專利名稱：氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定土壤氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集速率的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤氮素循環(huán)研究，具體地說(shuō)是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定土 壤水解氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集速率的方法。
技術(shù)背景土壤氨基酸數(shù)量最早利用土壤有機(jī)氮形態(tài)分析中酸水解-蒸餾法方法測(cè)定(魯如坤，土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法，ppl52-156，中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社， 1999)，但僅能計(jì)算氨基酸總量；采用氣相色譜法可使15種氨基酸手性異 構(gòu)體有效分離并逐一定量，但其數(shù)量特征是靜態(tài)的，體現(xiàn)的是多種因素綜 合后的氨基酸的積累，無(wú)法反映氨基酸手性異構(gòu)體的動(dòng)態(tài)變化(W.Amelimg, X. Zhang. 2001. Determination of amino acid enantiomers in soils. Soil Biology & Biochemistry 33:553-562)。氣相色譜-燃燒-同位素比例質(zhì)譜可區(qū)分氨基酸 手性異構(gòu)體的天然同位素豐度變化，但同位素區(qū)分程度較小且無(wú)法調(diào)控， 不適用于土壤養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化研究，而且測(cè)定成本很高，容易對(duì)儀器產(chǎn)生 同位素污染，同時(shí)在樣品處理過(guò)程引起的同位素歧視比例偏差無(wú)法克服定 量校正 (Amelung, W" Brodowski, S., 2002. In vitro quantification of hydrolysis-induced racemization of amino acid enantiomers in environmental samples using deuterium labeling and electron-impact ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry 74, 3239-3246)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定土壤氨基酸手性異構(gòu)體同位素 比例的方法，其可有效區(qū)分土壤中原有氨基酸和利用活性底物新合成的部 分，同時(shí)可計(jì)算氨基酸的合成速率。由于底物為高豐度碳或氮同位素，新 合成的氨基酸同位素豐度相對(duì)較高，可利用通常的氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定 量分析，土壤中氨基酸手性異構(gòu)體質(zhì)譜峰及同位素峰的相對(duì)比例變化，計(jì) 算各種氨基酸手性異構(gòu)體的同位素碳、氮的富集速率。和目前應(yīng)用的同位 素比例質(zhì)譜儀測(cè)定相比，使用方便，測(cè)定成本低，重現(xiàn)性好。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定土壤氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集速率，1) 選取豐度為50%-100%的碳、氮同位素進(jìn)行穩(wěn)定同位素添加樣品培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)，一將15-氮素+葡萄糖混合物和氮素+11-130葡萄糖混合物加入土壤樣品 中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，氮素形態(tài)可為NH4+或N03-，加入量為0.05-2mgN/g土；葡萄 糖加入量為0.5-5mg C /g 土；以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤樣品做對(duì)比；2) 將土壤樣品分別利用過(guò)量的HC1水解，水解液采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 分離獲取土壤中的水解氨基酸，將提取液蒸干后，所得干燥利用五氟丙酸
酐一異丙醇酯法衍生；3) 衍生物利用氣相色譜分離、質(zhì)譜測(cè)定獲取每一種氨基酸手性異構(gòu)體 的質(zhì)譜峰面積及其同位素峰面積；4) 無(wú)論是無(wú)機(jī)15N還是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性異構(gòu)體同位 素相對(duì)豐度的變化均可用原子百分超(APE)來(lái)表示AP￡ = (Re-7 c)/[l + (Re-i c)]"OO (1)對(duì)于"N來(lái)說(shuō)，Re=A(F+b)/AF，其中A(F+b,為同位素峰面積，AF為 氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；b為待測(cè)氨基酸所含有的氨基數(shù)目， b=l-3;采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示NH/或N(V合成氨基酸氮的 速率；對(duì)于13(:來(lái)說(shuō)，Re= A(F+n)/AF，其中A(F+b)為同位素峰面積，Ap為 氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；n代表該氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原 子數(shù)，n=2-9;采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的 速率；Rc則為在同一次測(cè)定中，對(duì)比土壤樣品中相應(yīng)的同位素比例值；若待測(cè)氨基酸有多個(gè)碎片峰，將各碎片同位素比例進(jìn)行加權(quán)平均計(jì) 算后即未末氨基酸同位素比例。土壤樣品的培養(yǎng)，稱取8-12克粒徑為l-2mm風(fēng)干土于塑料瓶中，加 入P含量為8-20mg的KH2P04和適量蒸餾水，使土壤濕度為風(fēng)干土重的 20-25%;覆蓋保水透氣膜，于室溫下預(yù)培養(yǎng)7-14天，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后設(shè)置以 下三個(gè)處理部分樣品每周加入15-氮素(N) +葡萄糖混合物，另一部分樣 品每周加入氮素+U-"C-葡萄糖混合物，以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤樣 品做對(duì)比；培養(yǎng)2-14周，每周加入底物的同時(shí)，利用稱重法補(bǔ)水，保持土 壤水分恒定，將所取樣品風(fēng)干，磨細(xì)過(guò)0.25mm篩待測(cè)。所述土壤樣品分別利用過(guò)量的HC1水解，水解液采用陽(yáng)離子交換樹(shù) 脂分離獲取土壤中的水解氨基酸過(guò)程為，1) 準(zhǔn)確稱取0.5g 土壤樣品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋緊 瓶蓋，于105"C下水解12小時(shí)；水解結(jié)束并冷卻至室溫后，向水解物中加 入200pl的80^ig/ml正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)；2) 將水解物利用定量濾紙過(guò)濾，濾渣棄去，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸 發(fā)至干，操作溫度35-45"C;將蒸發(fā)瓶中殘?jiān)苡?ml 0.05 mol/1 HC1中， 將溶液轉(zhuǎn)移至陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化柱中進(jìn)行純化；純化過(guò)程如下將溶液轉(zhuǎn)移至樣品純化柱后，加入4 ml 0.01 mol/1 HC1 潤(rùn)洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，潤(rùn)洗液一并轉(zhuǎn)移至純化柱中；樹(shù)脂用0.1 mol/1草酸淋洗 以除去土壤中金屬離子；然后，向樹(shù)脂柱中先后加入5ml0.01mol/lHCl和 5ml去離子水，并將淋洗液棄去；利用25 ml 2.5 mol/1 NH3，H20洗脫氨基酸， 將各次洗脫液用干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶接收，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于30-45"C下 蒸發(fā)至干，干燥后樣品進(jìn)行下一步處理。所述氣相色譜條件為，手性毛細(xì)管柱載氣為高純氮?dú)?，柱流?補(bǔ)償氣流速^25ml/min，進(jìn)樣口溫度為200°C，分流比為40: 1;升溫程序如下 初溫80°C ，保持4分鐘，然后以40°C/min升至110°C ，保持1分鐘；以1 °C/min 升至118°C，保持3分鐘；以7°C/min升至160°C，保持2.5分鐘；以10°C/min 升至20(TC，保持20分鐘， 一次測(cè)定時(shí)間為40分鐘；所述質(zhì)譜條件為，氣相色譜質(zhì)譜接口溫度為25(TC，高純氦氣為載氣， 化學(xué)電離源溫度為180°C，電子能量為70ev;甲垸為反應(yīng)氣，流速為 1.5ml/min;信號(hào)采集設(shè)為全掃描模式，質(zhì)荷比范圍50-500。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)-本發(fā)明培養(yǎng)過(guò)程易于調(diào)控，可隨時(shí)取樣并測(cè)定土壤氨基酸手性異構(gòu)體的 動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變化情況；培養(yǎng)過(guò)程中同位素豐度的變化易于測(cè)定，沒(méi)有同位素歧 視效應(yīng)，計(jì)算方法簡(jiǎn)便；能夠跟蹤了解同位素碳、氮在氨基酸手性異異構(gòu) 體的分子中的分布，從而有效地研究土壤氨基酸手性異構(gòu)體的動(dòng)態(tài)變化， 是土壤氮素循環(huán)研究中一種非常重要的方法。


圖1為利用N+葡萄糖的對(duì)照培養(yǎng)土壤樣品中的丙氨酸質(zhì)譜圖； 圖2利用"N+葡萄糖培養(yǎng)土壤樣品中的丙氨酸質(zhì)譜圖；圖3利用N+13C葡萄糖培養(yǎng)土壤樣品中的丙氨酸質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例11. 穩(wěn)定同位素添加土壤樣品培養(yǎng)稱取8克風(fēng)干土 (<2mm)于塑料瓶中，加入KH2P04(P含量為8mg) 和適量蒸餾水，使土壤濕度為風(fēng)干土重的20%。覆蓋保水透氣膜，于室溫 下(25"C)預(yù)培養(yǎng)一周。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后設(shè)置以下兩個(gè)處理部分樣品每周加入 15N標(biāo)記氮素+葡萄糖混合物，另一部分樣品每周加入氮素+U-"C-葡萄糖混 合物。氮素形態(tài)可為NH4+或N(V，加入量為0.1mgN/g土；葡萄糖加入量 為lmgC/g土。每周加入底物的同時(shí)，利用稱重法補(bǔ)水，保持土壤水分基 本恒定。培養(yǎng)過(guò)程中保持溫度恒定。定期取樣。將所取樣品風(fēng)干，均勻取 出部分樣品(四分法)磨細(xì)過(guò)0.25!110篩待測(cè)。2. 土壤樣品前處理2.1 土壤樣品水解和純化準(zhǔn)確稱取0.5g 土壤樣品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋緊瓶蓋， 于105"C下水解12小時(shí)。水解結(jié)束并冷卻至室溫后，向水解物中加入200nl 濃度為80ng/ml的正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)。將水解物利用定量濾紙過(guò)濾，濾渣棄去，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至 干，操作溫度35-45。C。將蒸發(fā)瓶中殘?jiān)苡?ml 0.05 mo1/1 HC1中，將溶 液轉(zhuǎn)移至聚丙烯樣品純化柱中進(jìn)行純化。該柱容積為25ml (長(zhǎng)30cm，內(nèi)徑 1.2cm)，柱內(nèi)填裝3克Dowex50WX8 (100-200目)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，每
次使用前先用25ml 2 mol/1 NaOH預(yù)淋洗，然后加入25ml 2mol/lHCl，最后 用去離子水淋洗，直到淋洗液pH接近中性為止。純化過(guò)程如下將溶液轉(zhuǎn)移至樣品純化柱后，加入4ml0.01mol/lHCl 潤(rùn)洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，潤(rùn)洗液一并轉(zhuǎn)移至純化柱中。樹(shù)脂用0.1 mol/1草酸(用 濃NH3，H20調(diào)節(jié)pH至1.6-1.8)淋洗五次以除去土壤中鐵、鋁等金屬離子， 每次用量5ml。然后，向樹(shù)脂柱中先后加入5 ml 0.01 mol/1 HC1和5ml去 離子水，并將淋洗液棄去。利用25 ml 2.5 mol/1 NH3，H20洗脫氨基酸，每次用5ml，將各次洗脫液 用干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶接收，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干(30-45°C)，將干燥后樣品進(jìn)行下一步處理。 2.2樣品衍生將干燥后樣品用2ml 0.1 mol/1 HCl溶解(溶液pH須小于2，否則用lmo1/ 了 HC1調(diào)節(jié)至所需范圍)，并等體積潤(rùn)洗一次，內(nèi)容物均轉(zhuǎn)移至2ml聚丙 烯離心管中。在4200 x g條件下離心15分鐘，將上清液倒入5ml反應(yīng)瓶中， 上口覆封口膜，于乙醇浴(-18'C)中冷凍3小時(shí)以上，然后進(jìn)行8小時(shí)真空干燥。向干燥后樣品中加入400^1 4mo1/1 HCl-異丙醇溶液(將乙酰氯和異丙 醇等以體積比l: 2.5在(TC甲醇浴中混合，實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)用現(xiàn)配)，旋緊反應(yīng)瓶 瓶塞。瓶塞應(yīng)帶有聚四氟乙烯隔層，同時(shí)上面用金屬板加固。樣品溶液在 ll(TC下加熱30分鐘，冷卻至室溫后，將上清液轉(zhuǎn)移至lml反應(yīng)瓶中，用 N2將多余試劑吹干，即得到相應(yīng)氨基酸異丙醇酯。然后向瓶中加入130nl 二氯甲垸和130pl五氟丙酸酐，在ll(TC下加熱10分鐘。冷卻至室溫后， 用N2將多余試劑吹干，將干燥后的五氟丙酸氨基酸異丙醇酯溶于150pl 二 氯甲垸，震蕩并平衡半小時(shí)后將上清液移至色譜內(nèi)插管瓶中即可利用氣相 色譜測(cè)定。以上土壤樣品前處理?xiàng)l件引自參考文獻(xiàn)W. Amelung, X. Zhang. 2001. Determination of amino acid enantiomers in soils. Soil Biology & Biochemistry 33:553-562.3. 土壤氨基酸手性異構(gòu)體氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定 3.1氣相色譜條件手性毛細(xì)管柱30m*0.25mm*0.12nm，載氣為高純氮?dú)?，柱流?補(bǔ) 償氣流速25ml/min，進(jìn)樣口溫度為200°C，分流比為40: 1。升溫程序如 下初溫8(TC，保持4分鐘，然后以40。C/min升至110°C，保持1分鐘； 以rC/min升至118°C，保持3分鐘；以7°C/min升至160°C，保持2.5分鐘； 以10。C/min升至20(TC，保持20分鐘， 一次測(cè)定時(shí)間為40分鐘。3.2質(zhì)譜條件氣相色譜質(zhì)譜接口溫度為250°C，高純氦氣(He)為載氣?；瘜W(xué)電離 源(CI)溫度為180°C，電子能量為70ev;甲烷(CH4)為反應(yīng)氣，流速為1.5ml/min;信號(hào)采集設(shè)為全掃描模式，質(zhì)荷比范圍50-500。 4.同位素富集比例評(píng)價(jià)與計(jì)算 4.1氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集評(píng)價(jià)方法如圖l-3所示，對(duì)于利用N+葡萄糖培養(yǎng)的對(duì)照樣品來(lái)說(shuō)，其質(zhì)譜碎片 主要表明12C、 14N等所形成的離子結(jié)構(gòu)特征，在主要碎片峰區(qū)域的小峰的 相對(duì)豐度(小峰面積占母峰面積的比例)主要由13C、 "N等的天然豐度和 儀器自身背景值所決定，因而具有很好的穩(wěn)定性，數(shù)值相對(duì)較小。當(dāng)土壤樣品中加入的無(wú)機(jī)15N被同化利用合成氨基酸手性異構(gòu)體后， 新合成的氨基酸的氨基位含有15N，而土壤中原有的氨基酸氨基位則為14N (比例占99%以上)。由于中性和酸性氨基酸只含有一個(gè)氨基，對(duì)于碎片峰 F來(lái)說(shuō)，在相鄰的位置上(F+l)的豐度就會(huì)有所增加；堿性氨基酸含有兩 個(gè)或兩個(gè)以上的氨基，對(duì)于碎片峰F來(lái)說(shuō)，(F+b)的豐度有所增加，b代 表氨基酸所含有的氨基數(shù)目。因而同位素氮合成氨基酸氮的速率可以用 (F+b) /F的相對(duì)豐度比例的變化來(lái)評(píng)價(jià)，b=l-3。當(dāng)土壤樣品中加入U(xiǎn)"C-葡萄糖+氮素時(shí)，新合成的氨基酸的碳骨架全 部由13<:組成。對(duì)于碎片峰F來(lái)說(shuō)，(F+n)的豐度就會(huì)有所增加，n代表該 氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子數(shù)，(F+n)與F豐度的比值變化用以評(píng) 價(jià)利用葡萄糖合成氨基酸碳的速率，n=2-9。4.2氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集計(jì)算方法無(wú)論是無(wú)機(jī)15N還是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性異構(gòu)體同位 素相對(duì)豐度的變化均可用原子百分超(APE)來(lái)表示APE= (Re-Rc) /[1+ (Re-Rc) ]*100 (1) 對(duì)于15N富集比例的計(jì)算來(lái)說(shuō)，Re=A (F+b) /AF，其中A (F+b,為同位素 峰面積，AF為氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；b為待測(cè)氨基酸所含有的 氨基數(shù)目，b=l-3; Rc為在同一次測(cè)定中，對(duì)比土壤樣品中相應(yīng)的同位素比 例值；采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示NH/或MV合成氨基酸氮的 速率-，對(duì)于13(:來(lái)說(shuō)，Re= A(F+n,/AF，其中A(F^為同位素峰面積，Ap為 氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；n代表該氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原 子數(shù)，n=2-9; Rc為在同一次測(cè)定中，對(duì)比土壤樣品中相應(yīng)的同位素比例值； 采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；若待測(cè)氨基酸有多個(gè)碎片峰，將各碎片同位素比例進(jìn)行加權(quán)平均計(jì) 算后即為氨基酸同位素比例。采用上述方法將取自公主嶺的黑土培養(yǎng)4周后，稱取0.5克樣品經(jīng)水 解、純化、衍生后利用氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。在針對(duì)L-丙氨酸(含有l(wèi)個(gè)N 原子和3個(gè)碳原子)的同位素富集速率進(jìn)行計(jì)算時(shí)，步驟如下在對(duì)比土壤樣品中，質(zhì)荷比(m/z)為190 (F)的碎片所對(duì)應(yīng)的峰面
積為9987，質(zhì)譜峰191所對(duì)應(yīng)的峰面積為1020，其他小峰因面積極小可 當(dāng)作零處理。貝U Rc (F+l) 190=1020/9987=0.10，其他則為零。同理，m/z 為236的碎片所對(duì)應(yīng)的峰面積為19906，質(zhì)譜峰237所對(duì)應(yīng)的峰面積為 2005，則Rc (F+l) 236=2005/19906=0.10。對(duì)于己富集了 15N的丙氨酸來(lái)說(shuō)，質(zhì)荷比為190 (F)的碎片所對(duì)應(yīng) 的峰面積仍約為9987，但質(zhì)譜峰191所對(duì)應(yīng)的峰面積增加為3050，則Re (F+l) =3050/9987=0.31，根據(jù)公式(1)，則APE (15N) 190= (0.31-0.10) /[1+(0.31-0.10)]*100=17.36;同理，m/z為236的碎片所對(duì)應(yīng)的峰面積仍為 19906，但同位素峰237面積增加至6105，根據(jù)公式(l)，可計(jì)算APE("N) 236=16.38;由于m/z 236豐度與m/z 190豐度比為19906/9987=2，則可得 APE (15N) =17.36*1/3+16.38*2/3=16.71。利用15N合成氨基酸氮的速率為 =16.71/4=4.18原子百分超/周對(duì)于已富集了 13C的丙氨酸來(lái)說(shuō)，質(zhì)荷比為190 (F)的碎片所對(duì)應(yīng) 的峰面積仍約為9987，由于該碎片含有2個(gè)骨架碳原子，m/zl92所對(duì)應(yīng) 的峰面積增加到2680，則Re (F+2) =2680/9987=0.27，根據(jù)公式(1)，利用葡萄糖合成氨基酸碳的比例是APE ( 13C ) 19Q= ( 0.27-0 ) /[1+(0.27-0)]*100=21.16;同理，同理，m/z為236的碎片所對(duì)應(yīng)的峰面積為 19906，由于該碎片含有3個(gè)骨架碳原子，質(zhì)譜峰239對(duì)應(yīng)的峰面積為5275， 貝U Re ( F+3 ) =5275/19906=0.26 ， APE ( 13C ) 236= ( 0.26-0 ) /[1+(0.26-0)]* 100=20.94 ，加權(quán)平均后，APE( 13C ) =21.16*1/3+20.94*2/3=21.05。利用13C合成氨基酸碳的速率=21.05/4=5.26 原子百分超/周。
權(quán)利要求
1. 氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定土壤氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集速率，其特征在于1)選取豐度為50％-100％的碳、氮同位素進(jìn)行穩(wěn)定同位素添加樣品培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將15-氮素+葡萄糖混合物和氮素+U-13C-葡萄糖混合物加入土壤樣品中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，氮素形態(tài)可為NH4+或NO3-，加入量為0.05-2mg N/g土；葡萄糖加入量為0.5-5mg C/g土；以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤樣品做對(duì)比；2)將土壤樣品分別利用過(guò)量的HCl水解，水解液采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離獲取土壤中的水解氨基酸，將提取液蒸干后，所得干燥利用五氟丙酸酐-異丙醇酯法衍生；3)衍生物利用氣相色譜分離、質(zhì)譜測(cè)定獲取每一種氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積及其同位素峰面積；4)無(wú)論是無(wú)機(jī)15N還是葡萄糖13C加入所引起的氨基酸手性異構(gòu)體同位素相對(duì)豐度的變化均可用原子百分超(APE)來(lái)表示APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100(1)對(duì)于15N來(lái)說(shuō)，Re＝A(F+b)/AF，其中A(F+b)為同位素峰面積，AF為氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；b為待測(cè)氨基酸所含有的氨基數(shù)目，b＝1-3；采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示NH4+或NO3-合成氨基酸氮的速率；對(duì)于13C來(lái)說(shuō)，Re＝A(F+n)/AF，其中A(F+b)為同位素峰面積，AF為氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積；n代表該氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子數(shù)，n＝2-9；采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；Rc則為在同一次測(cè)定中，對(duì)比土壤樣品中相應(yīng)的同位素比例值；若待測(cè)氨基酸有多個(gè)碎片峰，將各碎片同位素比例進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)算后即未末氨基酸同位素比例。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于土壤樣品的培養(yǎng)，稱取8-12克粒徑為l-2mm風(fēng)干土于塑料瓶中，加入P含量為8-20mg的 KH2P04和適量蒸餾水，使土壤濕度為風(fēng)干土重的20-25%;覆蓋保水透氣 膜，于室溫下預(yù)培養(yǎng)7-14天，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后設(shè)置以下三個(gè)處理部分樣品 每周加入15-氮素(N) +葡萄糖混合物，另一部分樣品每周加入氮素+11-130 葡萄糖混合物，以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤樣品做對(duì)比；培養(yǎng)2-14 周，每周加入底物的同時(shí)，利用稱重法補(bǔ)水，保持土壤水分恒定，將所取 樣品風(fēng)干，磨細(xì)過(guò)0.25mm篩待測(cè)。
3. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于 所述土壤樣品分別利用過(guò)量的HC1水解，水解液采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離獲取土壤中的水解氨基酸過(guò)程為，1 )準(zhǔn)確稱取0.5g 土壤樣品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋緊瓶蓋，于105"C下水解12小時(shí)；水，結(jié)束并冷卻至室溫后，向水解物中加入200W的80pg/ml正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)；2)將水解物利用定量濾紙過(guò)濾，濾渣棄去，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸 發(fā)至干，操作溫度35-45i:;將蒸發(fā)瓶中殘?jiān)苡?ml0.05mol/lHCl中， 將溶液轉(zhuǎn)移至陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化柱中進(jìn)行純化；純化過(guò)程如下將溶液轉(zhuǎn)移至樣品純化柱后，加入4 ml 0.01 mol/1 HC1 潤(rùn)洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，潤(rùn)洗液一并轉(zhuǎn)移至純化柱中；樹(shù)脂用0.1 mol/1草酸淋洗 以除去土壤中金屬離子；然后，向樹(shù)脂柱中先后加入5ml0.01mol/lHCl和 5ml去離子水，并將淋洗液棄去；利用25 ml 2.5 mol/1 NH3fl20洗脫氨基酸， 將各次洗脫液用干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶接收，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于30-45"C下 蒸發(fā)至干，干燥后樣品進(jìn)行下一步處理。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于 所述氣相色譜條件為，手性毛細(xì)管柱載氣為高純氮?dú)?，柱流?補(bǔ)償氣 流速25ml/min，進(jìn)樣口溫度為200°C，分流比為40: 1;升溫程序如下 初溫80°C ，保持4分鐘，然后以40°C/min升至110°C ，保持1分鐘；以1 °C/min 升至118°C，保持3分鐘；以7°C/min升至160°C，保持2.5分鐘；以10°C/min 升至20(TC，保持20分鐘， 一次測(cè)定時(shí)間為40分鐘；所述質(zhì)譜條件為，氣相色譜質(zhì)譜接口溫度為250。C，高純氦氣為載氣， 化學(xué)電離源溫度為180°C，電子能量為70ev;甲烷為反應(yīng)氣，流速為 1.5ml/min;信號(hào)采集設(shè)為全掃描模式，質(zhì)荷比范圍50-500。
全文摘要
本發(fā)明涉及土壤氮素循環(huán)，具體地說(shuō)是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定土壤水解氨基酸手性異構(gòu)體同位素富集速率的方法，1)選取同位素豐度為50％-100％的碳、氮化合物進(jìn)行穩(wěn)定同位素添加樣品培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；2)將土壤樣品分別利用過(guò)量的HCl水解，水解液采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離獲取土壤中的水解氨基酸，將提取液蒸干后，干燥的樣品利用五氟丙酸酐—異丙醇酯法衍生；3)衍生物利用氣相色譜分離、質(zhì)譜測(cè)定獲取每一種氨基酸手性異構(gòu)體的質(zhì)譜峰面積及其同位素峰面積；4)無(wú)論是無(wú)機(jī)¹⁵N還是葡萄糖¹³C加入所引起的氨基酸手性異構(gòu)體同位素相對(duì)豐度的變化均可用APE來(lái)表示采用APE和培養(yǎng)時(shí)間的比值即可表示NH₄⁺或NO₃^-合成氨基酸氮及葡萄糖合成氨基酸碳的速率。
文檔編號(hào)G01N30/02GK101210908SQ20061015581
公開(kāi)日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者何紅波, 張旭東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所