屬于本發(fā)明的理解中的術(shù)語游離血紅蛋白的血液代用品的例子為衍生的、多聚化的、修飾或交聯(lián)的血紅蛋白衍生物并且特別包括人類血紅蛋白或牛血紅蛋白，例如DCL血紅蛋白(琥珀酰水楊酸(Diaspirin)交聯(lián)的血紅蛋白)或重組產(chǎn)生的血紅蛋白。
本發(fā)明還涉及到一種用于在測定堿性磷酸酶的方法中消除游離的血紅蛋白所導(dǎo)致的干擾的方法。該方法的特征在于使用450±10nm作為主測波長以及使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一種作為次測波長。
本發(fā)明的一個進一步的主題內(nèi)容是主測波長450±10nm同次測波長480±10nm、546±10nm或575±10nm中的至少一種進行組合使用以在測定堿性磷酸酶的方法中消除游離血紅蛋白或基于血紅蛋白制造的血液代用品所造成的干擾。
本發(fā)明通過以下的實施例來闡明實施例通用方法一種含有Hb的溶液被加入一個血清庫的一部分以產(chǎn)生至少為3000mg/dl的Hb含量。同一血清庫的相同體積的另一部分同相等量的NaCl溶液(154mmol/l)相混合。兩部分隨后以不同的比例相互混合以獲得一Hb濃度系列，包含11個樣品，其中較低的樣品不含Hb而最高的樣品含至少3000mg/dl的Hb。
實施例1根據(jù)SFBC法測定堿性磷酸酶根據(jù)Ann.Biol.Clin.Vol.35，271(1977)，按照SociétéFrancaise de Biologie Clinique的建議的測定該測定在一臺Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析儀上進行。
以下的試劑被使用試劑1930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液pH 10.5；1.03mmol/l天冬氨酸鎂試劑2930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液pH 10.5；1.03mmol/l天冬氨酸鎂；98mmol/l 4-硝基苯基磷酸鹽測試程序如下向11μl樣品加入250μl試劑1，5分鐘后加入50μl試劑2。再過50秒鐘后，在4分鐘的期間內(nèi)測定分析物，在此期間測量吸光度的變化。以下的主測波長(λ1)和次級檢測波長(λ2)的組合被用于測量λ1/λ2＝415/546nm，415/570nm，415/660nm，450/660nm，(對比)，450/546nm和450/570nm(發(fā)明)。
堿性磷酸酶通過Jay和Provasek所述的速率空白測量來測定以作為進一步的比較(稱作415/660nm RB)。
結(jié)果如表1所示?？梢砸姷?，同其它的波長組合或速率空白測量相比較，當(dāng)使用本發(fā)明的測量波長組合450/546nm或450/570nm時血紅蛋白的影響被明顯降低。表137℃下測出堿性磷酸酶的U/l含量
*在該情況下使用了一種交聯(lián)的血紅蛋白。
實施例2根據(jù)IFCC法測定堿性磷酸酶根據(jù)J.Clin.Chem.Clin.Biochem.Vol.21，731-748(1983)，按照International Federation of ClinicalChemistry的建議的測定該測定在一臺Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析儀上進行。
以下的試劑被使用試劑1360mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液pH 10.4(30℃)；2.04mmol/l乙酸鎂；1.02mmol/l硫酸鋅；2.04mmol/l N-(2-羥乙基)-乙二胺三乙酸試劑2360mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液pH 10.4(30℃)；2.04mmol/l乙酸鎂；1.02mmol/l硫酸鋅；2.04mmol/l N-(2-羥乙基)-乙二胺三乙酸104mmol/l 4-硝基苯磷酸鹽測試程序如下向7μl樣品加入250μl試劑1，5分鐘后加入60μl試劑2。再過50秒鐘后，在4分鐘的期間內(nèi)測定分析物，在此4分鐘的期間測量吸光度的變化。以下的主測波長(λ1)和次級檢測波長(λ2)的組合被用于測量λ1/λ2＝415/700nm，(對比例)，450/480nm(發(fā)明)。
結(jié)果如表2所示?？梢砸姷?，同先前的測量波長組合415/700nm相比較，當(dāng)使用本發(fā)明的測量波長組合450/480nm時血紅蛋白的影響被明顯降低，而且在高濃度的Hb下無負值出現(xiàn)。
表237℃下測出堿性磷酸酶的U/l含量
*在該情況下使用了一種重組產(chǎn)生的血紅蛋白。
實施例3根據(jù)DGKC法測定堿性磷酸酶根據(jù)Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.Vol.10，290(1972)，按照“Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie”的建議的測定該測定在一臺Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析儀上進行。
以下的試劑被使用試劑11.02mmol/l二乙醇胺緩沖液pH 9.8；0.51mmol/l氯化鎂試劑21.02mmol/l二乙醇胺緩沖液pH 9.8；0.51mmol/l氯化鎂61mmol/l 4-硝基酚磷酸鹽測試程序如下向4μl樣品加入250μl試劑1.5分鐘后加入50μl試劑2。再過50秒鐘后，在4分鐘的期間內(nèi)測定分析物，在此期間測量吸光度的變化。以下的主測波長(λ1)和次級檢測波長(λ2)的組合被用于測量λ1/λ2＝415/770(對比)，450/546nm(發(fā)明)。
結(jié)果如表3所示?？梢砸姷剑惹暗臏y量波長組合415/700nm相比較，當(dāng)使用本發(fā)明的測量波長組合450/546nm時血紅蛋白的影響被明顯降低，而且在高濃度的Hb下無負值出現(xiàn)。表337℃下測出堿性磷酸酶的U/l含量
*在該情況下使用了一種多聚化的血紅蛋白。
權(quán)利要求
1.通過光學(xué)測量測定樣品中的堿性磷酸酶的方法，其中450±10nm被用作主測波長，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一種作為次測波長。
2.權(quán)利要求1的方法，其中480±10nm被用作次測波長。
3.權(quán)利要求1的方法，其中546±10nm被用作次測波長。
4.權(quán)利要求1的方法，其中575±10nm被用作次測波長。
5.權(quán)利要求1的方法，其中570nm被用作次測波長。
6.前述權(quán)利要求之一所要求的方法，其中測定在血清或血漿樣品中進行。
7.前述權(quán)利要求之一所要求的方法，其中被測定的樣品含有游離的血紅蛋白或基于血紅蛋白的血液代用品。
8.權(quán)利要求7的方法，其中血液代用品含有一種衍生的，多聚化的，經(jīng)修飾或交聯(lián)的人類血紅蛋白，牛血紅蛋白或一種重組生產(chǎn)的血紅蛋白。
9.前述權(quán)利要求之一所要求的方法，其樣品含有最高達6500mg/dl的血紅蛋白。
10.用于在測定堿性磷酸酶的方法中消除游離的血紅蛋白或血液代用品所造成的干擾的方法，其中450±10nm被用作主測波長，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一種作為次測波長。
11.一種主測波長450±10nm同次波長480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一種的組合的應(yīng)用，以在測定堿性磷酸酶的方法中消除游離的血紅蛋白或血液代用品所造成的干擾。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種用于通過光學(xué)測量測定一個樣品中的堿性磷酸酶的方法,該方法通過特定波長組合的手段消除了游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾,本發(fā)明還涉及到一種在堿性磷酸酶的測定中消除游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾的方法以及特定波長的組合在消除游離的血紅蛋白或血液代用品的干擾中的使用。
文檔編號G01N21/27GK1329672SQ99814175
公開日2002年1月2日 申請日期1999年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月8日
發(fā)明者R·維謝特, W·特雷貝爾 申請人:羅赫診斷器材股份有限公司