一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于測(cè)量抗體效價(jià)的方法技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè) 定抗體滴度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體蛋白是高等動(dòng)物廣泛表達(dá)的一類(lèi)防御性大分子，能夠識(shí)別病原體（抗原分 子）并與之結(jié)合。現(xiàn)有抗體滴度（效價(jià)）的測(cè)定方法基于抗體與抗原親和的特性。包括 ELISA法、瓊脂糖雙擴(kuò)散法、Becker法和免疫比濁法。1968年Becker發(fā)表了一種基于瓊脂 糖上抗原與抗體免疫單擴(kuò)散形成免疫沉淀復(fù)合物的原理進(jìn)而測(cè)定抗體效價(jià)的方法。該方 法使質(zhì)量已知的抗原在含有未知滴度抗體的瓊脂糖平板上單向擴(kuò)散，使形成免疫復(fù)合物沉 淀，通過(guò)測(cè)定沉淀區(qū)大小來(lái)計(jì)算抗體滴度。Becker法測(cè)定出的抗體滴度單位為毫克每毫升， 相比于W最大稀釋倍數(shù)表示滴度（效價(jià)）的化ISA和瓊脂糖雙擴(kuò)散滴度更加準(zhǔn)確，且測(cè)抗 體滴度相對(duì)其他抗體效價(jià)測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，不依賴(lài)精密設(shè)備。但becker法需要通過(guò)測(cè)量 沉淀環(huán)直徑和瓊脂糖厚度來(lái)計(jì)算得到抗體滴度。而半固體性質(zhì)的瓊脂糖凝膠，其厚度測(cè)量 相對(duì)困難；Becker法在測(cè)定時(shí)因?yàn)榭乖芤旱膭?dòng)態(tài)擴(kuò)散方向并不均一，擴(kuò)散圈直徑測(cè)量也 有偏差，導(dǎo)致依據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算的沉淀環(huán)面積誤差較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有抗體滴度的測(cè)定方法存在易導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果存在偏差、測(cè) 量過(guò)程繁瑣的技術(shù)問(wèn)題，提供一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 陽(yáng)〇化]一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法，包括W下步驟：
[0006] 1)用膠紙密封一個(gè)具有刻度的玻璃管的一端；
[0007] 2)向玻璃管中灌注含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液；
[0008] 3)待瓊脂糖烙融溶液凝固后，打開(kāi)玻璃管一端密封的膠紙，將玻璃管垂直豎立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0009] 4)在豎立的玻璃管的上端加入0. 01~0. 05毫升的已知濃度抗原；
[0010] 5)加入抗原后用膠紙密封玻璃管的上端，防止溶液從上端蒸發(fā)；然后將玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小時(shí)，W使抗原完全擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)部；
[0011] 6)抗原在含有抗體的瓊脂糖柱中完全擴(kuò)散W后，形成乳白色免疫沉淀區(qū)；
[0012] 7)通過(guò)下列公式計(jì)算出抗體滴度：
[0013]
[0014] 其中：C-加入玻璃管內(nèi)的抗原的濃度，VI-加入玻璃管內(nèi)的抗原體積，V2-玻 璃管內(nèi)乳白色免疫沉淀區(qū)體積，V3-玻璃管內(nèi)瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積， V4-玻璃管內(nèi)含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液體積。
[0015] 本發(fā)明采用W上技術(shù)方案，基于免疫單擴(kuò)散原理，將現(xiàn)有測(cè)定方法中使用的中屯、 福射狀單擴(kuò)散，在刻度玻璃管中約束為單一垂直徑向單擴(kuò)散，W消除Becker法偏差，更加 快速準(zhǔn)確的測(cè)量抗體滴度。該方法可通過(guò)刻度玻璃管上的刻度直接讀出單擴(kuò)散形成的免疫 沉淀區(qū)體積，無(wú)需通過(guò)厚度和直徑測(cè)量，獲得結(jié)果更加快捷和準(zhǔn)確。此外，本發(fā)明亦可W將 已知濃度的抗原分散在瓊脂糖凝膠中，使未知濃度的抗體向凝膠中擴(kuò)散。因此，與【背景技術(shù)】 相比，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單和測(cè)量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 本實(shí)施例中的一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法，包括W下步驟：
[0018] 1)用膠紙密封一個(gè)具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管內(nèi)徑4mm，外徑5. 5mm;
[0019] 2)向玻璃管中灌注含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液，含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融 溶液的體積為5毫升，瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積為125微升；
[0020] 3)待瓊脂糖烙融溶液凝固后，打開(kāi)玻璃管一端密封的膠紙，將玻璃管垂直豎立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0021] 4)在豎立的玻璃管的上端加入0.01毫升的已知濃度抗原，加入抗原的濃度為 3mg/ml；
[0022] 5)加入抗原后用膠紙密封玻璃管的上端，防止溶液從上端蒸發(fā)；然后將玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小時(shí)，W使抗原完全擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)部；
[0023] 6)抗原在含有抗體的瓊脂糖柱中完全擴(kuò)散W后，形成乳白色免疫沉淀區(qū)，乳白色 免疫沉淀區(qū)的體積為0. 75ml;
[0024] 7)通過(guò)下列公式計(jì)算出抗體滴度： 陽(yáng)0巧]
[0026] 其中：C-加入玻璃管內(nèi)的抗原的濃度，VI-加入玻璃管內(nèi)的抗原體積，V2-玻 璃管內(nèi)乳白色免疫沉淀區(qū)體積，V3-玻璃管內(nèi)瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積， V4-玻璃管內(nèi)含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液體積，
[0027] 通過(guò)上述公式計(jì)算出抗體滴度為1.6mg/ml，即代表每毫升該抗體可W中和1.6mg 的相應(yīng)抗原。 陽(yáng)0測(cè) 實(shí)施例2
[0029] 本實(shí)施例中的一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法，包括W下步驟：
[0030] 1)用膠紙密封一個(gè)具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管內(nèi)徑4mm，外徑5. 5mm;
[0031] 2)向步驟1)的玻璃管中灌注含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液，含有待測(cè)抗體的 瓊脂糖烙融溶液的體積為5毫升，瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積為300微升；
[0032] 3)待瓊脂糖烙融溶液凝固后，打開(kāi)玻璃管一端密封的膠紙，將玻璃管垂直豎立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0033] 4)在豎立的玻璃管的上端加入0.05毫升的已知濃度抗原，加入抗原的濃度為 3mg/ml；
[0034] 5)加入抗原后用膠紙密封玻璃管的上端，防止溶液從上端蒸發(fā)；然后將玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小時(shí)，W使抗原完全擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)部；
[0035]6)抗原在含有抗體的瓊脂糖柱中完全擴(kuò)散W后，形成乳白色免疫沉淀區(qū)，乳白色 免疫沉淀區(qū)體積為1. 60ml ;
[0036] 7)通過(guò)下列公式計(jì)算出抗體滴度：
[0037]
[0038] 其中：C-加入玻璃管內(nèi)的抗原的濃度，VI-加入玻璃管內(nèi)的抗原體積，V2-玻 璃管內(nèi)乳白色免疫沉淀區(qū)體積，V3-玻璃管內(nèi)瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積， V4-玻璃管內(nèi)含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液體積，
[0039] 通過(guò)上述公式計(jì)算出抗體滴度為1.56mg/ml，即代表每毫升該抗體可W中和 1. 56mg的相應(yīng)抗原。 W40] 實(shí)施例3
[0041] 本實(shí)施例中的一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法，包括W下步驟：
[0042] 1)用膠紙密封一個(gè)具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管內(nèi)徑4mm，外徑5. 5mm;
[0043] 2)向步驟1)的玻璃管中灌注含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液，含有待測(cè)抗體的 瓊脂糖烙融溶液的體積為4. 8毫升，瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積為240微 升；
[0044] 3)待瓊脂糖烙融溶液凝固后，打開(kāi)玻璃管一端密封的膠紙，將玻璃管垂直豎立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0045] 4)在豎立的玻璃管的上端加入0.03毫升的已知濃度抗原，加入抗原的濃度為 15m邑/ml;
[0046] 5)加入抗原后用膠紙密封玻璃管的上端，防止溶液從上端蒸發(fā)；然后將玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小時(shí)，W使抗原完全擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)部；
[0047] 6)抗原在含有抗體的瓊脂糖柱中完全擴(kuò)散W后，形成乳白色免疫沉淀區(qū)，乳白色 免疫沉淀區(qū)體積為1. 27ml ;
[0048] 7)通過(guò)下列公式計(jì)算出抗體滴度：
[0049]
[0050] 其中：C-加入玻璃管內(nèi)的抗原的濃度，VI-加入玻璃管內(nèi)的抗原體積，V2-玻 璃管內(nèi)乳白色免疫沉淀區(qū)體積，V3-玻璃管內(nèi)瓊脂糖烙融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積， V4-玻璃管內(nèi)含有待測(cè)抗體的瓊脂糖烙融溶液體積，
[0051] 通過(guò)上述公式計(jì)算出抗體滴度為7. 09mg/ml，即代表每毫升該抗體可W中和 7. 09mg的相應(yīng)抗原。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 用膠紙密封一個(gè)具有刻度的玻璃管的一端； 2) 向玻璃管中灌注含有待測(cè)抗體的瓊脂糖熔融溶液； 3) 待瓊脂糖熔融溶液凝固后，打開(kāi)玻璃管一端密封的膠紙，將玻璃管垂直豎立于底部 放置有吸水材料的底座上； 4) 在豎立的玻璃管的上端加入0.0 l~0. 05毫升的已知濃度抗原； 5) 加入抗原后用膠紙密封玻璃管的上端，防止溶液從上端蒸發(fā)；然后將玻璃管置于 37°C的恒溫箱中保溫8小時(shí)，以使抗原完全擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)部； 6) 抗原在含有抗體的瓊脂糖柱中完全擴(kuò)散以后，形成乳白色免疫沉淀區(qū)； 7) 通過(guò)下列公式計(jì)算出抗體滴度：其中：C一加入玻璃管內(nèi)的抗原的濃度，Vl-加入玻璃管內(nèi)的抗原體積，V2-玻璃管內(nèi) 乳白色免疫沉淀區(qū)體積，V3-玻璃管內(nèi)瓊脂糖熔融溶液體中加入的待測(cè)抗體體積，V4-玻 璃管內(nèi)含有待測(cè)抗體的瓊脂糖熔融溶液體積。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于測(cè)量抗體效價(jià)的方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用抗原單向擴(kuò)散法測(cè)定抗體滴度的方法。本發(fā)明主要解決了現(xiàn)有抗體滴度的測(cè)定方法存在易導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果存在偏差、測(cè)量過(guò)程繁瑣的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明將現(xiàn)有測(cè)定方法中使用的中心輻射狀單擴(kuò)散，在刻度玻璃管中約束為單一垂直徑向單擴(kuò)散，以消除Becker法偏差，更加快速準(zhǔn)確的測(cè)量抗體滴度；通過(guò)刻度玻璃管上的刻度直接讀出單擴(kuò)散形成的免疫沉淀區(qū)體積，無(wú)需通過(guò)厚度和直徑測(cè)量，獲得結(jié)果更加快捷和準(zhǔn)確。
【IPC分類(lèi)】G01N33/559
【公開(kāi)號(hào)】CN105181961
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510540046
【發(fā)明人】吳紅艷, 蘇少博, 李光飛
【申請(qǐng)人】山西瑞亞力科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年8月28日