一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及手性苯丙氨酸(L-苯丙氨酸），尤其是涉及一種海洋菌株催化不對稱還 原制備手性苯丙氨酸的方法。
【背景技術】
[0002] 手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性藥物、手性農(nóng)藥和手性 食品添加劑等精細化工品的關鍵中間體。許多新藥(如蛋白酶抑制劑類、抗艾滋病藥等）的 制備需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而眾多手性氨基酸的合成離不開氧化還原酶 的催化，因此尋找高選擇性的氧化還原酶成為手性氨基酸研究的熱點。
[0003] 苯丙氨酸主要用作試劑及醫(yī)藥上的胃腸外營養(yǎng)輸液，亦見用作特殊人員合成膳 食、必需氨基酸片等營養(yǎng)強化劑的成分。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌藥物的中間體和良好 載體，通過L-苯丙氨酸可以把抗腫瘤藥物載入腫瘤所在的部位，不但可以抑制腫瘤生長，而 且又可降低腫瘤藥物的毒性。隨著甜味劑二肽阿斯巴甜(APM)投放市場，L-苯丙氨酸作為它 的主要原料，需求量急劇增加 （Gerigk MR，Maass D，Kreutzer A，et al .Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production with recombinant Escherichia coli by fully integrated reactive extraction[J].Bioprocess Biosyst Eng，2002,25:43-52)』-苯丙氨酸營養(yǎng)價值雖小，但具有出色的鎮(zhèn)疼作用。臨床實驗已表明，對一批長期用各 種療法無效的肌肉疼、關節(jié)疼、腰腿疼患者療效顯著，并且無明顯副作用。
[0004] 苯丙氨酸在人體內(nèi)不能合成，必須由外界供給，因此研究其合成方法很有必要。苯 丙氨酸的制備方法通常有兩種，即化學合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W合成法的收率較低;需 使用劇毒的氰化物，污染環(huán)境;副反應較多；工藝路線長等缺點。而微生物發(fā)酵法具有環(huán)境 友好，節(jié)能綠色等優(yōu)點，缺點是發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，生產(chǎn)周期長，工藝管理要求嚴格。全細胞催 化苯丙酮酸不對稱還原胺化獲得手性苯丙氨酸，具有反應路線簡潔，易實現(xiàn)輔酶再生等優(yōu) 點。1984年，Humme等人（Wemer Humme，Norbert Weiss · Isolation and characterization of a bacteria possessing L-phenylalanine dehydrogenase activity[J]Arch Michobiol，1984,137 :47_52)首次報道具有苯丙氨酸脫氫酶的短桿菌(1^6￥；^3(^61'；[11111 sp.)，通過與甲酸脫氫酶反應體系相偶聯(lián)，使輔酶NADH得以再生，使得在同一個生物反應器 中連續(xù)轉化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸。因此，篩選含有催化不對稱還原胺化高活性高選擇 性的苯丙氨酸脫氫酶的菌株是實現(xiàn)手性苯丙氨酸有效制備的關鍵。來源于海洋微生物的氧 化還原酶具有一些陸地酶所不具有的特性，如廣泛的底物譜、耐鹽性、耐有機溶劑等特性， 使得其受到更多的關注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法。
[0006] 所述海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)細胞液制備:將菌種接入2216L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得發(fā)酵液，離心獲得細胞，用緩沖 液重懸、洗滌，配制成細胞液；所述菌種為南海芽孢桿菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15八2，所述南海芽抱桿菌(1^(3；[11118 11&11]1&丨6118丨8)03?-15六2已于2014年03月25日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 8969， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101;
[0008] 在步驟1)中，所述菌種接入的量按質(zhì)量百分比可為2216L培養(yǎng)基的1%;所述2216L 培養(yǎng)基的組成可為：1~15. Og/L蛋白胨，1~10.0 g/L酵母粉，0.1~lg/L牛肉膏，0.1~2g/L 檸檬酸鈉，0.1~lg/L NH4N〇3,0.1~2g/L乙酸鈉，用海水配制至1L;所述培養(yǎng)的條件可為:起 始pH6.5~8.0，裝液量體積分數(shù)為5 %~15 %，培養(yǎng)溫度20~40 °C，搖床轉速150~250rpm， 培養(yǎng)時間12~48h;所述離心的條件可為:在冷凍離心機中，4°C，8000rpm，離心15min;所述 緩沖液可采用濃度0.01~〇.2mol/L，pH為7~13的Tris-鹽酸、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鉀等中 至少一種，優(yōu)選pH 8的Tris-鹽酸緩沖液;所述重懸的條件可為棄上清液，沉淀用Tris-鹽酸 緩沖液重懸，pH 6.5~8.0;所述洗滌可重復操作3次;所述細胞液的質(zhì)量濃度可為0.025~ 100g/L〇
[0009] 2)全細胞催化反應:在步驟1)得到的細胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供體作為底 物，再加入輔助底物用于輔酶循環(huán)再生，反應后得到含有產(chǎn)物L-苯丙氨酸的反應液；
[0010] 在步驟2)中，所述氨基供體可選自丙氨酸、氨水、NH4C1、NH4N03、甲酸銨等中的一 種，優(yōu)選氨水或NH 4C1;所述輔助底物可選自葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、異丙醇等中的至少 一種，優(yōu)選葡萄糖和甘油中的至少一種；所述反應的條件可為pH 7~13,反應溫度20~50 °C，震蕩速率100~300rpm，反應時間30~180h。
[0011] 3)分離與檢測：將步驟2)得到的含有產(chǎn)物L-苯丙氨酸的反應液離心去除沉淀，上 清液加入等量的甲醇，震蕩混合均勻，離心去除沉淀(蛋白質(zhì)），上清液稀釋后進行測定，苯 丙酮酸的濃度用高效液相色譜檢測，產(chǎn)物L-苯丙氨酸的濃度和對映體過量值用高效液相色 譜測定。
[0012] 在步驟3)中，所述高效液相色譜測定，色譜柱為手性柱Chirex 3126柱，檢測波長 254nm，檢測條件為:流動性為含有2mM的CuS〇4的95/5的水/異丙醇溶液;流速為lml/min;柱 溫為35°C。
[0013] 本發(fā)明所述菌株全細胞催化苯丙酮酸制備L-苯丙氨酸，是利用全細胞中苯丙氨酸 脫氫酶的高度對映體選擇性，催化苯丙酮酸的不對稱還原胺化，獲得L-苯丙氨酸，葡萄糖等 輔助底物加入用于輔酶NADH的循環(huán)再生。其以葡萄糖為輔助底物的化學反應式如下：
[0014]
[0015] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0016] 本發(fā)明從海洋微生物篩選獲得含有依賴NADH的苯丙氨酸脫氫酶的不同以往報道 的新菌株。本發(fā)明還考察了氨基供體、反應緩沖液、PH、溫度等影響，優(yōu)化了該菌株全細胞催 化苯丙酮酸不對稱還原胺化制備L-苯丙氨酸的反應體系和反應條件。
[0017] 所獲產(chǎn)物手性苯丙氨酸的光學純度達到90%以上，收率達45%以上。本發(fā)明操作 方便，具有產(chǎn)品光學純度高、收率高，設備簡單等優(yōu)點，在生物催化制備手性苯丙氨酸領域 具有較好的工業(yè)應用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為苯丙酮酸的色譜分析圖。
[0019] 圖2為產(chǎn)物L-苯丙氨酸的手性色譜分析圖。
[0020] 圖3為L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸的手性色譜分析圖。
【具體實施方式】
[0021 ]下面通過實施例對本發(fā)明做詳細說明 [0022] 實施例1
[0023] (1)南海芽孢桿菌(Bacillus nanhaiensis)DSF_15A2的培養(yǎng)：以1%的接種量，將 菌種接入500mL 2216L培養(yǎng)基中。2216L培養(yǎng)基的組成為10 . Og/Ι蛋白胨，5 . Og/L酵母粉， 〇. 5g/L牛肉膏，0.5g/L檸檬酸鈉，0.2g/L NH4N03，1. Og/L NaAc，用海水配置。培養(yǎng)條件為:起 始pH 7.0,裝液量體積分數(shù)為10%，培養(yǎng)溫度25°C，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)時間24h。
[0024]細胞的制備:培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4°C，8000rpm，15min) 獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次 獲得細胞。
[0025] (2)全細胞催化反應:反應體系為0 · lmol/L苯丙酮酸，lmol/L NH4CI，lmol/L甘油， 0.01mol/L的Tris-鹽酸緩沖液，pH 9.0，100g/L的細胞，反應體積50mL，在30°C反應溫度下， 1 OOrpm震蕩反應反應時間48h。
[0026] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產(chǎn)物苯丙氨酸的收率為 79.6%，e.e.值為99.9%