本發(fā)明涉及用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的試劑盒以及用其測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的方法，更具體地，涉及用于測量人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的試劑盒，所述試劑盒包括樣品用稀釋劑、綴合物用稀釋劑以及洗滌液，并且用于通過間接的酶聯(lián)免疫吸附測定(下文稱為間接elisa)進行分析，并且本發(fā)明涉及用其測量人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的方法。
背景技術(shù)：
：在感染乙型肝炎病毒或接種乙型肝炎病毒疫苗后產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒表面抗原抗體(抗hbag抗體)，其被用于通過抗hb抗體滴度試驗(確定10miu/ml或更低的抗hb濃度為非免疫性抗hb濃度)測量所產(chǎn)生的抗hb抗體的濃度來檢測乙型肝炎病毒疫苗的結(jié)果。此外，在患有作為基礎(chǔ)疾病的乙型肝炎病毒的乙型肝炎的肝移植中，使用抗hbag抗體來檢測給藥乙肝免疫球蛋白(hbig)時抗hb抗體的滴度，以便防止再次感染乙型肝炎病毒。作為分析抗hb抗體滴度的方法，可以使用酶免疫測量法(eia)、化學(xué)發(fā)光微粒免疫測量法(cmia)、放射免疫測量法(ria)等。(el-madhun等人，vaccine，16：156-160,1998；l.hahaheim等人，internationalcongressseries，1219：283-289,2001；oddodinsen等人，clin.vaccineimmunol.，14(10)：1623-1628,2007；p.kryger等人，j.clin.microbiol.，13：405-409,1981)。用于分析抗hb抗體滴度的方法是通過在微孔板或微粒上涂布乙型肝炎病毒的表面抗原(hbag)，使表面抗原與要測量的樣品反應(yīng)，然后通過使用與酶或放射性同位素結(jié)合的乙型肝炎病毒的表面抗原(hbag)來測量顯色、發(fā)光或同位素的量，從而測量抗體的滴度。代表性的igg抗體的具有y形狀。如圖1a所示，抗原結(jié)合位點存在于y形的兩端，使得抗原與每個位點結(jié)合。如圖1a所示，通常當(dāng)將包被在底部的乙型肝炎病毒的表面抗原(以下稱為被包被的hbag)結(jié)合到抗hb抗體的抗原結(jié)合位點的一個位點，并且用酶或放射性同位素標記的乙型肝炎病毒的表面抗原(以下稱為標記的hbag)與其它位點結(jié)合，即表面抗原與每個位點結(jié)合時，進行滴度測量。然而，當(dāng)測量由株式會社綠十字開發(fā)的抗hb單克隆抗體的滴度時，根據(jù)圖1a所述的方法，不需要人血漿或血清，測量的滴度比圖1d中描述的方法低約20至100倍。認為通過圖1a的方法測量的抗hb單克隆抗體的抗hb滴度較低的原因?qū)嶋H上可能是由于組合引起的概率誤差，例如圖1b或圖1c。也就是說，可發(fā)生其中待測抗體的兩個結(jié)合位點與被包被的hbag或標記的hbag兩者結(jié)合的情形(圖1b)，或者當(dāng)抗體的其它位點與抗原結(jié)合時抗體的一個結(jié)合位點不能結(jié)合一個抗原的情形(圖1c)，因此可能不能精確測量抗體的量。此外，即使通過圖1d所示的方法測量滴度以克服上述問題，但是當(dāng)使用由株式會社綠十字開發(fā)的諸如抗hb單克隆抗體的完全人抗體時，可發(fā)生如圖2所示的完全人抗體與人血漿或血清中原來存在的其他人抗體的非特異性結(jié)合，并且識別包含人fc的蛋白質(zhì)的二抗不能區(qū)分抗hb單克隆抗體的非特異性結(jié)合和特異性結(jié)合，引起高背景噪音，因此通常仍難以測量滴度。為了解決上述缺點，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過基于間接elisa測量滴度的方法，僅通過精確測量可減小諸如圖1d的特異反應(yīng)的測量誤差；然而，測試對象中抗體滴度的測量精度仍然很低。因此，本發(fā)明人努力消除現(xiàn)有在人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度測量的概率誤差，并提高其精度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用的測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒包括各自具有特定組成的樣品用稀釋劑、綴合物用稀釋劑和洗滌液時，測量人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的概率誤差顯著降低，并且提高了檢測對象中抗體滴度的測量精度，完成了本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：【技術(shù)問題】本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高測量人血漿或血清中人抗體、人源化抗體或人fc-融合蛋白的滴度的測量精度的測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的試劑盒，以及用其測量人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)(特別是抗體)的滴度的方法?！炯夹g(shù)方案】為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的試劑盒，包括：(a)樣品用稀釋劑，包括牛血清、脫脂牛奶和非離子型表面活性劑；(b)綴合物用稀釋劑，包括動物源性血清；以及(c)洗滌液，包含醋酸鈉、氯化鈉以及非離子型表面活性劑。本發(fā)明還提供了測量包含人類fc的蛋白質(zhì)的滴度的方法，所述方法包括：(a)通過使用樣品用稀釋劑稀釋包括含有人類fc的蛋白質(zhì)的樣品；(b)加入以各種濃度稀釋的標準溶液與所述樣品用稀釋劑，并使所述以各種濃度稀釋的標準溶液與所述樣品用稀釋劑在吸收靶抗原的板(plate)的孔中反應(yīng)；(c)吸取每個孔的內(nèi)容物，并用洗滌液洗滌每個孔；(d)完全除去殘留在所述每個孔中的洗滌液，并在每個要進行反應(yīng)的孔中加入綴合物用稀釋劑；(e)吸取每個孔的內(nèi)容物，并用所述洗滌液洗滌每個孔；(f)完全除去殘留在所述每個孔中的洗滌液，并在每個要進行反應(yīng)的孔中加入底物溶液；(g)通過在每個孔中加入終止反應(yīng)的溶液而終止反應(yīng)；以及(h)測量所述標準溶液和所述樣品的吸光度。附圖說明圖1是說明用于測量乙型肝炎病毒表面抗體(抗hb)的抗體滴度的方法的示意圖。圖2是說明現(xiàn)有測量抗hb滴度的方法在人血漿或人血清中問題的示意圖。圖3是說明根據(jù)本發(fā)明的用于測量抗hb抗體滴度的方法的示意圖。圖4是說明使用hepabig-geneelisa和ria(amc)測量抗體滴度實驗的最終分析結(jié)果的線性回歸分析結(jié)果的圖。圖5是說明ria(amc)分析結(jié)果和hepabig-geneelisa分析結(jié)果的bland&altman圖。圖6是說明使用現(xiàn)有的1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa滴定度測量方法與ria(asm)分析結(jié)果之間的比較的圖。圖7是說明hepabig-geneelisa分析結(jié)果和ria(asm)分析結(jié)果之間的比較的圖。圖8是說明hepabig-geneelisa分析結(jié)果和anti-hbelisa3.0診斷試劑分析結(jié)果之間的比較的圖。具體實施方式只要不以其它方式定義，本說明書中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。通常，本說明書中使用的命名法在
技術(shù)領(lǐng)域：
中是公知的，并且廣泛地使用。本發(fā)明提供了一種用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的新方法以及用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒，與現(xiàn)有對特異抗原具有高親和性的抗體的測量方法相比，所述方法能夠顯著地降低與人血漿或血清中最初存在的人抗體的非特異性結(jié)合而發(fā)生的錯誤，并且具有更準確的值。本發(fā)明中包含人fc的蛋白質(zhì)是指包括人fc區(qū)的所有蛋白質(zhì)。包含人fc的蛋白質(zhì)可以是選自由人抗體、人源化抗體、嵌合抗體以及諸如依那西普的fc融合蛋白組成的組中的至少一種，fc融合蛋白中可溶性受體、細胞因子、激素等與fc融合，但不限于此。特別優(yōu)選作為包含人fc的蛋白質(zhì)的實例的人抗體和人源化抗體。本說明書中的“hepabig-gneelisa”或“h-e”是指本發(fā)明的用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒。在本發(fā)明的示例性實施方案中，通過比較使用測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒的分析結(jié)果與使用現(xiàn)有的抗hb抗體滴度測量(下文，ria(amc)測量)的分析結(jié)果而驗證本發(fā)明的用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒的測量精度和精確度。下文，通過解釋作為實例的用于測量抗hb抗體的滴度的試劑盒來詳細描述根據(jù)本發(fā)明的用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒以及測量方法。如圖1a所示，在用于測量抗hb抗體的滴度的常規(guī)方法中，當(dāng)乙型肝炎病毒的表面抗原結(jié)合到包被在底部的抗hb抗體的抗原結(jié)合位點的一個位點時，可以以適當(dāng)?shù)姆绞綔y量滴度，并且用酶或放射性同位素標記的乙型肝炎病毒的表面抗原分別結(jié)合到抗原結(jié)合位點的其它位點。然而，當(dāng)根據(jù)圖1a所示的方法測量由株式會社綠十字開發(fā)的抗hb單克隆抗體的滴度時，測量的滴度比圖1d所示的方法的滴定度(數(shù)據(jù)未示出)低約20至100倍。認為通過圖1a的方法測量的抗hb單克隆抗體的抗hb滴度較小的原因?qū)嶋H上可來源于如圖1b或圖1c的誤差可能性。因此，本發(fā)明人使用圖1d中所示的方法進行了測量抗體滴度的試驗，以排除現(xiàn)有滴度測量的錯誤可能性(圖1b和1c)，并發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有方法相比，可以在圖1d所示的方法中精確測量抗體滴度。最近，由于乙型肝炎而接受肝移植的患者定期給藥乙型肝炎人免疫球蛋白血漿組分制劑，以防止乙型肝炎的復(fù)發(fā)。通過現(xiàn)有的ria(amc)測量方法測量基于血清中500miu/ml的周期監(jiān)測來確定再次給藥的時間。然而，由于抗hb滴度測量也與圖1a所示的方法相同，因此不可能測量作為人單克隆抗體的gc1102(參見韓國專利號467706)的精確滴度。此外，當(dāng)在由于乙型肝炎而接受肝移植的患者中定期給藥乙型肝炎人免疫球蛋白血漿組分制劑時，血漿或血清中的滴度增加至數(shù)千miu/ml。現(xiàn)有的常規(guī)抗hb滴度測量方法具有從10miu/ml至最大1000miu/ml的可測量范圍，因此，需要額外稀釋血漿或血清，以驗證精確的滴度，并且依賴于稀釋的精確度和精確度可以根據(jù)樣品用稀釋劑而變化，因此，需要單獨進行樣品稀釋的驗證。因此，本發(fā)明試圖找出ria(amc)測量的分析結(jié)果和分析方法的分析結(jié)果之間的相關(guān)性，即使用國家標準的乙型肝炎免疫人球蛋白測量抗體滴度的方法，以及作為重新給藥乙型肝炎人免疫球蛋白血漿組分制劑的基礎(chǔ)的患者血清中500miu/ml的抗hb抗體滴度也同樣適用于hepabig-geneelisa的可能性，以及即使在應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的樣品用稀釋劑的寬范圍時獲得精確性和精度的可能性。在本發(fā)明的示例性實施方案中，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明通過使用間接elisa測量抗體滴度的試劑盒，使用國家標準測量抗體滴度時，回收率(％)與實際值相比約為93.3％，并且能夠精確測量高達3500miu/ml的滴度。當(dāng)通過現(xiàn)有的ria(amc)測量使用乙型肝炎人免疫球蛋白國家標準測量抗體滴度時，滴度值比實際值大1.4倍。因此，證實了使用根據(jù)本發(fā)明的用于測量抗體滴度的試劑盒的間接elisa與現(xiàn)有的ria(amc)測量相比能夠在更寬的范圍內(nèi)更準確地測量滴度。在本發(fā)明的另一個示例性實施方案中，通過使用根據(jù)本發(fā)明的用于測量含fc蛋白質(zhì)滴度的試劑盒，可證實測量大鼠血清中抗hb抗體的滴度是可能的。這意味著即使在相同動物物種的血漿或血清中也能夠高精度地測量來自與本發(fā)明相似的特定動物物種的抗體或含fc蛋白質(zhì)的滴度。在一個總的方面，用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的試劑盒包括：(a)樣品用稀釋劑，包括牛血清、脫脂牛奶和非離子型表面活性劑；(b)綴合物用稀釋劑，包括動物源性血清；以及(c)洗滌液，包含醋酸鈉、氯化鈉以及非離子型表面活性劑。在本發(fā)明中，樣品用稀釋劑的牛血清可以具有5～00％(w/v)的濃度。此外，樣品用稀釋劑的脫脂牛奶可以具有0.05至0.2％(w/v)的濃度。當(dāng)脫脂牛奶的濃度高于上述范圍時，初級稀釋液過度粘稠，這增加了測量誤差，并且當(dāng)牛血清和脫脂牛奶的濃度低于上述范圍時，提高了非特異性結(jié)合的可能性，非特異性結(jié)合中，包含人fc的蛋白質(zhì)、待檢測的抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)或抗原的非希望的位點。優(yōu)選地，牛血清和脫脂牛奶的濃度可分別是10％(w/v)和0.1％(w/v)?？梢詿o限制地使用樣品用稀釋劑的非離子型表面活性劑，只要符合本發(fā)明的目的。優(yōu)選地，樣品用稀釋劑的非離子型表面活性劑可以是選自吐溫20(聚山梨醇酯20)、吐溫80(聚山梨醇酯80)，brij30(聚氧乙烯(4)月桂基醚)、brij35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)組成的組中的至少一種。最優(yōu)選的是吐溫20。非離子型表面活性劑的濃度可以為0.025～0.1％(w/v)，優(yōu)選0.05％(w/v)。樣品用稀釋劑可進一步包括防腐劑，優(yōu)選proclin300，但不限于此。當(dāng)加入防腐劑時，防腐劑的濃度可以為0.025至0.1％(w/v)，優(yōu)選為0.05％(w/v)。在本發(fā)明中，綴合物用稀釋劑的動物源性血清優(yōu)選為山羊血清，但不限于此。也就是說，可以使用所有的動物源性血清，只要符合本發(fā)明的目的。山羊血清可以包括山羊抗人igg，并且山羊抗人igg可以是對fc特異性的，并且可以是整個igg或fab的抗體片段等。優(yōu)選地，綴合物用稀釋劑的山羊抗人igg可以是fc特異性的。綴合物用稀釋劑可以包括濃度為5至20％(w/v)的動物源性血清。在本發(fā)明中，洗滌液的醋酸鈉可以具有10至40mm的濃度，洗滌液的氯化鈉可以具有75至300mm的濃度，洗滌液的非離子型表面活性劑可以具有0.025至0.1％(w/v)的濃度，并且洗滌液的ph可以為3至5。優(yōu)選地，醋酸鈉可以具有20mm的濃度，氯化鈉可以具有150mm的濃度，非離子型表面活性劑可以具有0.05％(w/v)的濃度，洗滌液的ph可為4?？梢詿o限制地使用洗滌液的非離子型表面活性劑，只要符合本發(fā)明的目的。優(yōu)選地，洗滌液的非離子型表面活性劑可以是選自吐溫20(聚山梨醇酯20)、吐溫80(聚山梨醇酯80)、brij30(聚氧乙烯(4)月桂基醚)、brij35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)等組成的組中的至少一種。最優(yōu)選的可以是吐溫20。在另一總的方面，用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)滴度的方法包括：(a)通過使用樣品用稀釋劑稀釋包括含有人fc的蛋白質(zhì)的樣品；(b)使以各種濃度稀釋的標準溶液與所述樣品用稀釋劑在吸收靶抗原的板的孔中反應(yīng)；(c)吸取每個孔的內(nèi)容物，并用洗滌液洗滌每個孔；(d)完全除去殘留在所述每個孔中的洗滌液，并在每個要進行反應(yīng)的孔中加入綴合物用稀釋劑；(e)吸取每個孔的內(nèi)容物，并用所述洗滌液洗滌每個孔；(f)完全除去殘留在所述每個孔中的洗滌液，并在每個要進行反應(yīng)的孔中加入底物溶液；(g)通過在每個孔中加入終止反應(yīng)的溶液而終止反應(yīng)；以及(h)測量所述標準溶液和所述樣品的吸光度。在本發(fā)明中，所述樣品用稀釋劑包括牛血清、脫脂牛奶和非離子型表面活性劑，其中，所述樣品用稀釋劑的牛血清可具有5～100％(w/v)的濃度，所述樣品用稀釋劑的脫脂牛奶可具有0.05～0.2％(w/v)的濃度，并且所述樣品用稀釋劑的非離子型表面活性劑可具有0.025～0.1％(w/v)的濃度。所述樣品用稀釋劑可進一步防腐劑，優(yōu)選proclin300，其中，所述防腐劑可具有0.025～0.1％(w/v)的濃度。使用步驟(a)中的樣品用稀釋劑對樣品進行稀釋可以通過使用比樣品多約2至20倍、優(yōu)選5至15倍、最優(yōu)選10倍體積的樣品用稀釋劑來進行。此外，包括含有人fc的蛋白質(zhì)的樣品可以是選自由人血清、人血漿和人血液組成的組中的一種或多種，但不限于此。在本發(fā)明中，綴合物用稀釋劑包括動物源性血清，優(yōu)選山羊血清，但不限于此。也就是說，可以使用所有動物源性血清，只要其符合本發(fā)明的目的。山羊血清可以包括山羊抗人igg，并且山羊抗人igg可以是對fab或fc特異的。優(yōu)選地，綴合物用稀釋劑的山羊抗人igg可以是對fc特異的。以不同濃度稀釋的標準溶液的滴度值可為1000miu/ml、500miu/ml、150miu/ml、100miu/ml、50miu/ml、10miu/ml和0miu/ml。所述綴合物用稀釋劑可為山羊血清，并且所述山羊血清可具有5～20％(w/v)的濃度。洗滌液可包括醋酸鈉、氯化鈉和非離子型表面活性劑。所述洗滌液的醋酸鈉可具有10～40mm的濃度，所述洗滌液的氯化鈉可具有75～300mm的濃度，所述洗滌液的非離子型表面活性劑可具有0.025～0.1％(w/v)的濃度，并且洗滌液的ph可為4?？稍谑覝貙嵤┎襟E(b)10～120分鐘，優(yōu)選30～90分鐘，并且最優(yōu)選60分鐘?？稍谑覝貙嵤┎襟E(d)和(f)10～60分鐘，優(yōu)選20～40分鐘，最優(yōu)選30分鐘。優(yōu)選在加入用于終止反應(yīng)的溶液后的30分鐘內(nèi)，在450nm的測量波長和620nm的參考波長下測量步驟(h)中的吸光度，但不限于此。步驟(f)的底物溶液是tmb過氧化物酶底物，優(yōu)選選自tmba和tmbb中的至少一種，特別是最優(yōu)選tmba和tmbb的混合物，但不限于此。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可使用所有通常的底物溶液?？蔁o限制地使用用于終止步驟(g)的反應(yīng)的溶液，只要其終止底物的顯色，優(yōu)選硫酸溶液，但不限于此。實施例在下文中，將參考以下實施例詳細描述本發(fā)明。然而，以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的范圍不被解釋為限于這些實施例。實施例1：通過hepabig-geneelisa測量人血清的滴度本實施例的目的是，通過使用hepabig-geneelisa測量人血清中抗hb抗體的滴度，并且與通過使用bsa/pbs的常規(guī)ellsa測量獲得的滴度相比較，來驗證背景噪音的減小，并驗證是否可以正常測量人血清中抗hb抗體的滴度。用于本實施例的試劑如下。(1)抗hb抗體-gc1102滴度標準(gcc，批號n787r8003，10,500miu/ml，韓國專利號467706)-hb48-33(韓國專利號1072895)-hb48-35(韓國專利號1072895)-hb48-59(韓國專利號1072895)(2)牛血清(gibco，16170-078)(3)山羊血清(gibco，16170-072)(4)脫脂牛奶(difco，232100)(5)genedia的hbag涂板試劑盒(genediaanti-hbselisa3.0,gcms,f1103)(6)tween20(sigma,p1379)(7)山羊抗人igg(fc特異性，過氧化物酶綴合物，sigma,a0170)(8)tmb微孔過氧化物酶底物(kpl，50-76-03)(9)硫酸(h2so4，riedel，30743)(10)氯化鈉(sigma，s3014)(11)醋酸(riedel，27225)(12)三水合醋酸鈉(riedel，25022)(13)pbs(磷酸鹽緩沖液)(lonza，17-516q)(14)bsa(牛血清白蛋白)(bovogen，bsa100)(15)anti-hbselisa3.0(株式會社綠十字ms,f1103)通過下述步驟制備用于分析的試劑。(1)具有10％(w/v)濃度的tween20：10g的新鮮(original)tween20加到90ml的蒸餾水中，并混合均勻。(2)高溫滅活牛血清&山羊血清在56℃加熱30分鐘于室溫或2～8℃溶解的牛血清和山羊血清。(3)稀釋緩沖液(0.1％的脫脂牛奶/0.05％的tween20/10％的牛血清/90％pbs)：混合100ml加熱和滅活的牛血清、1g的脫脂牛奶和5ml的10％tween20，并加入pbs使得溶液為1l。充分混合混合物，使得不具有懸浮物，并通過使用0.45過濾器過濾，然后使用。(4)二抗復(fù)合綴合物溶液(1∶20,000)：將5μg的山羊抗人igg(fc特異性并且偶聯(lián)過氧化物酶)加入到5ml加熱和滅活的山羊血清中并充分混合以制備溶液。將1ml制備的溶液與19ml加熱和滅活的山羊血清充分混合。(5)底物溶液：以1∶1的比例均勻混合tmb過氧化物酶底物a和tmb過氧化物酶底物b。(6)終止反應(yīng)的溶液：在972ml的蒸餾水中緩慢混合28ml的硫酸。(7)洗滌液：加2.722g的三水醋酸鈉、8.766g的氯化鈉、5g的10％tween20到900ml的蒸餾水中，并用原乙酸控制具有4.0的ph，然后用蒸餾水使得終體積為1l，并混合均勻。(8)1％(w/v)的bsa/pbs：在1l的pbs中溶解10g的bsa，然后使用。(9)pbst加入5g的tween20到1l的pbs中，并通過緩慢地漩渦完全溶解，不要產(chǎn)生氣泡。下表1顯示了使用1％的bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa的洗滌液，以及hepabig-geneelisa的樣品用稀釋劑、二抗、用于二抗的稀釋劑。[表1]常規(guī)elisa和hepabig-geneelisa的比較使用作為測量抗hb抗體滴度的診斷試劑的anti-hbelisa3.0的抗體滴度的分析程序如下。將陰性標準溶液、標準溶液和用陰性標準溶液稀釋10至25倍的樣品加入到診斷試劑中的微孔板中。然后，用綴合物稀釋劑將濃縮的綴合物液體稀釋26倍，并將稀釋的濃縮綴合物液體加到其中包含標準溶液、陰性標準溶液和樣品的微孔板中，然后溫和渦流以充分混合，在37℃下反應(yīng)1～60分鐘。反應(yīng)完成后，使用被蒸餾水稀釋10倍的診斷試劑中的濃洗滌液洗滌得到的混合物。用底物緩沖液將診斷試劑中的底物溶液稀釋101倍，將稀釋的底物溶液加入洗滌過的微孔板中，隨后在室溫下反應(yīng)30分鐘。通過加入用于終止診斷試劑中的反應(yīng)的溶液而終止反應(yīng)。使用作為樣品的稀釋劑的具有1％bsa/pbs的elisa的抗體滴度的分析步驟如下。將未用福爾馬林處理的重組乙型肝炎病毒表面抗原涂覆在微孔板上，然后用1％的bsa/pbs封閉。然后，將標準溶液和用樣品用稀釋劑(1％bsa/pbs)稀釋25倍的人血清樣品加到板上，以誘導(dǎo)反應(yīng)。反應(yīng)完成后，用pbst洗滌獲得的混合物，與山羊抗人igg抗體(fab特異性)進行二次反應(yīng)，并綴合辣根過氧化物酶，再用pbst洗滌。二次反應(yīng)完成后，加入tmb底物溶液顯色，并通過向其中加入硫酸溶液終止反應(yīng)。使用hepabig-geneelisa的抗體滴度分析步驟如下。將未用福爾馬林處理的重組乙型肝炎病毒表面抗原涂覆在微孔板上，然后用1％bsa/pbs封閉。然后，加入標準溶液以及用樣品用稀釋劑稀釋10倍的人血清樣品(10％(w/v))、含有牛血清的0.1％(w/v)脫脂牛奶、0.05％(w/v)tween20和0.05％(w/v)proclin300)到微孔板中，以誘導(dǎo)反應(yīng)。反應(yīng)完成后，用洗滌液洗滌獲得的混合物，并與山羊抗人igg抗體(fc特異性，綴合辣根過氧化物酶)進行二次反應(yīng)，并通過加入tmb底物進行顯色。在初級分析中，通過使用取自19例患有乙型肝炎的患者(hbsag(+))的血清，證實了人血清中hepabig-geneelisa的背景噪音，通常已知所述血清不具有抗hb抗體。首先，使用anti-hbelisa3.0診斷試劑證實抗hb抗體不存在于患有乙型肝炎的患者的血清中(表2)。當(dāng)使用1％bsa/pbs稀釋樣品時，全部19個樣品產(chǎn)生大于900miu/ml的高背景噪音。然而，在hepabig-geneelisa中，證實所有樣品不產(chǎn)生低于100miu/ml的背景噪音。[表2]使用取自19例乙型肝炎患者血清的初級分析結(jié)果在次級分析中，使用從不是乙型肝炎患者的正常人取得的21個血清，驗證hepabig-geneelisa是否能夠正常測量滴度，甚至在人血清中沒有背景噪音。為了驗證是否產(chǎn)生了背景噪音，使用anti-hbelisa3.0診斷試劑進行比較。在hepabig-geneelisa中，所有的21個樣品不產(chǎn)生與在初級分析中使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的血清相同的高背景噪音。此外，hepabig-geneelisa的結(jié)果甚至與anti-hbselisa3.0診斷試劑的結(jié)果相比，沒有背景噪音的差別(表3)。在次級分析中，不使用已經(jīng)證實其高背景噪音的用1％的bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa滴度測量。[表3]使用取自未患有乙型肝炎的患者血清的次級分析結(jié)果初級分析結(jié)果和次級分析結(jié)果可以證實，在初級分析結(jié)果和次級分析結(jié)果中，即使不存在hb抗體滴度，使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的現(xiàn)有elisa仍然產(chǎn)生顯著高的背景噪音，超過900miu/ml。然而，在hepabig-geneelisa中，產(chǎn)生了與可商購的anti-hbselisa3.0診斷試劑類似水平的背景噪音。這意味著能夠在hepabig-geneelisa中有效地被控制在使用現(xiàn)有的抗人igg抗體作為第二抗體時產(chǎn)生的高背景噪音。實施例2：通過hepabig-geneelisa和amc測量的滴度之間的比較測試實施例2的目的是使用食品藥品安全局(mfds)的抗乙型肝炎免疫球蛋白國家標準(kfdareference08/026)來驗證在血清中使用根據(jù)本發(fā)明的hepabig-geneelisa的滴度測量和抗hb抗體滴度測量(ria(amc)測量)之間的相關(guān)性。在本實施例中，使用(95.45iu/小瓶，mfds)乙型肝炎免疫人球蛋白的國家標準。除了anti-hbselisa3.0診斷試劑之外，本實施例中使用的試劑和試劑的制備方法與實施例1相同。使用hepabig-geneelisa的抗體滴度的分析步驟與實施例1相同。在ria(amc)測量中，通過酶免疫測定(eia)測量滴度，其中乙型肝炎病毒的表面抗原被包被并與待測樣品反應(yīng)，然后，將諸如過氧化物酶或堿性磷酸酶的酶與乙型肝炎病毒的表面抗原綴合，如圖1a所示的現(xiàn)有抗hb抗體滴度測量，或通過放射免疫測量(ria)，其中在乙型肝炎病毒的表面抗原上標記諸如125i的放射性同位素。使用ria(amc)測量的分析步驟如下：向試管中加入陰性對照、陽性對照和樣品，加入hb抗原珠涂布的珠子到每個試管中，然后在室溫振蕩反應(yīng)或45℃反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌珠子3～5次，其中加入125i-hb，然后室溫下振蕩反應(yīng)或45℃反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)完成后，用蒸餾水洗滌珠子3～5次。然后，在洗滌后24小時內(nèi)，用γ射線儀測量各試管的放射性1分鐘。分析樣品的制備步驟如下：向每個試管中加入陰性對照、陽性對照組和樣品，并向每個試管中加入hb抗原珠涂布的珠子，然后在室溫振蕩反應(yīng)或45℃反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌珠子3～5次，向其加入125i-hb，然后室溫下振蕩反應(yīng)或45℃反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)完成后，用蒸餾水洗滌珠子3～5次。然后，在洗滌后24小時內(nèi)，用γ射線儀測量各試管中的放射性1分鐘。在初級分析中，通過hepabig-geneelisa分析了30個空白樣本，在獲得的分析結(jié)果中，hepabig-geneelisa檢測限低于10miu/ml(<10miu/ml)的兩個結(jié)果不包含在最終結(jié)果中。通過ria(amc)測量分析30個盲樣，并且在獲得的分析結(jié)果中，amc測量的檢測限小于10miu/ml的兩個結(jié)果不包括在最終結(jié)果中。當(dāng)檢驗每次測量的平均回收百分比(％回收率：％re)時，驗證hepabig-geneelisa的％re為956.0％，并且驗證ria(amc)測量的％re為14712.9％，并且分析結(jié)果為如下表4所示。[表4]使用乙型肝炎免疫球蛋白國家標準的初級分析結(jié)果(kfdareference08/026)在次級分析中，hepabig-geneelisa分析了28個空白樣本，在分析結(jié)果中，hepabig-geneelisa檢測限低于10miu/ml的四項結(jié)果未包含在最終結(jié)果中。通過ria(amc)測量分析了28個空白樣品，并且在獲得的分析結(jié)果中，ria(amc)測量的檢測限小于10miu/ml的四個結(jié)果不包含在最終結(jié)果中。當(dāng)檢驗每次測量的平均回收率(％回收率：％re)時，驗證hepabig-geneelisa的％re為967.1％，并且驗證ria(amc)測量的％re為14016.4％，并且分析結(jié)果為如下表5所示。[表5]使用乙型肝炎免疫球蛋白國家標準的次級分析結(jié)果(kfdareference08/026)通過使用每個測量的％re(95％置信水平)進行關(guān)于初級分析結(jié)果和次級分析結(jié)果(它們的制備機構(gòu)不同)的2-樣品t檢驗。hepabig-geneelisa的初級分析結(jié)果和二次分析結(jié)果的顯著性概率(p值)為0.565，并且amc測量的初級分析結(jié)果和二次分析結(jié)果的顯著性概率(p值)為0.112。初級分析結(jié)果和次級分析結(jié)果的兩個顯著性概率(p值)為0.05以上，因此認為初級分析結(jié)果與二次分析結(jié)果無差異，并通過使用包括全部初級結(jié)果和次級結(jié)果的最終分析結(jié)果進行以下的結(jié)果分析(表6)。[表6]使用乙型肝炎免疫球蛋白國家標準的最終分析結(jié)果(kfdareference08/026)當(dāng)檢驗最終分析結(jié)果中每次測量的平均回收百分比(％回收率：％re)時，驗證hepabig-geneelisa的％re為966.5％，并且驗證ria(amc)測量的％re為14414.8％。作為使用excel的線性回歸分析的結(jié)果，hepabig-geneelisa的％re與國家標準的理論滴度相比為93.3％，并且ria(amc)測量的％re與國家標準的理論滴定度相比為141.5％(表6)。此外，r2的值也為0.99以上，可理解hepabig-geneelisa具有線性回歸分析模型的顯著高的解釋力(圖4)。bland&altman圖評估了兩項測量的等效性。這些圖形(plots)以95％置信區(qū)間(1.96sd)分布；然而，驗證了圖中y的平均值為39.9％(圖5)，并且建立了與下面等式相同的關(guān)系。hepabig-geneelisa的ria(amc)測量結(jié)果的結(jié)果＝0.399測量結(jié)果之間的平均(平均值)也就是說，兩個測量結(jié)果的差異是兩個測量結(jié)果的平均值的39.9％。從這些結(jié)果可以證實到兩個測量和分析結(jié)果彼此不相等。作為相關(guān)系數(shù)，使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(95％置信水平，jmpv8.0)進行評估。皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.996(顯著性概率(p值)為0.000)，可以理解兩次檢測測量的分析結(jié)果具有較強的正相關(guān)性。通過在x軸上放置hepabig-geneelisa的滴度分析值以及在y軸上放置在asan醫(yī)學(xué)中心的核醫(yī)學(xué)部門的ria(amc)測量的滴度分析值而進行回歸分析。作為回歸分析的結(jié)果，獲得以下線性回歸方程，并且相對于系數(shù)的顯著可能性(p值)為0.000，并且在0.05的高度顯著的顯著水平。ria(amc)＝1.51hepabig-geneelisa[線性回歸方程]從這些結(jié)果可以看出，使用現(xiàn)有的樣品用稀釋劑稀釋國家標準時，作為ria(amc)測量的分析結(jié)果為500miu/ml，與331miu/ml相同，為hepabig-geneelisa分析結(jié)果的平均值。也就是說，從本實施例的實驗結(jié)果可以證實，hepabig-geneelisa適當(dāng)?shù)卦u價了國家標準(線性回歸分析結(jié)果中為93.3％re)；然而，ria(amc)測量高度評估國家標準1.4倍(線性回歸分析結(jié)果中141.5％re)。證實兩個測量的分析結(jié)果具有較強的正相關(guān)系數(shù)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估)，并且與hepabig-geneelisa相比，ria(amc)的測量結(jié)果高度評估1.51倍。此外，證實通過hepabig-geneelisa的抗體滴度測量具有與現(xiàn)有測量相同的測量精度，并能夠比現(xiàn)有的測量更準確地測量抗體的量。實施例3：用于比較通過hepabig-geneelisa測量的滴度和amc測量的滴度的測試本實施例的目的是比較和分析四種抗hb滴度測量中的抗hb滴度測量值，如hepabig-geneelisa，使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa、ria(amc)和抗-hbelisa3.0診斷試劑，在156名患者血清中，所述患者給藥乙型肝炎免疫球蛋白(hbig)以預(yù)防因乙型肝炎接受肝臟植物后乙型肝炎的復(fù)發(fā)。在hepabig-geneelisa、使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa、ria(amc)和抗-hbelisa3.0診斷試劑中使用的試劑以及試劑的制備工藝與實施例1和實施例2相同。此外，hepabig-geneelisa、使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa以及抗hbelisa3.0診斷試劑的分析方法與實施例1相同，并且ria(amc)的分析方法與實施例2相同。如圖6所示，當(dāng)比較使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的現(xiàn)有elisa滴度測量與ria(amc)時，在ria(amc)中具有接近0的低滴度的樣品，在使用1％bsa/pbs作為樣品用稀釋劑的elisa滴度測量中產(chǎn)生最高達到2,000miu/ml的高背景噪音。其與實施例1的結(jié)果類似。此外，兩種方法之間的相關(guān)性低，r2＝0.4582，并且回歸趨勢線的斜率為0.4857，因此可以理解，與使用1％bsa/pbs的elisa滴度測量相比，在ria(amc)中可高度測量相同的樣品。同時，如圖7所示，當(dāng)比較hepabig-geneelisa與ria(amc)時，證實通過hepabig-geneelisa有效地去除了背景噪音，并且r2為0.7181，證實與使用1％bsa/pbs的方法相比，改善了與ria(amc)的相關(guān)性。然而，兩種方法之間的回歸趨勢線的斜率為0.5015，這證實了類似于ria(amc)和使用1％bsa/pbs的方法之間的比較，ria(amc)方法與hepabig-geneelisa相比高度測量了樣品?？梢岳斫?，這些結(jié)果與實施例2的結(jié)果非常相似。當(dāng)比較hepabig-geneelisa與anti-hbelisa3.0診斷試劑時，r2為0.8627，兩種方法之間具有較高的相關(guān)性，兩種方法之間的回歸趨勢線的斜率為1.0068。也就是說，如圖8所示，證實兩種方法之間的測量值彼此幾乎相同。如圖6至圖8所述，hepabig-geneelisa比使用1％bsa/pbs的現(xiàn)有方法有效降低了人血清中的高背景噪音，并與市售ria和anti-hbelisa3.0診斷試劑具有高相關(guān)性。特別地，證實了hepabig-geneelisa的測量結(jié)果與anti-hbelisa3.0診斷試劑的測量結(jié)果幾乎相同。實施例4：使用gc1102測量大鼠血清中抗hb抗體的滴度進行本實施例以驗證使用根據(jù)本發(fā)明的用于測量人血清中的抗乙型肝炎病毒表面(抗hb)抗體的滴度的hepabig-geneelisa的滴度測量是否可能測量大鼠血清中的抗hb抗體滴度(gc1102的抗hb抗體滴度，在iv-hepabig注射劑中混合的gc1102，以及在iv-球蛋白s注射劑中混合的gc1102)。本實施例中使用的標準和樣品如下。(1)標準樣：hepabig-geneelisa的標準樣，10,500iu/ml的抗hb滴度。(2)gc1102：抗hb單克隆抗體，10,500iu/ml的抗hb滴度。(3)iv-hepabig注射劑：靜脈注射10ml的hepabig注射劑，270.5iu/ml的抗hb滴度。(4)iv球蛋白s注射劑：10ml的iv球蛋白s注射劑，2.2iu/ml的抗hb滴度。本實施例中使用的試劑與上述實施例中使用的試劑相同，并且還通過與上述實施例相同的方法制備包括樣品用稀釋劑、綴合物稀釋劑、洗滌液等的試劑。通過用稀釋緩沖液稀釋gc1102滴度標準品并將濃度控制為0iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、100iu/ml、150iu/ml、500iu/ml或1000iu/ml來制備標準溶液，并獲得標準曲線。通過用大鼠血清稀釋gc1102并控制濃度分別為200miu/ml、1000miu/ml、4000miu/ml、8000miu/ml而制備gc1102(10,500iu/ml)和iv-hepabig注射劑(270.5iu/ml，株式會社綠十字)的qc樣品。通過用緩沖液控制iv-球蛋白s注射劑的蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)與iv-hepabig注射劑的蛋白質(zhì)濃度相同來制備gc1102和iv-球蛋白s注射劑的qc樣品(株式會社綠十字)，作為混合物，并混合以具有與iv-hepabig注射劑相同的抗hb抗體滴度。用大鼠血清稀釋制備的混合物,并控制濃度分別為200miu/ml、1000miu/ml、4000miu/ml、8000miu/ml。使用hepabig-geneelisa進行iv-hepabig注射劑的抗hb抗體滴度的分析，以驗證是否為約270.5iu/ml，其是在關(guān)于使用hepabig-geneelisa的分析中測量iv-hepabig注射劑的批號150h8028的典型報告中定義的抗hb抗體滴度。對于樣品，使用hepabig-geneelisa的樣品用稀釋劑稀釋800倍、1,600倍、3,200倍和6,400倍的iv-hepabig注射劑。通過在每個濃度重復(fù)6次測試，并在分析范圍內(nèi)加料4個濃度來進行精度評估。在評估精度時，通過％回收率(％re)評估樣品，并且確認測量的％re是否在80～120％內(nèi)。通過每個濃度重復(fù)該測試6次，并在分析范圍內(nèi)加料4個濃度來進行評價精度。在評價精度時，通過％相對標準偏差(％rsd)評估樣品，并且驗證測量的％rsd是否在15％內(nèi)。另外，評估批內(nèi)分析的精度以及批間分析的精度，其中，通過驗證重復(fù)試驗兩次獲得的結(jié)果的％rsd相對于一個標準是否在15％內(nèi)而評估批內(nèi)分析的精度，并且通過驗證每天重復(fù)測試三次獲得的結(jié)果的％rsd是否在15％內(nèi)而評估批間分析的精度。在評估選擇性時，驗證通過使用8只大鼠血清對生物培養(yǎng)基沒有干擾作用。通過在8只大鼠血清中加料gc1102(50miu/ml)驗證％re，并且也證實沒有干擾作用。本實施例中使用的其他測試方法與實施例1的hepabig-geneelisa的相同。1)使用hepabig-geneelisa分析iv-hepabig注射劑的抗hb抗體滴度使用hepabig-geneelisa測量用hepabig-geneelisa的樣品用稀釋劑稀釋800倍、1,600倍、3,200倍、6,400倍的iv-hepabig注射劑的抗hb抗體滴度。分析結(jié)果為276.0iu/ml(％rsd為4.7％)，其與iv-hepabig注射劑的典型報告的測量結(jié)果270.5iu/ml相同，在標準偏差內(nèi)，因此證實了hepabig-geneelisa可用于測量體外滴度，例如血漿來源的hbig制劑的抗hb抗體的運輸試驗，例如iv-hepabig注射劑(表7)。[表7]2)使用hepabig-geneelisa測量大鼠血清中g(shù)c1102抗體的滴度為了使用hepabig-geneelisa測量大鼠血清中的gc1102抗體的滴度，通過hepabig-geneelisa1.1分析通過在大鼠血清中加料gc1102(8,000、4,000、1,000和200miu/ml)獲得的qc樣品，然后驗證精確度、批內(nèi)分析的精度以及批間分析的精度。通過在大鼠血清中包含gc1102(200miu/ml、1,000miu/ml、4,000miu/ml和8,000miu/ml)的加料來重復(fù)該測試6次。％re為88.8～107.5％，批內(nèi)分析的精度(％rsd)在13.7％以內(nèi)，并且批間分析的精度(％rsd)在11.0％以內(nèi)，證實通過甚至在大鼠血清以及人血清中使用hepabig-geneelisa能夠測量gc1102的抗hb滴度(表8)。[表8]通過使用hepabig-geneelisa在大鼠血清中加料gc1102的檢測結(jié)果3)使用hepabig-geneelisa測量大鼠血清中iv-hepabig注射劑的抗體滴度通過hepabig-geneelisa分析通過在大鼠血清中加料iv-hepabig注射劑(8,000、4,000、1,000和200miu/ml)獲得的qc樣品，然后驗證精確度、批內(nèi)分析的精度以及批間分析的精度。通過在大鼠血清中包括iv-hepabig注射劑(200miu/ml，1,000miu/ml，4,000miu/ml和8,000miu/ml)的加料來重復(fù)該測試6次。％re為92.2～111.8％，批內(nèi)分析精密度(％rsd)在11.4％以內(nèi)，批間分析的精度(％rsd)在6.8％以內(nèi)，證實通過甚至在大鼠血清中使用hepabig-geneelisa能夠測量血漿等制劑的抗hb滴度來源的hbig(表9)。[表9]使用hepabig-geneelisa在大鼠血清中iv-hepabig注射劑的抗體滴度的實驗結(jié)果4)使用hepabig-geneelisa測量大鼠血清中g(shù)c1102+iv球蛋白s注射劑的抗體滴度通過hepabig-geneelisa分析通過在大鼠血清中以1∶24(8,000、4,000、1,000和200miu/ml)的比例加料含有g(shù)c1102和iv球蛋白s注射劑的混合物獲得的qc樣品，然后驗證精確度、批內(nèi)分析的精度以及批間分析的精度。通過在大鼠血清中包含iv-hepabig注射劑(200miu/ml、1,000miu/ml、4,000miu/ml和8,000miu/ml)的加料來重復(fù)該測試6次。％re為83.8～102.8％，批內(nèi)分析精度(％rsd)在7.5％以內(nèi)，并且批間分析的精度(％rsd)在7.8％以內(nèi)，證實甚至在含有g(shù)c1102和iv-球蛋白s注射劑的球蛋白制備混合物中能夠使用hepabig-geneelisa測量抗hb滴度(表10)。[表10]使用hepabig-geneelisa測量大鼠血清中g(shù)c1102+iv-球蛋白s注射劑的抗體滴度的結(jié)果5)選擇性評估為了驗證選擇性，通過使用hepabig-geneelisa分析通過在大鼠血清中加料gc1102(500miu/ml)而獲得的8只大鼠血清和加料樣品。當(dāng)通過使用hepabig-geneelisa分析全部8只大鼠血清時，在全部8只大鼠血清中否定地(negatively)測量抗hb抗體的滴度，并且當(dāng)分析通過加料gc1102(500miu/ml)獲得的所有加料樣品時，％re為96.0～106.2％，證實對大鼠血清中的其他成分沒有干擾作用(表11)。[表11]使用hepabig-geneelisa的選擇性評估結(jié)果樣品空白樣品加料樣品ar％a<10049298.4b<10048196.0c<10049197.9d<100517103.4e<10048396.6f<10049198.3g<100510102.0h<100531106.2即使在使用作為除gc1102以外的其他抗hb抗體的hb48-33、hb48-35和hb48-59(韓國專利號1072895)的情況下，可以證實能夠通過hepabig-geneelisa測量所有抗體的滴度，其與現(xiàn)有方法相比類似于gc1102。已經(jīng)基于其具體特征詳細描述了本發(fā)明，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些具體技術(shù)僅僅是優(yōu)選的實施方式，所以本發(fā)明的范圍不限于這些實施方式。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定?！竟I(yè)實用性】根據(jù)本發(fā)明的用于測量包含fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒可以克服如下限制：其中由于存在于用于使用特異性抗原或官能團進行涂布的酶免疫檢測(eia)測量滴度的現(xiàn)有試劑盒中的人血漿或人血清中的多個非特異性抗體，所以不能精確地測量含特異性fc的蛋白質(zhì)，例如人抗體、人源化抗體或人fc融合蛋白的滴度；并且在測試受試者中保持高精度的同時，可以測量在人血漿或血清中包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度。特別地，現(xiàn)有包含人fc的蛋白質(zhì)、特別是人抗體或人源化學(xué)抗體的滴度測量具有10miu/ml至最大1,000miu/ml的可測量范圍。然而，使用根據(jù)本發(fā)明的用于測量包含人fc的蛋白質(zhì)的滴度的試劑盒的滴度測量具有100miu/ml至最大10,000miu/ml的更寬的測量范圍。此外，根據(jù)本發(fā)明，即使在測量來源于與本發(fā)明類似的特定動物物種的抗體或含fc的蛋白質(zhì)在相同動物物種的血漿或血清中的滴度時，也可以高精度地測量滴度。當(dāng)前第1頁12