包含gm-csf的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗，具體涉及一種包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒及其制備方 法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由漢坦病毒 引起的急性病毒性傳染病，該病危害嚴(yán)重，病死率高，中國(guó)是世界上腎綜合征出血熱疫情最 嚴(yán)重的國(guó)家，目前，對(duì)于該病尚無(wú)特異有效的治療藥物，主要靠疫苗進(jìn)行預(yù)防。國(guó)內(nèi)雖已研 制出腎綜合征出血熱滅活病毒疫苗，但是該類(lèi)疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體滴度較低，不能 有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，此外，原代細(xì)胞和腦組織滅活疫苗的材料多來(lái)源于動(dòng)物， 而動(dòng)物飼養(yǎng)的質(zhì)量控制問(wèn)題，尤其是潛在的動(dòng)物病毒對(duì)人體的可能危害是需要解決的關(guān)鍵 問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已涌現(xiàn)出有多種疫苗研制的方法。
[0003] 病毒樣顆粒（Virus-like particle, VLP)是病毒復(fù)制過(guò)程中自然產(chǎn)生或通過(guò)基 因工程表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白并自行組裝出的不含病毒核酸的顆粒樣物質(zhì)，除核酸外其結(jié)構(gòu)與 來(lái)源病毒基本一致，并具有與病毒最接近的抗原結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性。VLP的這種特點(diǎn)使其在 疫苗的研宄中倍受青睞。現(xiàn)在常用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備VLP，但是對(duì)于多個(gè)蛋白組成的 VLP，需要制備表達(dá)各個(gè)蛋白的桿狀病毒，再將這些桿狀病毒以不同的比例共同感染昆蟲(chóng)細(xì) 胞，包裝出所需要的VLP，由于重組桿狀病毒在表達(dá)中必不可少，產(chǎn)品中混合的桿狀病毒為 后期純化帶來(lái)一定的困難。另外，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)糖基化與哺乳動(dòng)物細(xì)胞仍有差別，這可 能會(huì)影響后期的免疫效果。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后修飾、蛋白折疊等過(guò)程的 高保真性，成為最廣泛應(yīng)用于VLP研宄和工業(yè)生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞適用于各類(lèi) 復(fù)雜的包膜VLP的表達(dá)，并且其表面的蛋白組成與原病毒最為接近。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可 通過(guò)篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VLP的細(xì)胞系，有利于疫苗的研宄和工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用，作為 腎綜合征出血熱的預(yù)防疫苗。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠正確折疊、組裝和翻譯后修飾蛋白的特點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建 真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染dhff CHO細(xì)胞，組裝含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒。
[0006] 所述制備方法由以下步驟實(shí)現(xiàn)： 步驟一：載體構(gòu)建： 將漢坦病毒76-118株核衣殼蛋白S基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動(dòng)子下，構(gòu)建S基 因表達(dá)載體； 將漢坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動(dòng)子下，GM-CSF基因 克隆入SV40啟動(dòng)子下，構(gòu)建M基因和GM-CSF基因的共表達(dá)載體； 步驟二：含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的制備： 將步驟一得到的兩種載體各10 μ g共轉(zhuǎn)染dhfr_ CHO細(xì)胞，于培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去 維持培養(yǎng)基，PBS洗滌三次后加入無(wú)血清篩選培養(yǎng)基，48 h后收集含有VLP的培養(yǎng)上清；經(jīng) 蔗糖密度梯度離心純化后，低溫保存。
[0007] 步驟二中，培養(yǎng)基為含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黃嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的 IMDM培養(yǎng)基。
[0008] 步驟二中，無(wú)血清篩選培養(yǎng)基為含500 nM MTX、800 μg/ml G418的Hycell培養(yǎng)基。 [0009] 如所述的包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的制備方法制得的病毒樣顆粒。
[0010] 如所述的包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒在制備腎綜合征出血熱預(yù)防疫苗方面的 應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體，使嵌合VLP的各個(gè)組分均能表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)能組裝出結(jié)構(gòu) 正確的含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒并釋放至培養(yǎng)上清中，GM-CSF分子錨定在病毒樣顆 粒的包膜上，從而可以有效發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。
[0012] 2、構(gòu)建的真核表達(dá)載體上含有多個(gè)篩選標(biāo)記，通過(guò)篩選可以建立穩(wěn)定表達(dá)病毒樣 顆粒的細(xì)胞株，便于大規(guī)模生產(chǎn)和制備。
[0013] 3、本發(fā)明制備的含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒，免疫小鼠后可以有效刺激產(chǎn)生 體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且對(duì)病毒感染的小鼠有保護(hù)作用，可用于漢坦病毒感染的預(yù) 防。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒載體構(gòu)建示意圖。
[0015] 圖2為間接免疫熒光檢測(cè)糖蛋白GP和GM-CSF的表達(dá)。
[0016] 圖3為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的透射電鏡檢查結(jié)果（A.轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品； B.細(xì)胞培養(yǎng)上清)。
[0017] 圖4為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的Western-blot檢測(cè)結(jié)果。
[0018] 圖5為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫后小鼠血清中特異性抗體的檢測(cè)。
[0019] 圖6為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫后小鼠血清中中和抗體的檢測(cè)。
[0020] 圖7為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫后小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平檢測(cè)。
[0021] 圖8為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫后小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷活性檢測(cè)。
[0022] 圖9為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫小鼠經(jīng)漢坦病毒（HTNV 76-118)攻擊 后臟器組織中病毒抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果。
[0023] 圖10為含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒免疫小鼠經(jīng)漢坦病毒（HTNV 76-118)攻擊 后臟器組織中漢坦病毒核酸的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果（A.心臟B.肝臟C.脾臟D.肺臟E.腎 臟F.腦)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0025] 漢坦病毒是單負(fù)鏈RNA病毒，其基因組包括L、M、S三個(gè)片段，分別編碼病毒RNA依 賴(lài)的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn和Gc以及核衣殼蛋白。包膜糖蛋白和核衣殼蛋白都是誘 導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白，糖蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在機(jī)體的保護(hù)性體液 免疫應(yīng)答中起主要作用，但其免疫原性弱，刺激機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱；核衣殼蛋白 的免疫原性較強(qiáng)，但不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。本發(fā)明中利用真核表達(dá)系統(tǒng)，在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)一種含有GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒，其組成正確，在小鼠體內(nèi)能夠有效地刺 激產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且對(duì)病毒感染的小鼠具有一定的保護(hù)作用。
[0026] 本發(fā)明涉及的包含GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表 達(dá)系統(tǒng)能夠正確折疊、組裝和翻譯后修飾蛋白的特點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體，組裝含有 GM-CSF的漢坦病毒樣顆粒，具體由以下步驟實(shí)現(xiàn)： 步驟一：載體構(gòu)建： 將漢坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動(dòng)子下，構(gòu)建S基因表 達(dá)載體（圖1中A載體）； 將漢坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動(dòng)子下，GM-CSF基因 克隆入SV40啟動(dòng)子下，構(gòu)建M基因和GM-CSF-GPI基因的共表達(dá)載體（圖1中B載體）； 上述兩個(gè)載體具有如下特征： 1、在啟動(dòng)子區(qū)使用了增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列EASE2. 1，該序列可使轉(zhuǎn)錄活性提高70%，從 而提尚目的蛋白的表達(dá)量。
[0027] 2、由于GM-CSF是可溶性蛋白，不在膜表面表達(dá)，故在其3'端添加⑶59的膜錨定 區(qū)基因片段，使GM-CSF表達(dá)在細(xì)胞膜表面。
[0028] 3、表達(dá)M基因的載體切除了 G418抗性篩選基因，將GM-CSF-GPI基因構(gòu)建在該 位置上，GM-CSF和糖蛋白M基因同時(shí)表達(dá)，使GM-CSF錨定在包裝出的VLP包膜上，有利于 GM-CSF發(fā)揮免疫佐劑的作用，增強(qiáng)VLP所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；表達(dá)S基因的載體對(duì)G418抗性 基因進(jìn)行了 E182D突變，以利于篩選高表達(dá)細(xì)胞株。
[0029] 4、在載體中使用了內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)，利用IRES分段表達(dá)二氫葉酸 還原酶（DHFR)。表達(dá)S基因的載體只表達(dá)DHFR1-105氨基酸，表達(dá)M基因的載體只表達(dá) DHFR105-187氨基酸，這樣可高效迅速地篩選穩(wěn)定表達(dá)漢坦病毒嵌合VLP的細(xì)胞株，而且在 MTX加壓擴(kuò)增過(guò)程中，有利于目的基因以等摩爾比例擴(kuò)增，有利于進(jìn)一步提高表達(dá)量，組裝 出結(jié)構(gòu)完整的VLP。
[0030] 5、針對(duì)DHFR進(jìn)行了 L22R的突變，和野生型DHFR相比，降低了與MTX的親和力也 降低了活性，在達(dá)到篩選高效表達(dá)目的蛋白細(xì)胞株的同時(shí)使該表達(dá)系統(tǒng)可以在含有野生型 DHFR的細(xì)胞中進(jìn)行MTX篩選，適用于更多的細(xì)胞類(lèi)型。
[0031] 步驟二：漢坦病毒樣顆粒的制備： 將步驟一得到的兩種載體各10 μ g共轉(zhuǎn)染dhfr_ CHO細(xì)胞，于培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去 維持培養(yǎng)基，PBS洗滌三次后加入無(wú)血清篩選培養(yǎng)基，48 h后收集含有VLP的培養(yǎng)上清；離 心去除細(xì)胞碎片及大的蛋白聚集體后，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，低溫保存。
[0032] 上述培養(yǎng)基為含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黃嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的頂DM培 養(yǎng)基。
[0033] 上述無(wú)血清篩選培養(yǎng)基為含500 ηΜ ΜΤΧ、800 μ g/ml G418的Hycell培養(yǎng)基。
[0034] 所制得的病毒樣顆?？蓱?yīng)用于制備腎綜合征出血熱的預(yù)防疫苗。
[0035] 、電鏡觀(guān)察VLP: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，裝入1.5 ml離心管，1000 rpm離心5 min， 棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入戊二醛固定液。70%、80%、90%丙酮及純丙酮梯度脫水處理，并制 成包埋樣品，超薄切片后苯胺黑染色。在電鏡下觀(guān)察細(xì)胞樣品中的VLP的大小及形態(tài)。另 取純化后的VLP分別滴一小滴于銅網(wǎng)上，室溫放置90s，再滴一小滴磷鎢酸染色液于VLP液 體中，小心吸去多余液體，室溫靜置待其固定后在進(jìn)行電鏡下觀(guān)察，以觀(guān)察上清中的VLP。
[0036] 、Western-blot 檢測(cè)： 在經(jīng)純化的各組VLP樣本中加入10X SDS-PAGE loading buffer和β-巰基乙醇，混 勾后沸水浴5 min處理樣品和預(yù)染蛋白marker。取處理過(guò)的樣品40 μL加入蛋白凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE分析，160 V電泳50 min。電泳結(jié)束后取與凝膠相應(yīng)大小的PVDF膜用電轉(zhuǎn)儀進(jìn) 行轉(zhuǎn)膜，100 V電轉(zhuǎn)45 min。電轉(zhuǎn)完畢后將印跡有蛋白的PVDF膜放入含5% BSA的PBST封 閉液中，室溫封閉2 h。加入稀釋好的抗病毒包膜糖蛋白和核衣殼蛋白的抗體以及GM-CSF 多抗（Gn mAb 和 Ge mAb 分別檢測(cè) Gn 和 Gc，1A8