本發(fā)明涉及被細(xì)菌艱難梭菌(clostridiumdifficile)感染的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及發(fā)展或重新發(fā)展由于細(xì)菌艱難梭菌的感染的易感性的預(yù)測。

細(xì)菌艱難梭菌是產(chǎn)生毒素的、形成孢子的、厭氧的細(xì)菌，屬于gram+芽孢桿菌類型。它是引起抗生素后假膜性結(jié)腸炎(pmc)或腹瀉的腸病原體，并且主要參與成年人的醫(yī)院內(nèi)腹瀉。由于其非常高的傳染潛力，它是非?？膳碌摹ｋm然約5％的群體是該細(xì)菌的無癥狀攜帶者，但是其病理表現(xiàn)與住院密切相關(guān)。

這種細(xì)菌在通過抗生素療法減弱的腸道菌群中發(fā)展，并且可以分泌兩種毒素，毒素a和毒素b。僅產(chǎn)生毒素的菌株是致病的。毒素a(一種腸毒素)，引起腸道上皮通透性的改變。毒素b(一種細(xì)胞毒素)，直接攻擊上皮細(xì)胞。兩種毒素的聯(lián)合效應(yīng)是減少腸內(nèi)運(yùn)送時(shí)間和腸吸收，導(dǎo)致腹瀉。

幾年前，不認(rèn)為細(xì)菌艱難梭菌是臨床公害。自2003年以來，在美國、加拿大然后在歐洲超高毒性菌株如菌株艱難梭菌核糖體型027(c.difficileribotype027)的出現(xiàn)和快速傳播導(dǎo)致對這種細(xì)菌的公眾健康警惕(kuijpere.j.etal.,2006)?，F(xiàn)在它是醫(yī)院內(nèi)感染性腹瀉的主要原因，造成15％-25％的假膜性結(jié)腸炎病例(bartlettj.g.,2002)。其在綜合醫(yī)院中引起日益嚴(yán)重的病例和增加的死亡率。每天，在美國10000個(gè)患者中有7-12人受到影響(freemanj.etal.,2010)，在歐洲10000個(gè)患者中多達(dá)5人受到影響(bauerm.p.etal.,2011)。

糞便樣品中感染艱難梭菌的診斷是已知的。其由幾個(gè)步驟組成。不是必須的第一步由研究代表這種細(xì)菌存在的可檢測蛋白之一(即谷氨酸脫氫酶(gdh))組成。其他可檢測蛋白是在細(xì)菌產(chǎn)生毒素時(shí)分泌的毒素。gdh的檢測或定量可以通過免疫測定進(jìn)行，例如通過elisa測定。這種技術(shù)給出比通過毒素的免疫測定檢測或定量更大的診斷靈敏度。如果gdh測試為陽性，則推薦毒素的研究，因?yàn)檫@種技術(shù)提供更大的特異性。

糞便樣品中毒素的這種研究構(gòu)成第二步，或者如果未進(jìn)行g(shù)dh的研究，則構(gòu)成第一步。其可以通過elisa測定或通過細(xì)胞毒性測定進(jìn)行，后者構(gòu)成“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。還可能使用pcr，其更靈敏。這種技術(shù)的主要缺點(diǎn)是其僅檢測毒素a和/或b基因的存在，不指示毒素是否實(shí)際產(chǎn)生，這可能對特異性是有害的。事實(shí)上，毒素的產(chǎn)生可能是失活的，在這種情況下，菌株是不致病的。

最后，如果糞便樣品中毒素的研究是陰性的，在合適的ccfa(環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂)培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，這構(gòu)成第三步。如果培養(yǎng)是陽性的，對菌落進(jìn)行毒素的研究，例如通過elisa測定或通過細(xì)胞毒性測定。

證實(shí)患者患有艱難梭菌感染之后，他接受治療。這種治療包括抗生素如甲硝唑(mtz)或萬古霉素(va)。但是，治療經(jīng)常失敗，并且再感染率在最初發(fā)作中達(dá)到20％，在連續(xù)感染中達(dá)到40％-60％(c.p.kellyandj.t.lamont,2008andd.w.eyreetal.,2012)。再感染通常發(fā)生在原發(fā)感染治療結(jié)束之后的28天內(nèi)，但是延遲可以長達(dá)6-8周。

在1994年，warnym.等(warnym.etal.,1994)在具有感染艱難梭菌的單一發(fā)作的21個(gè)非免疫抑制患者以及具有(多次)再感染的4個(gè)非免疫抑制患者中研究了人對艱難梭菌的毒素a的免疫應(yīng)答。在這個(gè)研究中，作者觀察到抗毒素a血清igg抗體和抗毒素a糞便iga抗體的滴度在具有艱難梭菌感染的單一發(fā)作的患者中顯著高于具有(多次)再感染的患者。對非常少量患者獲得的后一種情況未做進(jìn)一步研究。另一組(johnsons.etal.,1992)甚至獲得了相反的結(jié)果，在這個(gè)意義上他們發(fā)現(xiàn)具有再感染的患者具有高滴度的抗毒素a血清抗體。

詳細(xì)制定了評分系統(tǒng)用于預(yù)測哪些患者對發(fā)展艱難梭菌感染易感。這個(gè)評分系統(tǒng)是基于幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，如患者的年齡、住院、抗生素的施用等(gareyk.w.etal.,2008)。但是，來自評分的結(jié)果并不總是一致，因此臨床醫(yī)生仍沒有獲得如體外診斷測試的簡單工具。

尚未有研究組成功提出體外測定，使得可以在有風(fēng)險(xiǎn)的患者中預(yù)測對發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染易感的那些患者。

因此有多年未滿足的迫切需要，發(fā)現(xiàn)好工具以便能夠在有風(fēng)險(xiǎn)的患者中預(yù)測具有發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)的那些患者。

申請人出乎意料地發(fā)現(xiàn)可以使用iga型糞便抗體，針對艱難梭菌的毒素b，作為鑒定所述風(fēng)險(xiǎn)患者的標(biāo)記。

因此，本發(fā)明涉及一種預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)患者發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的易感性的方法，所述方法包括或由以下組成：通過免疫測定確定來自所述患者的糞便樣品中針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體水平，以及將這個(gè)水平與以前用暴露于所述細(xì)菌的兩群患者確定的參考值s進(jìn)行比較，一群尚未發(fā)展或重新發(fā)展這樣的感染，另一群已發(fā)展或重新發(fā)展這樣的感染，

-低于所述參考值s的水平表示所述患者是具有增加的發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者，以及

-高于所述參考值s的水平表示所述患者不是具有增加的發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者。

其還涉及一種通過免疫測定確定在可能包含至少一種iga抗體的患者的生物樣品中所述至少一種iga抗體的水平的方法，所述至少一種iga抗體針對在酸的存在下不受影響的蛋白，優(yōu)選針對艱難梭菌的毒素b。所述方法包括或由將一種或多種結(jié)合配對物帶至所述至少一種iga抗體組成，用于進(jìn)行免疫測定，與包含用酸性樣品處理緩沖液預(yù)處理的所述生物樣品的酸性反應(yīng)混合物接觸，在其用于免疫測定之前不中和。

本發(fā)明最終涉及一種試劑盒，其通過免疫測定確定在可能包含至少一種iga的患者的生物樣品，特別是糞便樣品中所述至少一種iga抗體的水平，所述至少一種iga抗體針對在酸的存在下不受影響的蛋白，特別是針對艱難梭菌的毒素b，所述試劑盒包括：(i)用于進(jìn)行免疫測定的所述至少一種iga抗體的一種或多種結(jié)合配對物(bindingpartner)，以及(ii)酸性樣品處理緩沖液，應(yīng)當(dāng)理解所述試劑盒不含任何中和溶液。

出乎意料的是，申請人因此顯示可以通過免疫測定確定來自所述患者的糞便樣品中針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體水平，預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)患者發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的易感性。

“發(fā)展艱難梭菌感染”表示患者第一次發(fā)展感染，無論艱難梭菌的菌株。

“重新發(fā)展艱難梭菌感染”表示患者有復(fù)發(fā)，即舊病復(fù)發(fā)(由于相同的艱難梭菌菌株感染)或再感染(由于不同于引起原發(fā)感染的菌株的艱難梭菌菌株感染)。

“風(fēng)險(xiǎn)患者”表示易受感染(vulnerable)的人。這個(gè)患者可能由于他的狀況易受感染，例如因?yàn)椋?/p>

-他是免疫抑制的，或者可能在未來藥物治療之后或在新疾病發(fā)生時(shí)變得免疫抑制；

-他剛剛發(fā)展感染，無論微生物，除了艱難梭菌；在這種情況下他可能已接受抗生素治療；

-他剛剛發(fā)展艱難梭菌感染；在這種情況下他可能已接受抗生素治療。在這種情況下，這個(gè)患者可以重新發(fā)展艱難梭菌感染。

他還可能由于他的年齡易受感染，因?yàn)樗窃绠a(chǎn)兒、嬰兒或超過65歲的人。

他還可能由于他的環(huán)境易受感染，因?yàn)樗幱诨蚣磳⑻幱诳赡艽嬖谄D難梭菌細(xì)菌的地方，如醫(yī)院或護(hù)理中心。

當(dāng)然，一個(gè)人可能僅具有這些易受感染性的風(fēng)險(xiǎn)之一，或者可能積累它們。

作為風(fēng)險(xiǎn)患者的非限制性實(shí)例，我們可以提到剛剛患有艱難梭菌感染、仍在醫(yī)院中的人。在這種情況下，本發(fā)明的所述方法可以在治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行(約7-10天的治療之后和治療結(jié)束之后長達(dá)28天)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述風(fēng)險(xiǎn)患者是診斷為已患有艱難梭菌感染的患者，并且風(fēng)險(xiǎn)由重新發(fā)展新的艱難梭菌感染組成。

我們還可以提到已知或不知道已患有艱難梭菌感染且到達(dá)醫(yī)院的人，這些人有接受抗生素治療和/或免疫抑制劑的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述風(fēng)險(xiǎn)患者是到達(dá)醫(yī)院且可能接受導(dǎo)致他的免疫防御減少的藥物的患者。

我們還可以提到年齡超過65歲，或者免疫抑制的，并且有用抗生素和/或免疫抑制劑治療的風(fēng)險(xiǎn)的到達(dá)醫(yī)院的人，無論這些人的艱難梭菌感染狀態(tài)，即從未患有艱難梭菌感染，是艱難梭菌的攜帶者或已患有艱難梭菌感染。

根據(jù)本發(fā)明的所述方法的結(jié)果和患者的分層，如果認(rèn)為他是具有增加的發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者，則臨床醫(yī)生能夠決定一個(gè)或多個(gè)以下行動：施用適度的抗生素療法，隔離患者以避免任何污染，推遲免疫抑制劑治療，施用預(yù)防性免疫療法，接種疫苗。

預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)患者發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的易感性的所述方法采用免疫測定。免疫測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測試。簡單地說，其由利用分析物的至少一種結(jié)合配對物確定分析物的水平組成，在本申請情況下針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體。

當(dāng)然，例如，術(shù)語“免疫測定”中的前綴“免疫”，在本申請中并不認(rèn)為嚴(yán)格表示結(jié)合配對物必須是免疫來源的配對物，如抗體或抗體片段。事實(shí)上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，這個(gè)術(shù)語更廣泛用于表示測定和方法，其中結(jié)合配對物不是免疫來源/性質(zhì)的配對物，而是例如由我們希望檢測和/或定量的分析物的受體組成。必要條件是涉及的結(jié)合配對物應(yīng)當(dāng)能夠結(jié)合至需要的分析物，在本申請情況下具有抗體的性質(zhì)，優(yōu)選特異性地。因此，已知對使用在嚴(yán)格意義上不是免疫的結(jié)合配對物的測定談到elisa測定，在英語中更常稱作“配體結(jié)合測定(ligandbindingassay)”，其可以翻譯為法語“essaiutilisantlaliaisonàunligand”，而術(shù)語“免疫”包括在對應(yīng)于首字母縮略語elisa的全稱中。為了清晰和一致，術(shù)語“免疫”在本申請中用來表示使用至少一種適合結(jié)合至需要的分析物以及檢測和/或定量后者的結(jié)合配對物的任何生物學(xué)分析，優(yōu)選特異性地，即使所述結(jié)合配對物在嚴(yán)格意義上不是免疫性質(zhì)或來源。

“針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體的結(jié)合配對物”，也稱作針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體，表示能夠結(jié)合至所述iga的任何分子。作為抗毒素biga的結(jié)合配對物的實(shí)例，我們可以提到天然或重組毒素b、毒素b片段、抗iga抗體或已知與抗毒素biga相互作用的任何其他分子。

天然來源(也稱作天然)的毒素b可以在培養(yǎng)細(xì)菌艱難梭菌并從細(xì)菌裂解物中純化蛋白之后獲得。重組毒素b可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)，通過遺傳工程獲得。這例如由andersonbmetal.,1993描述。天然毒素b可以獲得自公司如thenativeantigencompany(upperheyford,unitedkingdom)。

抗體類型的結(jié)合配對物是例如多克隆抗體或單克隆抗體，其制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

作為抗體片段的實(shí)例，我們可以提到片段fab、fab'、f(ab')2以及scfv(單鏈可變片段)、dsfv(雙鏈可變片段)。這些功能性片段可以特別地通過遺傳工程獲得。

由確定抗毒素biga水平組成的免疫測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的半定量或定量測定，優(yōu)選采用iga的兩種結(jié)合配對物?？梢詫煞N配對物之一偶聯(lián)至標(biāo)記以形成綴合物或示蹤物(tracer)?？梢詫⒘硪环N結(jié)合配對物捕獲在固體支持物上。然后我們說后者為捕獲配對物，前者為檢測配對物。優(yōu)選地，所述捕獲配對物是艱難梭菌的毒素b，而所述檢測配對物是抗人iga抗體。

然后所述免疫測定中發(fā)出的測量信號與生物樣品中抗毒素biga的量成比例。

特別地，標(biāo)記表示包含與結(jié)合配對物的基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的任何分子，其直接而沒有化學(xué)修飾，或者在化學(xué)修飾之后以便包括這樣的基團(tuán)，所述分子能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測的信號。這些直接檢測標(biāo)記的非窮舉列表由以下組成：

·產(chǎn)生例如通過比色法、熒光、發(fā)光可檢測的信號的酶，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，

·發(fā)色團(tuán)如熒光化合物、發(fā)光化合物、染料，

·放射性分子如³²p、³⁵s或¹²⁵i，

·熒光分子如alexa染料或藻藍(lán)蛋白，以及

·電化學(xué)發(fā)光鹽如基于吖啶(acridinium)或釕的有機(jī)金屬衍生物。

還可以使用間接檢測系統(tǒng)，例如能夠與抗配體反應(yīng)的配體。然后所述配體對應(yīng)于標(biāo)記，與所述結(jié)合配對物構(gòu)成綴合物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉配體/抗配體對，例如以下對：生物素/鏈霉抗生物素蛋白、半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸補(bǔ)體。

然后抗配體可以通過上文所述的直接檢測標(biāo)記直接檢測，或者其本身可以通過另一配體/抗配體對檢測，等等。

在某些條件下，這些間接檢測系統(tǒng)可以導(dǎo)致信號的放大。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉信號放大的這種技術(shù)，并且可以參考申請人較早的專利申請fr2781802或wo95/08000。

根據(jù)所用的標(biāo)記的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員會添加試劑用于標(biāo)記的可視化，或者發(fā)射通過任何合適類型的測量設(shè)備如分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、密度計(jì)或高清攝像機(jī)可檢測的信號。

免疫測定還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他步驟，如洗滌步驟和溫育步驟。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，免疫測定可以是一步或兩步測定。簡單地說，一步免疫測定包括使測試樣品與兩種結(jié)合配對物同時(shí)接觸，而兩步免疫測定包括一方面使測試樣品與第一結(jié)合配對物接觸，然后使由此形成的分析物-第一結(jié)合配對物復(fù)合物與第二結(jié)合配對物接觸。

本發(fā)明的方法中使用的參考值s是預(yù)先用暴露于細(xì)菌艱難梭菌的兩群患者獲得的值，例如在醫(yī)院環(huán)境中，一群尚未發(fā)展或重新發(fā)展這樣的感染，而另一群已發(fā)展或重新發(fā)展這樣的感染。所述確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。其特別地由以下組成：在來自這兩個(gè)群體的糞便樣品中進(jìn)行與本發(fā)明的方法中采用的相同的免疫測定，以及確定測定(信號)值以區(qū)分這兩個(gè)群體。

當(dāng)參考值s是抗體的數(shù)量、滴度或濃度時(shí)，采用的免疫測定是定量的，并且來自所述方法的結(jié)果給出iga抗體的數(shù)量、滴度或濃度。然后必須利用以前從標(biāo)準(zhǔn)范圍建立的數(shù)學(xué)模型將獲得的信號與生物樣品中的數(shù)量、滴度或濃度關(guān)聯(lián)。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)范圍會以已知的方式預(yù)先獲得。簡單地說，獲得標(biāo)準(zhǔn)范圍由以下組成：測量已知的、增加量或濃度的抗毒素biga抗體產(chǎn)生的信號，作圖曲線給出信號作為數(shù)量、滴度或濃度的函數(shù)，以及找到盡可能忠實(shí)地表示這種關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。所述數(shù)學(xué)模型將用于通過外推確定待測試的生物樣品中包含的未知抗毒素biga抗體的數(shù)量、滴度或濃度。

在本發(fā)明的意義上可用的可能包含抗艱難梭菌毒素b的iga的生物樣品是患者的糞便樣品。它們可以是糞便本身或直腸灌腸劑。這些樣品可以如它們在本發(fā)明的方法中使用，或者可以經(jīng)過預(yù)處理，優(yōu)選后一實(shí)施方案。

糞便樣品是難以處理的基質(zhì)。iga可以包括在由粘液、蛋白質(zhì)、毒素、顆粒等組成的復(fù)合物中。根據(jù)一實(shí)施方案，將免疫測定中采用的糞便樣品預(yù)先用酸性樣品處理緩沖液處理。酸性樣品處理緩沖液表示具有1.5-3(優(yōu)選2-3)的ph的緩沖液，優(yōu)選2.5的ph。

作為適合本發(fā)明的目的的酸性樣品處理緩沖液的實(shí)例，我們可以提到鹽酸-甘氨酸緩沖液(ph2.2-3)、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(ph2.2-3)、鹽酸-氯化鉀緩沖液(ph2-2.2)和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3)。

糞便樣品預(yù)處理的持續(xù)時(shí)間必須是合理的，最多30分鐘的持續(xù)時(shí)間是合適的。根據(jù)一實(shí)施方案，糞便或直腸灌腸劑樣品預(yù)處理的持續(xù)時(shí)間為最多30分鐘，優(yōu)選最多20分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘、45秒、30秒、15秒或10秒。

這樣處理的生物樣品然后經(jīng)過分離，特別地通過過濾或沉降，例如離心，然后回收包含所關(guān)注的iga的濾液或上清液，用于本發(fā)明的方法的免疫測定。

通常，當(dāng)生物樣品經(jīng)過酸預(yù)處理時(shí)，然后在用于免疫測定之前將這樣獲得的反應(yīng)混合物中和以再次提高ph，以避免改變用于免疫測定的結(jié)合配對物，特別是捕獲配對物。出乎意料的是，這樣的中和步驟在本發(fā)明的方法中不是必需的，因此，根據(jù)一實(shí)施方案，樣品預(yù)處理步驟不包括在用于免疫測定之前中和反應(yīng)混合物的步驟。

“反應(yīng)混合物中和步驟”表示添加中和溶液，對于待中和的酸性溶液是堿性的，允許ph提高至7左右以不改變免疫測定中采用的結(jié)合配對物。在本發(fā)明的背景下，這個(gè)步驟因此是不必要的。

應(yīng)當(dāng)注意免疫測定中常規(guī)使用的所有其他緩沖液，如洗滌緩沖液或反應(yīng)緩沖液，不是中和溶液，因?yàn)樗鼈兊哪康牟皇菍⑺嵝苑磻?yīng)混合物的ph帶回至7左右。

其他標(biāo)記可以用于輔助預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)患者發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的易感性。這類標(biāo)記例如針對艱難梭菌毒素a的iga抗體。

可以與對確定針對毒素b抗體水平的描述相似地進(jìn)行針對艱難梭菌毒素a的iga抗體水平的確定：在糞便樣品中，如果必要用酸性樣品處理緩沖液預(yù)處理，通過進(jìn)行免疫測定。

正如我們剛才看到的，出乎所有人意料地，由確定生物樣品中的iga水平組成的免疫測定可以在酸性反應(yīng)混合物中進(jìn)行。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種通過免疫測定確定可能包含至少一種iga抗體的患者的生物樣品中所述至少一種iga抗體水平的方法，所述方法包括使用于進(jìn)行免疫測定的所述至少一種iga抗體的一種或多種結(jié)合配對物與包含用酸性樣品處理緩沖液預(yù)處理的所述生物樣品的酸性反應(yīng)混合物接觸，在其用于免疫測定之前不中和。

換句話說，通過免疫測定確定可能包含至少一種iga抗體的患者的生物樣品中所述至少一種iga抗體的水平包括或由以下組成：

-提供用酸性樣品處理緩沖液預(yù)處理的患者的生物樣品，

-提供包含所述至少一種iga抗體的一種或多種結(jié)合配對物的免疫測定試劑盒，

-使所述預(yù)處理的樣品與所述試劑盒中的結(jié)合配對物或多種配對物接觸，應(yīng)當(dāng)理解所述預(yù)處理的樣品在其與結(jié)合配對物或多種配對物接觸之前不經(jīng)歷中和，以及

-確定iga抗體的水平。

在本發(fā)明的意義上合適的iga抗體是針對在酸的存在下不受影響的蛋白質(zhì)的抗體。事實(shí)上，為了所述方法是特異性的，作為iga抗體的結(jié)合配對物，適合至少使用抗體識別的蛋白質(zhì)或其片段。與預(yù)處理的樣品接觸，因此在酸ph下的這種蛋白質(zhì)必須承受這種酸性條件。

“在酸的存在下不受影響的蛋白質(zhì)”表示在酸ph下其三維結(jié)構(gòu)經(jīng)歷變化不大的任何蛋白質(zhì)。對應(yīng)于酸變性耐受性的這種穩(wěn)定性可以通過任何已知方法證實(shí)，例如通過dsc(差式掃描量熱法)類型的微量熱法。簡單地說，這種方法由以下組成：強(qiáng)制具有期望ph的介質(zhì)中的量熱計(jì)內(nèi)的蛋白質(zhì)熱變性，以及從進(jìn)行的測量推導(dǎo)兩個(gè)參數(shù)，即tm和δh。tm是半經(jīng)驗(yàn)參數(shù)，其對應(yīng)于50％的蛋白質(zhì)為天然狀態(tài)且50％為變性狀態(tài)的溫度。δh(焓的變化，或變性的熱)是對應(yīng)于必須提供給蛋白質(zhì)以獲得其完全變性的能量的定量參數(shù)。這兩個(gè)參數(shù)與受試蛋白質(zhì)的固有穩(wěn)定性直接關(guān)聯(lián)：它們各自的值增加越多，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性相對于參考值越大。

為了確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)在酸的存在下是否受到影響，必須確定這種蛋白質(zhì)在酸ph下和在其免疫穩(wěn)定性ph下的tm和/或δh。在這個(gè)比較實(shí)驗(yàn)中，ph是唯一的可變因子。待研究的蛋白質(zhì)的濃度、加熱速率和緩沖液的化學(xué)性質(zhì)必須全部恒定。因此，緩沖劑必須選擇具有幾個(gè)pka值，提供廣泛的緩沖效應(yīng)，如磷酸鹽(1.7-2.9；5.8-8.0)、檸檬酸鹽(2.2-6.5)或琥珀酸鹽(3.2-5.2；5.5-6.5)，或者使用可以覆蓋范圍ph3-ph10的tri-緩沖液。為這個(gè)比較實(shí)驗(yàn)選擇的所述酸ph是根據(jù)本發(fā)明的酸性樣品處理緩沖液的ph。當(dāng)在酸ph下確定的δh相對于在蛋白質(zhì)的免疫穩(wěn)定性ph下確定的δh不相差最多約25％，優(yōu)選最多約10％時(shí)，認(rèn)為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在酸的存在下不受影響。如果是已計(jì)算的tm，在酸ph下確定的tm相對于在研究的蛋白質(zhì)的免疫穩(wěn)定性ph下確定的tm必須不相差最多約25％，優(yōu)選最多約10％。

在酸的存在下不受影響的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。作為實(shí)例，我們可以提到微生物的蛋白質(zhì)，如細(xì)菌和病毒的蛋白質(zhì)，特別是細(xì)菌和病毒結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，除了包膜，例如hcv病毒的核心蛋白，以及毒素如艱難梭菌的毒素a和b。

在預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)患者發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染的易感性的方法的背景下上文描述的特征應(yīng)用于確定這里描述的iga水平的方法，例如免疫測定本身，酸性樣品處理緩沖液的性質(zhì)，其ph，酸處理之后是否使用通過反應(yīng)混合物的過濾或沉降分離。

特別地，如上，預(yù)處理的持續(xù)時(shí)間必須是合理的，特別是少于30分鐘，與tressu.etal.,2006的教導(dǎo)相反，其推薦來自狗的糞便樣品的過夜處理用于定量總iga和免疫測定之前的中和步驟。

診斷和預(yù)后關(guān)注且針對在酸的存在下不受影響的蛋白質(zhì)的所有iga抗體，包括針對艱難梭菌的毒素b的那些iga抗體，優(yōu)選分泌的，適合這種方法的目的。此外，除糞便和直腸灌腸劑以外的生物樣品，如粘液、痰、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarwash)、陰道分泌物、陰道灌腸劑、汗液、淚液、唾液、乳汁和初乳，也是合適的。

用于通過免疫測定確定在可能包含至少一種iga的患者的生物樣品中所述至少一種針對在酸的存在下不受影響的蛋白質(zhì)的iga抗體(特別是針對艱難梭菌的毒素b的iga抗體)的水平的試劑盒構(gòu)成本發(fā)明的另一目的，所述試劑盒包含或含有：(i)用于進(jìn)行免疫測定的所述至少一種iga抗體的一種或多種結(jié)合配對物，以及(ii)酸性樣品處理緩沖液，優(yōu)選ph2.5，應(yīng)當(dāng)理解所述試劑盒不含任何中和溶液。

這種試劑盒的組分和特征如上文定義。

根據(jù)另一具體實(shí)施方案，所述試劑盒還包含或含有至少一個(gè)對照樣品，其是包含已知量的針對艱難梭菌毒素b的iga抗體的樣品。

所述試劑盒還可以包含證實(shí)結(jié)合配對物或多種配對物與靶iga抗體之間的反應(yīng)必需的所有化合物，如洗滌緩沖液或者允許可檢測信號標(biāo)記或發(fā)射可視化的試劑。

從以下實(shí)施例(為了說明目的給出且是非限制性的)以及從圖1中會更好地理解本發(fā)明，圖1示出曲線圖，其給出利用儀器獲得的rfv信號，對應(yīng)于免疫測定之前與酸性樣品處理緩沖液接觸的3個(gè)糞便樣品(s719-高陽性樣品；s709-低陽性樣品；和s700-陰性樣品)的抗毒素b的iga抗體水平，作為樣品和酸性樣品處理緩沖液之間接觸的持續(xù)時(shí)間的函數(shù)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：艱難梭菌的重組毒素a和b的制備

編碼艱難梭菌的毒素a的tcda基因和編碼艱難梭菌的毒素b的tcdb基因源自參考菌株vpi10463，toxinotype0，核糖體型087(毒素a：swissprot登錄號：p16154和毒素b：swissprot登錄號：p18177)。對于每個(gè)基因，通過geneart(invitrogen)優(yōu)化整個(gè)序列用于在大腸桿菌(e.coli)中表達(dá)，并且在n-端側(cè)添加8個(gè)組氨酸以允許通過金屬-螯合物親和色譜進(jìn)行純化。通過ncoi和bamhi限制性位點(diǎn)將獲得的合成基因克隆入pet3d載體(novagen)中。

將這樣構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒引入大腸桿菌bl21細(xì)菌和衍生物(stratagene,agilenttechnologies)。在2xyt培養(yǎng)基(difco)中，在100μg/ml氨芐西林和10％葡萄糖的存在下，在24℃攪拌下進(jìn)行培養(yǎng)。一旦其處于指數(shù)生長階段，通過添加1mm的iptg(異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)4h來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過在4℃下以10000g離心30min來收集細(xì)菌。將細(xì)菌沉淀物在-80℃下冷凍。

將細(xì)菌沉淀物置于pbs緩沖液2x(磷酸緩沖鹽水)中并裂解。將裂解物在4℃下以3000g離心30min。上清液包含純化的可溶性蛋白質(zhì)，重組毒素a或毒素b，取決于最初使用的表達(dá)質(zhì)粒。

通過一步金屬-螯合物親和色譜純化蛋白質(zhì)。將離心之后獲得的上清液裝載在ni-nta-瓊脂糖樹脂(qiagen)上。洗滌循環(huán)之后，在250mm咪唑的存在下洗脫所述蛋白質(zhì)(毒素a或毒素b)。將蛋白質(zhì)在50mm磷酸鹽、150mmnacl緩沖液中透析。

實(shí)施例2：檢測針對毒素b的糞便iga的免疫測定

利用自動化免疫分析儀(biomérieux)進(jìn)行免疫測定。一次性圓錐體用作反應(yīng)的固相和移液系統(tǒng)。暗盒包含用鋁箔覆蓋、密封和標(biāo)記的10個(gè)孔(x0-x9)。第一個(gè)孔(x0)包含預(yù)切部分以便于樣品插入。最后一個(gè)孔(x9)為光學(xué)比色杯，其中測量底物的熒光。中間的孔(x1-x8)中包含分析所需的各種試劑。測定的所有步驟通過儀器自動進(jìn)行。它們由反應(yīng)混合物的抽吸/排出的一連串循環(huán)組成。

a)圓錐體的敏化和鈍化

將圓錐體用300μl的在pbs緩沖液，ph7.2中稀釋至2μg/ml的重組或天然毒素b的溶液敏化。滅活的天然毒素b(cat.no.cdb-tdl)獲得自thenativeantigencompany(upperheyford,unitedkingdom)。在+18/25℃下用敏化溶液溫育約20h之后，將圓錐體清空。然后添加300μl的包含5g/l牛白蛋白的200mmtris溶液。在+18/25℃下繼續(xù)鈍化過夜。將圓錐體清空，干燥，然后儲存在+4℃下直至使用，遠(yuǎn)離潮濕。

b)樣品預(yù)處理

使1體積的糞便與3體積的樣品處理緩沖液接觸(稀釋1/4)。這種緩沖液的組成的改進(jìn)在實(shí)施例3中說明。進(jìn)行手動勻漿，然后在渦旋振蕩器中攪拌。這個(gè)步驟需要約30秒-2分鐘，取決于糞便稠度。將樣品以12000g離心5分鐘以回收可溶性蛋白質(zhì)。對這個(gè)上清液進(jìn)行免疫測定，將所述上清液直接沉積在暗盒的孔x1中。

c)免疫測定方法

孔x1包含300μl的樣品稀釋劑，具有與樣品處理緩沖液相同的組成。將200μl的步驟b)中獲得的上清液轉(zhuǎn)移至孔x1以進(jìn)行額外的稀釋。一旦圓錐體與樣品接觸，免疫反應(yīng)的第一步就開始。這步允許糞便樣品上清液中存在或不存在的糞便抗毒素biga特異性結(jié)合至圓錐體上吸附的毒素b。在37℃下溫育4分鐘之后，通過用200mmtris緩沖液ph7.8、nacl300mm、200.25％洗滌去除未結(jié)合的組分。在第二步中，將圓錐體用在10mm磷酸鹽緩沖液(包含300mm的nacl和5g/l的牛血清白蛋白)中包含約0.5μg/ml的偶聯(lián)至堿性磷酸酶的抗人iga小鼠igg(biomérieux)的綴合物溶液溫育。孔x5包含400μl的這種溶液，仍然在37℃下圓錐體抽吸/排出5分鐘。所述第二步導(dǎo)致在糞便抗毒素biga和偶聯(lián)至堿性磷酸酶的抗iga綴合物之間形成復(fù)合物。這步之后是3個(gè)連續(xù)洗滌操作以去除未固定的化合物。

在最后的檢測步驟中，抽吸底物4-甲基傘形酮基磷酸酯然后在圓錐體中排出；綴合物的酶催化這種底物的水解反應(yīng)至4-甲基傘形酮，在450nm處測量其發(fā)射的熒光。熒光信號的值(rfv＝相對熒光值)與樣品中存在的糞便抗毒素biga的濃度成比例。

下文表1示出利用緩沖液r1作為樣品處理緩沖液通過自動化儀器確定的熒光信號(rfv＝相對熒光值)。這種緩沖液形成檢測糞便中的毒素a和b的艱難梭菌毒素a&b試劑盒(cat.no.30118,biomérieux)的部分。如試劑盒的說明書所述，其ph為7.2。其用于從人糞便提取毒素。使用的糞便樣品獲得自咨詢departmentofdr.robertspencer,healthprotectionagencyregionallaboratory,bristol,unitedkingdom懷疑的艱難梭菌感染的患者。

表1.人糞便中糞便iga的檢測。

neg＝陰性；pos＝陽性；nd＝未確定

通過比較每個(gè)樣品在測定的檢測限測量的rfv信號解釋免疫測定的結(jié)果，其定義如下：平均背景噪聲(用緩沖液測量的rfv信號)+3標(biāo)準(zhǔn)差。認(rèn)為這個(gè)檢測限以上的信號為陽性：存在抗毒素biga抗體。認(rèn)為這個(gè)檢測限以下的信號為陰性：不存在抗毒素biga抗體。

重要的是注意具有114rfv信號的樣品s709分類為陽性，而具有91rfv信號的樣品s713分類為陰性。絕對值接近的兩個(gè)信號導(dǎo)致不同的生物學(xué)解釋：這種情況并不令人滿意。因此其需要改進(jìn)。

實(shí)施例3：糞便iga提取的優(yōu)化

實(shí)施例2中使用的適合提取毒素a和b的緩沖液r1表明可以改進(jìn)糞便iga的分析。因此利用實(shí)施例2中表征的糞便樣品測試另一樣品處理緩沖液，具有與之前相同的處理時(shí)間(30s和2min)。這種緩沖液是ph2.5的鹽酸-甘氨酸緩沖液(1m甘氨酸ph2.5)。下文表2示出通過自動化儀器確定的熒光信號(rfv＝相對熒光值)。利用其上固定重組毒素b的圓錐體獲得這個(gè)實(shí)驗(yàn)中示出的結(jié)果。

表2.用不同緩沖液從人糞便提取的糞便iga的檢測。酸緩沖液＝1m甘氨酸ph2.5以及實(shí)施例2中描述的緩沖液r1。

pos＝陽性；neg＝陰性

1m甘氨酸酸性緩沖液ph2.5使得可以顯著增加對陽性樣品獲得的rfv信號，比用緩沖液r1多3-7倍。選擇酸ph的提取溶液用于剩余實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例4：樣品和樣品處理緩沖液之間接觸時(shí)間的研究

利用高陽性樣品(s719)、低陽性樣品(s709)和陰性樣品(s700)研究樣品和酸性樣品處理緩沖液(實(shí)施例3中的條件)之間接觸的持續(xù)時(shí)間。結(jié)果在圖1中示出。陰性樣品(s700)不存在信號的顯著減少。陽性樣品表現(xiàn)出信號減少。30分鐘的溫育之后，對于s719仍有91％的信號，并且對于s709仍有72％的信號。60分鐘之后，對于s719仍有82％的信號，并且對于s709仍有63％的信號。這些結(jié)果表明在1m甘氨酸緩沖液ph2.5的存在下溫育60min引起樣品中存在的抗毒素biga的量顯著減少。在弱陽性樣品的情況下，最好不超過15min以便不損失超過10％的信號。如果與提取緩沖液接觸的持續(xù)時(shí)間過度延長，則這樣的樣品可以被檢測為“陰性”。對于剩余實(shí)驗(yàn)，我們使用約30秒-2分鐘的接觸時(shí)間。

實(shí)施例5：重組毒素b和天然毒素b用于通過免疫測定檢測抗毒素biga的比較

我們比較了當(dāng)使用重組毒素b和天然毒素b制備捕獲相(吸附在圓錐體上)時(shí)獲得的熒光信號。將兩種類型的毒素b以相同濃度(2μg/ml)固定在固相上。結(jié)果在下文表3中示出。樣品sp023和sp池獲得自professorm.delmée,clostridiumdifficilenationalreferencecenter,catholicuniversityoflouvain,brussels,belgium。

重復(fù)上文實(shí)施例3中描述的方法。

除了樣品s709，對所有樣品獲得的信號在固相具有天然毒素時(shí)比重組毒素強(qiáng)。對于陰性樣品，增加可以忽略不計(jì)(+37至+67rfv)，而對于4個(gè)陽性樣品中的3個(gè)，增加非常大(+640至+1797rfv)。因此，使用天然毒素b用于捕獲允許更好地區(qū)分陽性和陰性樣品。

根據(jù)表3中示出的結(jié)果，當(dāng)使用重組毒素b時(shí)陽性閾值固定在200rfv，而當(dāng)使用天然毒素b時(shí)陽性閾值固定在250rfv。

表3.通過重組毒素b或天然毒素b檢測糞便抗毒素biga。根據(jù)實(shí)施例3，糞便樣品的預(yù)處理在1m甘氨酸酸性緩沖液ph2.5的存在下進(jìn)行。

pos＝陽性；neg＝陰性

實(shí)施例6：研究具有多次再感染的患者中的糞便iga和確定參考值s

這個(gè)實(shí)施例中使用的糞便樣品獲得自已重復(fù)感染艱難梭菌的患者，稱作具有多次再感染的患者。這些患者咨詢clinicalmicrobiologydivision,在themedicaldepartmentofthesirmortimerb.davis-jewishgeneralhospital,inmontreal,quebec,canada。根據(jù)實(shí)施例3中的條件，糞便樣品的預(yù)處理在1m甘氨酸酸性緩沖液ph2.5的存在下進(jìn)行。將不同類型的毒素b以相同濃度(2μg/ml)全部固定在固相上。根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法利用實(shí)施例1中描述的毒素通過免疫測定研究針對毒素b的糞便iga以及針對毒素a的糞便iga。結(jié)果在表4中示出。

表4.研究具有多次再感染的患者糞便中的針對毒素b和針對毒素a的糞便iga。

nav＝不可用，由于樣品體積不足，測試不可以進(jìn)行。

在測試的8個(gè)中，在具有多次再感染的3個(gè)患者中，可以檢測到針對毒素b的糞便iga(mr002,mr007,mr008)。對于所有這些患者，獲得的信號在250rfv的測定陽性閾值之上。此外，這些結(jié)果獨(dú)立地證實(shí)使用重組毒素b的免疫測定比使用天然毒素b的方法較不靈敏：患者mr007未檢測為陽性，并且對于200rfv的閾值，患者mr002在陽性的界限，具有191rfv的信號。

患者的臨床隨訪表明所有患者mr001-mr008在他們咨詢并獲得這個(gè)實(shí)施例中使用的樣品之后存在至少一次再感染。我們的測定表明這些患者中的一些(mr002,mr007,mr008)具有抗毒素biga抗體，在一些情況下抗毒素aiga抗體，或者沒有這兩種類型的抗體?？梢缘贸鼋Y(jié)論，這些患者具有的糞便抗毒素biga抗體的滴度不足以保護(hù)免受這樣的再感染。因此這組患者構(gòu)成具有增加的發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者的組。

根據(jù)臨床圖片，患者mr009最初分類為具有多次再感染的患者組。補(bǔ)充生物學(xué)研究表明這事實(shí)上是不合理分類。第一次測定之后監(jiān)測這個(gè)患者3個(gè)月。盡管幾次嘗試，通過培養(yǎng)研究細(xì)菌艱難梭菌通常證實(shí)陰性。未觀察到再感染。因此應(yīng)當(dāng)考慮患者mr009受到保護(hù)免于再感染。這個(gè)患者具有抗毒素biga(1001rfv)和抗毒素aiga(462rfv)。因此這個(gè)患者構(gòu)成沒有增加的發(fā)展或重新發(fā)展艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者的組。

基于對這些患者組獲得的所有這些結(jié)果，我們能夠定義參考值s。對于給定的捕獲抗原，以這樣的方式選擇參考值s：對具有多次再感染的患者mr001-mr008獲得的所有信號低于它，而對患者mr009的那些高于它。

對于抗毒素b抗體，當(dāng)天然毒素b用于捕獲時(shí)，參考值s為870-1000rfv，或者固定在約930rfv。當(dāng)重組毒素b用于捕獲時(shí)，其為200-600rfv，或者固定在約400rfv。對于抗毒素a抗體，當(dāng)重組毒素a用于捕獲時(shí)，參考值s為160-460rfv，或者固定在約310rfv。

實(shí)施例7：研究具有疑似的艱難梭菌感染的毒素a和b陰性患者中的糞便iga

這個(gè)實(shí)施例中使用的糞便樣品獲得自存在懷疑的艱難梭菌感染的患者，在departmentofdr.robertspencer,healthprotectionagencyregionallaboratory,bristol,unitedkingdom。利用試劑盒艱難梭菌gdh(cat.no.30125,biomérieux)和艱難梭菌毒素a和b(cat.no.30118,biomérieux)表征我們擁有的樣品。根據(jù)實(shí)施例2、3和6中描述的方案利用天然毒素b和重組毒素a進(jìn)行糞便iga的研究。

實(shí)施例7中選擇用于研究的樣品全部是毒素a和毒素b陰性的，以及gdh陰性的(表5)。這個(gè)選擇包括兩個(gè)亞組的患者。在第一亞組中，這兩個(gè)測定是陰性的，因?yàn)榛颊邚奈磁c細(xì)菌艱難梭菌接觸。導(dǎo)致懷疑感染艱難梭菌的癥狀是由于其他原因。第二亞組對應(yīng)于事實(shí)上已與細(xì)菌接觸但能夠消除它或限制它的增殖并因此從感染恢復(fù)的患者。我們沒有允許我們區(qū)分這兩個(gè)亞組的臨床數(shù)據(jù)。相反，如果我們檢測患者糞便中的抗毒素biga和/或抗毒素aiga，他們無疑是已有癥狀性感染的患者或者艱難梭菌的攜帶者。因此，我們顯示測試的12個(gè)中的6個(gè)患者(50％)具有實(shí)施例6中定義的參考值s以上的抗毒素b抗體水平。在這6個(gè)患者中，僅5個(gè)還具有實(shí)施例6中定義的參考值s以上的抗毒素a抗體(表5)。因此，如果僅研究抗毒素aiga，患者sp252不會被檢測為具有抗艱難梭菌分泌抗體。

對這個(gè)群體獲得的結(jié)果表明檢測抗毒素biga比檢測抗毒素aiga更靈敏。

表5.研究來自具有懷疑的艱難梭菌感染的患者的糞便中針對毒素b和毒素a的糞便iga。

pos＝陽性；neg＝陰性

實(shí)施例8：研究具有艱難梭菌感染的患者中的糞便iga和預(yù)測再感染

這個(gè)實(shí)施例中使用的糞便樣品獲得自具有證實(shí)的艱難梭菌感染的患者。這些患者出現(xiàn)在clinicalmicrobiologydivision,在themedicaldepartmentofthesirmortimerb.davis-jewishgeneralhospital,inmontreal,quebec,canada。只要可能，對每個(gè)患者收集兩個(gè)連續(xù)的糞便樣品，相隔10-35天。第一個(gè)樣品和第二個(gè)之間的天數(shù)在表6中示出。對于所有患者，對來自第一個(gè)糞便樣品的提取物進(jìn)行細(xì)菌艱難梭菌的遺傳物質(zhì)的pcr研究。這個(gè)研究證實(shí)此研究中包括的所有患者為陽性，因此證實(shí)艱難梭菌感染的臨床懷疑。

根據(jù)實(shí)施例2、3和6中描述的方案利用天然毒素b進(jìn)行糞便iga的研究。在實(shí)施例6中，我們獲得的被確定高于參考值s(930rfv，當(dāng)天然毒素b用于捕獲時(shí))的信號的樣品被認(rèn)為是陽性，并且信號低于這個(gè)值的那些為陰性。結(jié)果在表6中示出。

表6.研究具有艱難梭菌感染的患者的糞便中針對毒素b的糞便iga。

pos＝陽性；neg＝陰性；nav＝不可用，由于樣品體積不足，測試不可以進(jìn)行；na＝不適用。

為了評價(jià)再感染的風(fēng)險(xiǎn)，研究在認(rèn)作原發(fā)感染的感染艱難梭菌之后10-38天(優(yōu)選15-25天)獲得的糞便樣品中的針對毒素b的糞便iga是有用的。

如果糞便樣品包含參考值s以上的抗毒素biga水平，則患者是再感染低風(fēng)險(xiǎn)的：他在認(rèn)作原發(fā)感染的感染艱難梭菌發(fā)作之后最多會具有0或1次再感染。

如果糞便樣品包含參考值s以下的抗毒素biga水平，則患者是再感染高風(fēng)險(xiǎn)的：他在認(rèn)作原發(fā)感染的感染艱難梭菌發(fā)作之后會具有2次或更多次再感染。

通過應(yīng)用這個(gè)規(guī)則做出的預(yù)測在表6中的“再感染的風(fēng)險(xiǎn)”列中示出，其還示出在這些相同患者中實(shí)際觀察到的再感染次數(shù)。應(yīng)該注意到預(yù)測和臨床觀察之間完全一致。

對于3個(gè)患者(cd001、cd002和cd005)，在第一個(gè)之后10-35天不可以獲得第二個(gè)樣品。但是，分析顯示獲得自這些患者的第一個(gè)糞便樣品包含高水平的糞便抗毒素biga。

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