專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)手性氨基酸濃度的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)手性氨基酸的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)氨基酸的水平反映了生物體中的許多生命現(xiàn)象，并和許多疾病密切相關(guān)。因此，特別是D型氨基酸的檢測(cè)在臨床診斷和臨床基礎(chǔ)研究中具有重要的意義。然而，由于這類(lèi)化合物缺乏紫外吸收、熒光活性以及電化學(xué)活性，大多分析方法需要對(duì)這類(lèi)化合物進(jìn)行衍生；更為重要的是對(duì)于對(duì)映體的分析往往也需要手性衍生試劑或其他手性拆分技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)，如采用手性色譜柱進(jìn)行分離等?；瘜W(xué)發(fā)光(CL)法檢測(cè)具有靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，且不需要任何外加光源等特點(diǎn)，因而近年來(lái)受到人們的關(guān)注。雖然已有一些發(fā)光體系用 于氨基酸的檢測(cè)(1)過(guò)氧化草酸鹽發(fā)光反應(yīng)測(cè)定氨基酸熒光衍生物。這種方法雖可獲得較高的靈敏度，但是仍需要衍生，且操作復(fù)雜，條件苛刻。(2)魯米諾-次溴酸鹽發(fā)光體系，在堿性條件下，氨基酸會(huì)抑制魯米諾-次溴酸鹽發(fā)光反應(yīng)，以發(fā)光信號(hào)的衰減測(cè)定氨基酸的含量這種方法操作簡(jiǎn)便，但靈敏度受限。(3)魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系，氨基酸可與銅離子形成絡(luò)合物，并催化化學(xué)發(fā)光活性。然而，這些分析方法并不適合于對(duì)映體中的手性氨基酸的含量分析。氨基酸氧化酶因其具有高度的立體專(zhuān)一性而廣泛地應(yīng)用于手性氨基酸的拆分。將氨基酸氧化酶與化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，用于手性氨基酸的分析雖已有文獻(xiàn)報(bào)道。但是這種分析方法多采用流動(dòng)注射法，且發(fā)光體系為金屬離子催化魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系。這種分析方法一方面需要特殊的儀器設(shè)備，另一方面，因?yàn)榇嬖诘牧硪环N氨基酸本身會(huì)抑制該發(fā)光體系，因此也不是適合對(duì)映體中手性氨基酸的分析檢測(cè)。為此，發(fā)展一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的發(fā)光體系，可用于測(cè)定對(duì)映體中手性氨基酸的含量顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光法在檢測(cè)氨基酸時(shí)不能實(shí)現(xiàn)對(duì)映體中手性氨基酸的含量分析，提供一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的化學(xué)發(fā)光法，可用于檢測(cè)對(duì)映體中的手性氨基酸。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下一種檢測(cè)手性氨基酸濃度的方法，包括以下步驟I)在待檢樣品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶進(jìn)行酶催化反應(yīng)；2)在步驟I)所得的反應(yīng)液中依次加入緩沖液、魯米諾、辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；3)測(cè)定步驟2)所得的反應(yīng)液的發(fā)光強(qiáng)度。本發(fā)明的技術(shù)原理在于待測(cè)定的手性氨基酸在相應(yīng)的氨基酸氧化酶的作用下充分轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，進(jìn)一步添加辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化魯米諾發(fā)光，且發(fā)光信號(hào)與測(cè)定的氨基酸濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性相關(guān)，因此可以用于手性氨基酸的測(cè)定。本發(fā)明在測(cè)定D-氨基酸時(shí)，采用D-氨基酸氧化酶；在測(cè)定L-氨基酸時(shí)，則采用L-氨基酸氧化酶。本發(fā)明中，步驟I)為在待檢樣品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶進(jìn)行酶催化反應(yīng)。優(yōu)選的，步驟I)所述的酶催化反應(yīng)的反應(yīng)體系中，還包括常規(guī)的緩沖溶液，優(yōu)選磷酸緩沖液(PBS)。反應(yīng)體系的pH值優(yōu)選7. 5、. 5，更優(yōu)選pH 8.3。緩沖液的總濃度優(yōu)選I. OX 10_21. OmoI/Lο D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶的濃度較佳的為 2.6^4. 4U/ml。酶催化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為2(Γ45° C，反應(yīng)時(shí)間大于I分鐘，優(yōu)選f 15分鐘。其中，加入D-氨基酸氧化酶，測(cè)定D-氨基酸，最佳為D_氨基酸氧化酶2.61.4U/ml，緩沖液為IOmM的磷酸緩沖液，pH為8. 3，酶反應(yīng)溫度為25° C，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。檢測(cè)范圍優(yōu)選原始樣品的濃度為I. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L。其中，加入L-氨基酸氧化酶，測(cè)定L-氨基酸，最佳為L(zhǎng)_氨基酸氧化酶2. 6 4. 4U/ml，緩沖液為IOOmM的磷酸緩沖液，pH為8. 8，酶反應(yīng)溫度為37° C，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。檢測(cè)范圍優(yōu)選原始樣品的濃度2. OX 10+1. OX 10_2mol/L。本發(fā)明中，步驟2)為在步驟I)所得的反應(yīng)液中依次加入緩沖液、魯米諾、辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。所述的緩沖液用于調(diào)整體系的PH在一定的范圍內(nèi)，優(yōu)選的，使反應(yīng)體系的PH值大于9. O。所述的緩沖液是常規(guī)，優(yōu)選磷酸緩沖液。加入的緩沖液的總濃度優(yōu)選O. 0Γ1. OmoI/L0魯米諾的終濃度優(yōu)選I. OX 10_5 I. OX 10_3mOl/L ;辣根過(guò)氧化物酶優(yōu)選O. 1 5. OU/ml。優(yōu)選的，發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)溫度為1(Γ45° C，反應(yīng)時(shí)間為1 10分鐘。最佳為魯米諾I. OX 10_4mOl/L，辣根過(guò)氧化物酶O. 36 0. 6U/ml ;緩沖液為O. lmol/L的磷酸緩沖液，PH為10 ;發(fā)光反應(yīng)的溫度為25° C，反應(yīng)時(shí)間為f 10分鐘。本發(fā)明中，步驟3)為測(cè)定步驟2)所得的反應(yīng)液的發(fā)光強(qiáng)度。所述的測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，一般在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明中，優(yōu)選的，待檢樣品在進(jìn)行步驟I)前還進(jìn)行前處理，即采用陽(yáng)離子交換固相萃取法除去樣品中的如Cu2+、Co2+、Fe3+等金屬離子。具體方法較佳的包括將樣品的pH調(diào)節(jié)為5. 0，采用常規(guī)的方法將SCX SPE小柱活化，將待檢樣品通過(guò)SCX SPE小柱，用4%氨水溶液洗脫，收集洗脫液，即可用于后續(xù)的分析實(shí)驗(yàn)。對(duì)于魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系而言，常見(jiàn)的金屬離子如Cu2+、Co2+、Fe3+等對(duì)該體系均有催化，因而對(duì)測(cè)定存在干擾。為此，在測(cè)定樣品時(shí)通常需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。為消除常見(jiàn)金屬離子的干擾，可采用陽(yáng)離子交換固相萃取法分離金屬離子等對(duì)酶促反應(yīng)以及魯米諾發(fā)光造成影響的雜質(zhì)。本發(fā)明還提供第二個(gè)技術(shù)方案一種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)手性氨基酸濃度的試劑盒，包括以下試劑DD-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶；2)魯米諾溶液；3)辣根過(guò)氧化物酶；和4)緩沖液。本發(fā)明中，試劑2)所述的魯米諾溶液較佳的是濃度在1.0X l(T3mol/L的魯米諾水溶液。本發(fā)明中，試劑4)所述的緩沖液是本領(lǐng)域常規(guī)的緩沖溶液，優(yōu)選10-100mM，pH 8-10的磷酸緩沖液。較佳的包括10mM，pH 8. 3的磷酸緩沖液，IOOmM, pH 8. O的磷酸緩沖液和IOOmM, pH 10的磷酸緩沖液。緩沖液可用于配制D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶的溶液，以及作為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的緩沖液。本發(fā)明中，所述的試劑盒較佳的還包括陽(yáng)離子交換固相萃取柱，優(yōu)選SCX SPE小柱。以及還可以進(jìn)一步包括該萃取柱的活化試劑、洗滌試劑、洗脫試劑等，如甲醇、雙蒸水和磷酸緩沖溶液(O. 01M, pH 5. O)、氨水溶液等。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明中，當(dāng)手性氨基酸在氨基酸氧化酶的作用下充分轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫時(shí)，在辣根過(guò)氧化物酶的作用下可使魯米諾發(fā)光，且發(fā)光信號(hào)與測(cè)定的氨基酸呈線(xiàn)性相關(guān)。其他常 是卻無(wú)法用于對(duì)于對(duì)映體中的手性氨基酸的含量分析。這是因?yàn)?，比如?dāng)選擇D-型的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化D-型氨基酸為過(guò)氧化氫時(shí)，在采用金屬離子催化魯米諾發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，存在的L-型的氨基酸會(huì)抑制金屬離子催化魯米諾的發(fā)光?？偟恼f(shuō)來(lái)是這一發(fā)光體系不能在L-型氨基酸存在時(shí)測(cè)定D-型氨基酸。而且由于辣根過(guò)氧化物酶具有更低的發(fā)光背景和更高的催化效果，因而檢測(cè)靈敏度較高。為此，本發(fā)明以辣根過(guò)氧化物酶催化魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光，構(gòu)建檢測(cè)對(duì)映體中的手性氨基酸的方法。本發(fā)明首次將辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾-過(guò)氧化氫作為發(fā)光體系用于檢測(cè)對(duì)映體中的手性氨基酸。本發(fā)明還在于化學(xué)發(fā)光體系的混合方式、組成配比及適合該檢測(cè)體系的樣品處理方法。采用本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法，可以用于生物樣品中氨基酸的檢測(cè)。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖I是實(shí)施例3中L-氨基酸對(duì)D-氨基酸的干擾實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光柱形圖(辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系)。樣品廣4分別為I,PBS (空白對(duì)照);2，2.0父10_3!1101/1的0-丙氨酸(D-Ala) ;3，D_ 丙氨酸(D-Ala)和L-丙氨酸(L-Ala)混合物，濃度分別為2. OX 10_3mol/L ;4，2. O X lO—W/L的L-丙氨酸(L-Ala)。圖2是實(shí)施例3中在含銅離子的D-型氨基酸溶液SCX小柱處理后的化學(xué)發(fā)光柱形圖(辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系)。樣品廣3分別為l，1.0X10_2mol/L的銅離子(Cu2+)，進(jìn)行SCX小柱處理；2，I. OX 10_3mol/L的D-丙氨酸(D-Ala)，不進(jìn)行樣品處理；3，I. OX 10_3mol/L 的 D-丙氨酸(D-Ala)，進(jìn)行 SCX 小柱處理；4，I. O X 10_3mol/L 的D-丙氨酸，其中含有I. OX 10_2mol/L的銅離子(Cu2+)，進(jìn)行SCX小柱處理。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例I
樣品前處理I、溶液配制①PBS緩沖液稱(chēng)取一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，配制總濃度為IOmM的磷酸緩沖液，調(diào)整溶液的PH為5. O。②氨基酸溶液稱(chēng)取D-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 5. O)溶解，配制成濃度為I. 0X10_3mol/L 的溶液。③銅離子溶液稱(chēng)取一定量的硫酸銅，用IOmM PBS (pH 5. O)溶解，配制成
1.OX 10_2mOl/L的銅離子溶液。④含銅離子的氨基酸溶液在②所配制的氨基酸混合溶液中添加硫酸銅固體，使 其終濃度為I. OX 10_2mol/L。2、陽(yáng)離子交換固相萃取法凈化樣品(I)活化 SCX SPE 小柱(型號(hào)為 CNWBOND SCX, 500mg, 3ml, CNW 公司)。分別用3ml的甲醇、雙蒸水和磷酸緩沖溶液(O. 01M, pH 5. O)各洗滌SPE小柱三次。(2)上樣取上述配制的含銅離子的溶液(即溶液③、④)3ml上活化好的SPE小柱，并用3ml磷酸緩沖溶液(O. 01M，pH 5. O)洗滌三次。最后用3ml 4%氨水洗脫，收集并合并洗脫液，調(diào)節(jié)該溶液的PH值。如果測(cè)定D-氨基酸則調(diào)節(jié)pH值為8. 3，反之測(cè)定L-氨基酸時(shí)為8. 8。實(shí)施例2D-型氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化D-丙氨酸(D-Ala)為過(guò)氧化氫I.溶液配制①D-氨基酸氧化酶溶液稱(chēng)取一定量的D-氨基酸氧化酶，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，濃度為43U/ml。②D-丙氨酸溶液稱(chēng)取D-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，配制成濃度為5· 0Χ10_6、1· 0Χ10_5、5· 0Χ10_5、1· 0Χ10_4、5· 0Χ10_4、1· 0Χ10_3、2· 0X10_3mol/L 的一系列溶液。③L-丙氨酸溶液稱(chēng)取L-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，配制成濃度為
2.0X10_3mol/L 的溶液。④D-丙氨酸和L-丙氨酸混合溶液稱(chēng)取D-丙氨酸和L-丙氨酸，用IOmMPBS (pH
8.3)溶解，配制成終濃度分別為2. OX 10_3mol/L的混合溶液。2、D-氨基酸轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)取3μ I上述D-氨基酸氧化酶溶液(即溶液①)，5 μ I上述氨基酸溶液(即溶液②-④)或?qū)嵤├齀凈化后的溶液和42 μ I IOmM PBS充分混勻后配制為50 μ I的反應(yīng)體系，反應(yīng)液的pH值為8. 3。25° C水浴反應(yīng)10分鐘后，立刻加入發(fā)光反應(yīng)緩沖液。實(shí)施例3化學(xué)發(fā)光檢測(cè)D-丙氨酸I、溶液配制(I)辣根過(guò)氧化物酶溶液稱(chēng)取一定量的辣根過(guò)氧化物酶，用IOOmMPBS (pH 8.0)溶解，濃度為60U/ml。(2)發(fā)光反應(yīng)緩沖液配制O. lmol/L的磷酸緩沖溶液，調(diào)整溶液的pH值至10。
(3)魯米諾溶液稱(chēng)取一定量的魯米諾，用水溶解并配制成濃度為I. OX 10_3mol/L的魯米諾溶液。魯米諾的濃度不宜太高，否則不易溶解，需要加入更多的堿，不利于反應(yīng)體系的pH的控制。2、辣根過(guò)氧化物酶催化魯米諾發(fā)光反應(yīng) 取D-型氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化D-丙氨酸的反應(yīng)液50 μ I，依次加入上述發(fā)光反應(yīng)緩沖液397 μ 1，魯米諾溶液50 μ 1，辣根過(guò)氧化物酶溶液3 μ I。充分混勻后室溫下反應(yīng)3分鐘，取150 μ I加入96孔酶標(biāo)板測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，每組值測(cè)定三次。3、檢測(cè)條件本實(shí)驗(yàn)采用Bioteck的多功能酶標(biāo)儀(Synergy HI),選擇化學(xué)發(fā)光模式,檢測(cè)參數(shù) Gain 值為 100, Read Height I. 00mm。
采用一系列不同濃度梯度的D-丙氨酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濃度在
I.OX 10_5 2. OX Krtiol/L成線(xiàn)性關(guān)系，工作曲線(xiàn)為1=2. OX 1(^0^^+83. 62，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R為O. 998。以3Sb/S計(jì)算檢測(cè)限，D-丙氨酸(D-ALA)的檢測(cè)限分別3. 5X 10_6mol/L。此外，對(duì)樣品D-丙氨酸中含有相同濃度的L-丙氨酸進(jìn)行了發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定，結(jié)果如圖I所示，L-丙氨酸不會(huì)對(duì)檢測(cè)帶來(lái)干擾。同時(shí)，對(duì)添加高于D-氨基酸10倍濃度的金屬銅離子，在進(jìn)行SCX小柱處理后，對(duì)檢測(cè)沒(méi)有干擾(如圖2所示)。實(shí)施例4檢測(cè)L-丙氨酸同實(shí)施例I進(jìn)行樣品前處理，除了在配制溶液②中將D-丙氨酸替換為L(zhǎng)-丙氨酸以外。同實(shí)施例2進(jìn)行L-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化L-丙氨酸(L-Ala)為過(guò)氧化氫，除了溶液
(I)中D-氨基酸氧化酶替換為L(zhǎng)-氨基酸氧化酶，溶液(2)中的D-丙氨酸替換為L(zhǎng)-丙氨酸。反應(yīng)條件不同之處在于緩沖液為IOOmM的磷酸緩沖液，pH為8. 8，酶反應(yīng)溫度為37° C。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)同實(shí)施例3。結(jié)果，采用一系列不同濃度梯度的L-丙氨酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濃度在2.0X10-4 I. OX 10_2mOl/L成線(xiàn)性關(guān)系，工作曲線(xiàn)為1=5. 27 X 104Cl_m+20. 95，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R為O. 999。以3Sb/S計(jì)算檢測(cè)限，L-丙氨酸(L-ALA)的檢測(cè)限為5. 7X 10_5mol/L。此外，對(duì)樣品L-丙氨酸中含有相同濃度的D-丙氨酸進(jìn)行了發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定，D-丙氨酸不會(huì)對(duì)檢測(cè)帶來(lái)干擾。同時(shí)，對(duì)添加高于L-氨基酸10倍濃度的金屬銅離子，在進(jìn)行SCX小柱處理后，對(duì)檢測(cè)沒(méi)有干擾。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)手性氨基酸濃度的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)在待檢樣品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶進(jìn)行酶催化反應(yīng)； 2)在步驟I)所得的反應(yīng)液中依次加入緩沖液、魯米諾、辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng); 3)測(cè)定步驟2)所得的反應(yīng)液的發(fā)光強(qiáng)度。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的酶催化反應(yīng)的反應(yīng)體系中，還包括常規(guī)的緩沖溶液，所述的反應(yīng)體系的pH值為7. 5^9. 5, D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶的濃度大于O. 01U/ml,酶催化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為2(Γ45° C，反應(yīng)時(shí)間f 15分鐘；步驟2)所述的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)體系pH值大于9. 0，魯米諾的終濃度為1.0\10-5 1.0\10_311101/1，辣根過(guò)氧化物酶為O. Γ5. OU/ml，發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)溫度為10 45° C，反應(yīng)時(shí)間為I 10分鐘。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟I)所述的酶催化反應(yīng)中，所述的氨基酸氧化酶是D-氨基酸氧化酶，所述的緩沖液為10mM，pH8. 3的磷酸緩沖液，所述的反應(yīng)溫度為25° C，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟I)所述的酶催化反應(yīng)中，所述的氨基酸氧化酶是L-氨基酸氧化酶，所述的緩沖液為lOOmM，pH8. 8的磷酸緩沖液，所述的反應(yīng)溫度為37° C，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟2)所述的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，所述的緩沖液為O. lmol/L, pHIO的磷酸緩沖液，所述的反應(yīng)體系中，魯米諾濃度為I. OX 10_4mol/L，辣根過(guò)氧化物酶濃度為O. 22、. 36U/ml，所述的發(fā)光反應(yīng)的溫度為25° C，反應(yīng)時(shí)間為f 10分鐘。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的待檢樣品在進(jìn)行步驟I)前還采用陽(yáng)離子交換固相萃取法除去樣品中的金屬離子。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的陽(yáng)離子交換固相萃取法包括將待檢樣品的pH調(diào)節(jié)為5. 0，采用常規(guī)的方法將SCX SPE小柱活化后，將樣品通過(guò)SCX SPE小柱，用4%氨水溶液洗脫,收集洗脫液,即可。
8.一種化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)手性氨基酸濃度的試劑盒，其特征在于，包括以下試劑 1)D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶； 2)魯米諾溶液； 3)辣根過(guò)氧化物酶；和 4)緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，試劑2)所述的魯米諾溶液是I.OX 10_3mol/L的魯米諾水溶液；試劑4)所述的緩沖液是lO-lOOmM，pH 8-10的磷酸緩沖液。
10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽(yáng)離子交換固相萃取柱。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)手性氨基酸濃度的方法及其試劑盒，所述方法包括以下步驟1)在待檢樣品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶進(jìn)行酶催化反應(yīng)；2)在步驟1)所得的反應(yīng)液中依次加入緩沖液、魯米諾、辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；3)測(cè)定步驟2)所得的反應(yīng)液的發(fā)光強(qiáng)度。本發(fā)明可以用于對(duì)映體中其中的一種手性氨基酸的測(cè)定。本方法不受對(duì)映體中另一種手性氨基酸的干擾，也不受常見(jiàn)金屬離子的干擾。本方法操作十分簡(jiǎn)單、且靈敏度高，可以檢測(cè)對(duì)映體中手性氨基酸的含量。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102692409SQ20121021137
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者倪志堯, 夏琨, 曹旭妮 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)