專利名稱：人膜聯(lián)蛋白v變體及其表達、制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種膜聯(lián)蛋白V變體和所述膜聯(lián)蛋白V變體的試劑制備和藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)屬于膜聯(lián)蛋白家族,此家族是一組進化上高度保守的、具有Ca2+和磷脂結(jié)合特性的蛋白質(zhì)。它們在結(jié)構(gòu)上具有同源性，被認為是Ca2+調(diào)節(jié)的膜結(jié)合組件。膜聯(lián)蛋白家族功能上的相同點在于在Ca2+存在時，對酸性磷脂分子有高親合力。人們在高等和低等真核生物中都發(fā)現(xiàn)存在有膜聯(lián)蛋白家族的成員。膜聯(lián)蛋白成員存在于很多不同的細胞類型中，它們的生化作用與免疫性質(zhì)密切相關(guān)，參與抗凝、抗炎癥過程，特別是細胞復(fù)制、分化及胞吐過程(Iwasaki A, Suda M, Nakao H, et al. Biochem, 1987,10 1261 ；Pollard H B，Haigler HT. Biol Chem, 1990,265 :21207)。該家族成員的生物學(xué)功能還待進一步的研究。盡管人們對成員的體內(nèi)功能仍不甚了解，但普遍認為膜聯(lián)蛋白與磷脂結(jié)合的活性是膜聯(lián)蛋白家族體外活性的基礎(chǔ)，并且與它們的生理性質(zhì)緊密相關(guān)。目前，膜聯(lián)蛋白V的應(yīng)用主要集中在凋亡的檢測。細胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細胞死亡(Programmed Cell Death, P⑶)，是細胞生命周期中的重要組成部分,是不同于壞死和意外死亡的由基因調(diào)控的細胞主動性死亡過程(Cohen JJ, Immunol Today, 1993,14(3) :126-130)。細胞凋亡是生物體調(diào)節(jié)和維持機體相對平衡的重要方式，它也與多種疾病病理過程密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及放化療、腦和心肌細胞缺血再灌注損傷和器官移植中的排斥反應(yīng)等過程中，均可發(fā)現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象及其變化。細胞凋亡是細胞主動參與的自身程序性死亡過程，涉及一系列生物分子及細胞形態(tài)學(xué)的改變，當細胞發(fā)生凋亡時，磷脂酰絲氨酸(PS)會發(fā)生翻轉(zhuǎn)而暴露在細胞膜外面(Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA,Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. J Immunol, 1992,148(7) :2207-2216)，是細胞凋亡早期事件，發(fā)生在凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變之前(Narula J, Strauss HW, 2003, J Nucl Med, 44 (3)397-399)，也是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的初始事件，作為凋亡細胞被吞噬細胞識別的標志，從而進一步引起胞漿的皺縮、染色質(zhì)的濃集及核內(nèi)DNA降解等。因此，外翻的PS是目前研究最多并最有希望和應(yīng)用前景的凋亡檢測靶點，可早期檢測凋亡，具有較高的時效性(Bold RJ,Termuhlen PM, McConkey DJ, Surg Oncol, 1997,6(3) : 133-142)，國內(nèi)外常利用同 PS 特異性結(jié)合的藥物來檢測細胞凋亡。由于對PS 具有特異的親和性(Meers P, Mealy T. Biochemistry, 1993, 32 (43)11711-11721)，膜聯(lián)蛋白V可以特異性地結(jié)合到正處于凋亡過程中的細胞表面，這樣，膜聯(lián)蛋白V可以用熒光蛋白或者放射性物質(zhì)標記后用于凋亡細胞的檢測。這種方法被廣泛的應(yīng)用于細胞分子生物學(xué)以及免疫學(xué)研究(Koopman G, Reutelingsperger C,Kuijten GA, et al. Blood,1994,84(5) :1415-1420 ；Vermes I, Haanen C, SteVens-NakkenH，et al. J Immunol Methods, 1995，184 (I) :39-510 ;Zhang G, Gurtu V, Kain SR, etal. Biotechniques,1997,23 (3) :525-531 ；Vriens Pff, Blankenberg FG, Stoot JH, etal.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,116(5) :844-853 ；Boldt A, Barten MJ, Weiss C, etal. Cytometry A，2006，69 (3) :158-160)。將膜聯(lián)蛋白 V 進行熒光素(如 FITC，PE 等)或生物素標記作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢查細胞凋亡現(xiàn)象，是一種靈敏、高效、成熟的實驗室檢測方法。但是對于臨床標本，除血液外，需要進行組織活檢，具有創(chuàng)傷性，且在操作過程中也易引起凋亡的發(fā)生，從而影響分析結(jié)果。因此體內(nèi)檢測細胞凋亡需要探索新的方法。例如，用放射性核素標記膜聯(lián)蛋白V行體內(nèi)凋亡顯像，實現(xiàn)細胞凋亡的活體無創(chuàng)顯像，以實時監(jiān)測體內(nèi)凋亡的發(fā)生，這一類的凋亡顯像在監(jiān)測活體細胞凋亡的領(lǐng)域取得了較大進展。目前，放射性物質(zhì)標記的重組膜聯(lián)蛋白V在缺血性損傷的評估、異體移植排斥反應(yīng)以及化療藥物對腫瘤治療效果的評價等方面的應(yīng)用正處于臨床試驗階段(WatanabeH, Murata Y, Miura M, et al. Nucl Med Commun,2006,27(I) :81-89 ；Blankenberg FG,Kalinyak J, Liu L, et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006,14 :1-9)。放射性碘(*1)標記蛋白多肽類，雖然方法簡便、成熟，可以保留其原有的生物活性，但適合體內(nèi)顯像的1231和1241供應(yīng)比較困難。目前，以99mTc標記膜聯(lián)蛋白V報道最多，99mTc的優(yōu)點在于半衰期為6小時，可以及時顯像，又使病人受的劑量較小，而且可以由Mo/Tc發(fā)生器方便的獲得。然而，99mTc直接標記膜聯(lián)蛋白V比較困難，標記率低，且在標記過程中會產(chǎn)生一些變性蛋白影響其在體內(nèi)的放射性分布(Takei T, Kuge Y，Zhao S，et al. J Nucl Med，2004，45 (12)2083-2087)。因此，膜聯(lián)蛋白V的99mTc標記以間接標記為主，常用的雙功能鰲合劑有N-I-亞氨基-4-疏基丁基(Imino) (Kemerink GJ, Liem IH, Hofstra L, et al. J Nucl Med,2001,42(2) :382-387)、乙二胺半胱氨酸(EC) (Yang DJ, Azhdarinia A, Wu P，et al. CancerBiother Radiopharm, 2001,16(1) :73_83)、二硫二氮(N2S2、又稱 BTAP) (Kemerink GJ,Boersma HH, Thimister Pff, et al. Eur J Nucl Med, 2001，28 (9) :1373-1378)等，以肼基煙酰胺(HYNIC)最為多見，并已在臨床試用(Penn DL, Kim C，Zhang K，et al. Nucl MedBiol,37(1) :29-34 ；Rottey S,Siegers G,Van Belle S，et al. J Nucl Med,2006，47(11)1813-1818 ；Kartachova M, Haas RL, Olmos RA, et al.Radiother Oncol,2004,72(3)333-339 ；Kemerink GJ, Liu X, Kieffer D，et al.J Nucl Med,2003，44(6) :947-952)。利用不同雙功能鰲合劑制備的標記物在體內(nèi)的生物行為有較大差異，以Imino結(jié)合99mTc制備的標記物在肝、腎和脾有較高攝取，且在體內(nèi)的生物半衰期比較長；以N2S2 (BTAP)制備的標記物在肝、腎、脾及下腹均有較高的攝??；以HYNIC制備的標記物雖然不經(jīng)腸道排泄，而是經(jīng)腎臟代謝，在腎臟和肝臟有較高放射性攝取，且其在體內(nèi)生物半衰期較長(BoersmaHH, Kietselaer BL, Stolk LM, et al. J Nucl Med, 2005,46 (12) :2035-2050)。另外，這些間接標記方法復(fù)雜、產(chǎn)物需純化，不易制成藥盒，臨床使用受到一定限制。最近的研究揭示膜聯(lián)蛋白V在基因重組表達中經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后可有利于用99mTc直接進行標記。如張麗娜等人在膜聯(lián)蛋白V蛋白質(zhì)的N-端添加了 10個組氨酸(ZhangLN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology,2000,30 (4)305-312)。添加了 10個組氨酸的膜聯(lián)蛋白V蛋白質(zhì)獲得了很好的表達、并且具有較好的體內(nèi)外檢測細胞凋亡的活性(Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry andBiotechnology,2000,30(4) :305-312 ;Ye F，F(xiàn)ang W，Wang F，et al. Nuclear Medicineand Biology, doi 10. 1016/j. nucmedbio. 2010. 11. 002 ;鄭玉民,王自正，顏J玉等，中華核醫(yī)學(xué)雜志，2008，28 (6) =378-382 ;宋麗萍，華子春，張欣等，中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志，2010，21 (1) :53-55 ;宋麗萍，華子春，張欣等，中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志，2010，21 (5) :358-360)。Tait JF等在N-端添加了 7個氨基酸，其中含1-2個半胱氨酸殘基，得到的三種突變體，分別命名為膜聯(lián)蛋白V-116，膜聯(lián)蛋白V-117和膜聯(lián)蛋白V-118 (Tait JF, Brown DSjGibsonDF,et al. Bioconjug Chem,2000,11(6) :918-925 ;Tait JF,Smith C，GibsonDF,BioconjugChem,2002,13(5) :1119-1123)，它們與膜的結(jié)合活性跟天然膜聯(lián)蛋白V相一致，并且與99mTc-HYNIC-膜聯(lián)蛋白V有比較相似的生物分布(Tai JF，Brown BS, United StatesPatent US7, 204, 972 B2)。三種膜聯(lián)蛋白V變體都可在大腸桿菌細胞質(zhì)中表達并被分離純化，產(chǎn)物得率為 10mg/L(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, et al. Bioconjug Chem, 2000,11(6) :918-925 ；Tait JF，Smith C, Gibson DF,Bioconjug Chem,2002,13(5) :1119-1123;Tai JF, Brown BS, United States Patent US7, 204, 972 B2)。但是，重組膜聯(lián)蛋白 V 在應(yīng)用上存在著如下問題I.目前放射性物質(zhì)標記的重組膜聯(lián)蛋白V存在著標記效率低的缺點。同時，由于標記率低，且在標記過程中會產(chǎn)生一些變性蛋白，從而影響膜聯(lián)蛋白V在體內(nèi)的放射性分布。臨床實驗也發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白V主要分布于腎臟、肝臟以及脾臟(Rottey S，Van den Bossche B,Siegers G,Van Belle S,van de Wiele C,Q.J.Nucl. Med. Mol. Imaging, 2009,53(2) :127-32)。2.重組膜聯(lián)蛋白V的生產(chǎn)方式產(chǎn)量偏低，不符合實際應(yīng)用的需用。由于重組膜聯(lián)蛋白V在大腸桿菌表達時經(jīng)常以包涵體形式存在，為此國外有學(xué)者探索用酵母表達重組膜聯(lián)蛋白V來解決其在大腸桿菌中表達易形成包涵體的難題。即使國際膜聯(lián)蛋白V研究權(quán)威、美國Tait JF教授課題組在最新的研究工作及專利中在大腸桿菌表達并純化了三種N-端增加了 7個氨基酸的重組膜聯(lián)蛋白V變體，其產(chǎn)率也僅為10mg/L，未能滿足實際應(yīng)用的需求。其純化過程包括超聲破碎、細胞膜吸附和解離、Mono Q離子交換層析(洗脫溶液濃度0. 22M NaCl)、超濾和透析。而本專利發(fā)明人在10年前的前期研究中構(gòu)建了一個添加了 10個組氨酸的膜聯(lián)蛋白V，其標記效率顯著提高、且標記方法簡易，但其終產(chǎn)率僅為 7. 4mg/L(Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology,2000,30(4) :305-312),表達水平與得率與美國Tait JF教授課題組最近構(gòu)建的三種N-端增加了 7個氨基酸的重組膜聯(lián)蛋白V變體的產(chǎn)率相近，從而顯示出重組膜聯(lián)蛋白V的生產(chǎn)存在著嚴重的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
為克服目前膜聯(lián)蛋白V蛋白及其變體存在的生產(chǎn)及標記兩方面的難題，本發(fā)明的目的在于提供一種膜聯(lián)蛋白V變體及其高水平地、大量生產(chǎn)的制備方法，及其在制備體內(nèi)外細胞凋亡檢測的探針或診斷藥物上的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種膜聯(lián)蛋白V變體，是具有序列表中序列I氨基酸殘疾序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列I中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與序列I的氨基酸殘基序列相同活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。上述的膜聯(lián)蛋白V變體，是在膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽為1-25氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成，并含有1-3個半胱氨酸。上述的膜聯(lián)蛋白V變體可以為在膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一個半胱氨酸。上述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，按如下步驟進行a.利用計算機輔助分子設(shè)計，在膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加氨基酸序列進行分子模建和設(shè)計；b.設(shè)計膜聯(lián)蛋白V蛋白編碼序列的引物對，以本實驗室保持的人膜聯(lián)蛋白V基因為模板進行PCR擴增；c. PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO上進行培養(yǎng);
d.用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET28a，將得到的兩種目的基因片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質(zhì)粒；e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種；f.將步驟e獲得的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化后的蛋白。上述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，所述引物對的核苷酸序列為上游引物5’_gttcca tgg gcg cac agg ttc tea gag gca_3’ ；下游引物5，-tcc get cga gtt age agt cat ctt ctc cac aga gca_3，。上述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，所述的步驟g中純化的步驟依次為沉淀解吸附、硫酸銨分級沉淀、Super Q-650M層析和SP層析。上述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的制備方法為進行熒光化學(xué)標記或者核素標記。上述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的應(yīng)用為在制備細胞凋亡監(jiān)測試劑、疾病監(jiān)測藥物中的應(yīng)用。制備方法包括利用計算機輔助分子設(shè)計、構(gòu)建膜聯(lián)蛋白V變體，在膜聯(lián)蛋白V的C-端添加含有一個或一個以上半胱氨酸的1-25個氨基酸殘基短肽；設(shè)計的膜聯(lián)蛋白V變體的基因的獲取；構(gòu)建重組質(zhì)粒；相應(yīng)的重組基因工程表達；以及膜聯(lián)蛋白V變體的分離純化獲取步驟。其中膜聯(lián)蛋白V變體的產(chǎn)率遠遠高于目前已報道的膜聯(lián)蛋白V及其變體的產(chǎn)率。本發(fā)明公開的膜聯(lián)蛋白V變體在制備體內(nèi)外細胞凋亡檢測的探針或診斷藥物上的應(yīng)用通過以下技術(shù)解決措施來進一步實現(xiàn)將獲取得到的膜聯(lián)蛋白V變體，方便地進行熒光化學(xué)標記或者核素標記，從而應(yīng)用于體內(nèi)外細胞凋亡檢測的探針或診斷藥物的制備中。在膜聯(lián)蛋白V變體計算機輔助分子設(shè)計中，我們利用對膜聯(lián)蛋白V變體進行了結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計，在膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加氨基酸進行分子模建和分子設(shè)計，確定C-末端能夠添加的氨基酸長度。在膜聯(lián)蛋白V的C-末端加入半胱氨酸殘基的目的是利用半胱氨酸殘基易于參與偶聯(lián)反應(yīng)、具有對金屬離子的親和性等特點，提高重組膜聯(lián)蛋白V的標記效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在計算機分子設(shè)計時計算的添加25個氨基酸短肽長度內(nèi)，只要短肽由不含支鏈的、柔性較大的氨基酸殘基、例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等組成，而且其中含有的半胱氨酸數(shù)不超過三個，都不會對膜聯(lián)蛋白V的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生任何影響；而且在分子動力學(xué)所計算的不含支鏈、柔性較大的25個氨基酸短肽長度范圍內(nèi)，短肽長度越長，對膜聯(lián)蛋白V的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的擾動越??；相對來說，長度較短時可能對膜聯(lián)蛋白V蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，從而可能導(dǎo)致影響膜聯(lián)蛋白V作為細胞凋亡探針識別凋亡細胞的功能，而且盡管增加半胱氨酸能夠有助于膜聯(lián)蛋白V進行熒光基團或者核素標記，但是分子設(shè)計的結(jié)果顯示半胱氨酸的數(shù)量應(yīng)該控制在1-3個范圍內(nèi)，否則很可能會產(chǎn)生蛋白質(zhì)的聚合。在上述分子設(shè)計的基礎(chǔ)上，我們首先選擇了在膜聯(lián)蛋白V的C-末端只添加I個半胱氨酸殘基的設(shè)計方案，因為計算機模擬顯示此方案對膜聯(lián)蛋白V的(熒光或者核素)化學(xué)標記影響最大，或者熒光/核素化學(xué)標記后對于膜聯(lián)蛋白V的結(jié)構(gòu)及其識別凋亡細胞的功能產(chǎn)生影響的可能性最大。其它設(shè)計方案都是距離膜聯(lián)蛋白V的分子表面有一段距離， 因此這種干擾和影響要小很多。我們同時嘗試表達了膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加了含有丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸的短肽的膜聯(lián)蛋白V變體，以及含有以上三個重復(fù)的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸)3的25個氨基酸殘基的膜聯(lián)蛋白V變體，都獲得了相似的結(jié)果，從而證明了計算機分子設(shè)計的正確性。相形之下，只添加一個半胱氨酸的膜聯(lián)蛋白V變體表達水平最高，其它變體的表達水平略低，但都在60mg/L以上。所述的膜聯(lián)蛋白V變體的基因表達方法中PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘后進行94°C變性30秒、58 °C復(fù)性30秒、72 °C延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72 °C延伸I分鐘后保存于4 C。進一步地，膜聯(lián)蛋白V變體的表達方法中重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌后，挑取單克隆于37°C振蕩培養(yǎng)過夜，然后以I : 100的體積接種于LB培養(yǎng)液中，37 °C培養(yǎng)2小時至0D600約為0. 6，向菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. 5mM,37°C誘導(dǎo)表達4小時，收集菌體，用12% SDS-PAGE進行分析。膜聯(lián)蛋白V變體在10_40°C范圍內(nèi)其表達水平和產(chǎn)率都沒有顯著變化。進一步地，膜聯(lián)蛋白V變體通過采用上步所得菌體，以5mL緩沖液(50mM NH4C1,PH9. 0)懸浮I克濕菌的比例重新懸浮菌體，加入溶菌酶處理菌體，作用I小時后加入蔗糖至濃度為60%，然后稀釋到20倍體積的(50mM NH4Cl,20mM CaC12，pH9. 0)緩沖液中，離心棄去上清，保留沉淀。沉淀物用5mL解吸附液(50mM NH4Cl，pH 9. 0,20mMEDTA)重新懸浮I克沉淀的比例重新懸浮沉淀，離心取上清。再通過將上述獲得的上清進行硫酸銨分級沉淀，收集40% -70%部分的沉淀，重新溶解后進行透析，過濾去除不溶物；之后進行SuperQ-650M層析，用初始緩沖液(50mM NH4Cl，pH 9.0)平衡Super Q-650M層析柱(日本TOSOH公司)，用洗脫緩沖液(50mM NH4Cl，pH 9.0,200mM NaCl)洗脫，收集洗脫峰；將洗脫峰繼續(xù)進行SP層析，用初始緩沖液(20mM NH4Cl,80mM NaCl,15mM CaCl2,pH 9.0)平衡SP層析柱，用洗脫緩沖液(20mM NH4Cl,400mM NaCl，pH 9.0)洗脫，收集洗脫峰。上述分離純化方法可以使得產(chǎn)率達到110mg/L，其純度達到97%以上。在純化過程中，實驗結(jié)果顯示，在SP柱純化時，相對于膜聯(lián)蛋白V，膜聯(lián)蛋白V變體與SP柱結(jié)合得更為牢固，需要用更高的離子強度才能被洗脫下來，這從一個側(cè)面說明膜聯(lián)蛋白V變體比膜聯(lián)蛋白V具有更強的金屬離子結(jié)合能力；膜聯(lián)蛋白V變體結(jié)合了更多的鈣離子才導(dǎo)致其與SP柱結(jié)合得更牢固，這從一個側(cè)面證明了我們設(shè)計的膜聯(lián)蛋白V變體的有效性。進一步地，對膜聯(lián)蛋白V變體進行進行熒光化學(xué)標記或者核素標記。得到標記的膜聯(lián)蛋白V變體可以用于體內(nèi)外細胞凋亡監(jiān)測中。我們將膜聯(lián)蛋白V和膜聯(lián)蛋白V變體分別進行FITC熒光標記，然后用于檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示FITC-膜聯(lián)蛋白V變體(圖3A)和FITC-膜聯(lián)蛋白V(圖3B)均能識別凋亡的細胞，而且具有劑量依賴關(guān)系。但是與FITC-膜聯(lián) 白V相比，相同劑量的FITC-膜聯(lián)蛋白V變體信號更強，這表明膜聯(lián)蛋白V變體標記FITC的效率更高，使得探針分子數(shù)相同的情況下，產(chǎn)生更高的熒光信號。我們分別用核素標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V和標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V變體，每種蛋白質(zhì)的標記重復(fù)三次，膜聯(lián)蛋白V變體的標記效率非常穩(wěn)定，而膜聯(lián)蛋白V的標記效率則變動較大，因此膜聯(lián)蛋白V變體更易于進行標記。此外，99mTc-膜聯(lián)蛋白V放置3小時后，比放為95%，放置24小時后，比放為65% ;而99mTc-膜聯(lián)蛋白V變體放置3小時后，比放為98%，放置24小時后，比放仍大于90%。因此，膜聯(lián)蛋白V變體核素標記時具有更好的穩(wěn)定性。我們將核素標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V和標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V變體注射到動物體內(nèi)，它們都表現(xiàn)出相同的組織分布和代謝特性，因此都可以用來進行體內(nèi)的顯像檢測。本發(fā)明的有益效果(I)在已有的膜聯(lián)蛋白V的基礎(chǔ)上進行C-末端氨基酸序列的設(shè)計，通過增加含有至少一個半胱氨酸的短肽序列變體的設(shè)計，與傳統(tǒng)在膜聯(lián)蛋白V的N-末端添加氨基酸序列的方法相比更加能夠在不影響其生物學(xué)功能活性的基礎(chǔ)上提高標記效率，同時采用了先進的沉淀解吸、硫酸銨分級沉淀、Super Q-650M層析和SP層析的步驟進行蛋白質(zhì)的分離純化，大大提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，為傳統(tǒng)方法產(chǎn)量的10倍以上；(2)膜聯(lián)蛋白V變體蛋白純度好、產(chǎn)率高、標記效率及穩(wěn)定性高且不影響膜聯(lián)蛋白V變體的生物學(xué)功能，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步研究膜聯(lián)蛋白V變體及其在細胞凋亡監(jiān)測試劑、疾病監(jiān)測藥物等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖I.本發(fā)明實施例膜聯(lián)蛋白V變體重組表達菌的SDS-PAGE分析。I、誘導(dǎo)表達后的菌體總蛋白；2、菌體破碎后的表達上清液；3、菌體破碎后的表達沉淀。圖2.本發(fā)明實施例膜聯(lián)蛋白V變體分離純化過程的SDS-PAGE分析。I、分子量標準品(自上至下分別為:116. 0,66. 2,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4kDa) ;2、解吸附產(chǎn)物；3、4、硫酸銨分級沉淀產(chǎn)物；5、Super Q-650M層析純化樣品；6、Super Q-650M層析的穿過峰；7、Super Q-650M層析的洗脫峰；8、SP層析的純化樣品；9、SP層析的穿過峰；10、SP層析的洗脫峰。圖3.本發(fā)明實施例重組膜聯(lián)蛋白V與重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡的生物活性比較。3A、不同濃度(綠色0. 36nM ;粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)的重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡；3B、不同濃度(綠色0. 36nM ;粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)的重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡；3C、不同濃度的重組膜聯(lián)蛋白V與重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡的生物活性比較(綠色0. 36nM ;粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)。同顏色時，峰高的探針為FITC-膜聯(lián)蛋白V變體。
具體實施例方式實施例a.膜聯(lián)蛋白V變體的結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計在SGI計算機工作站上,利用MSI公司的分子設(shè)計軟件(Insightll、Discover等模塊)，在膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加氨基酸進行分子模建和分子設(shè)計，確定C-末端能夠添加的氨基酸長度。并選擇在膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一個半胱氨酸的膜聯(lián)蛋白V變體作為后續(xù)步驟實施的基礎(chǔ)。
b.膜聯(lián)蛋白V變體蛋白質(zhì)原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)已經(jīng)公開發(fā)表的膜聯(lián)蛋白V的基因序列設(shè)計和化學(xué)合成上下游引物，以本實驗室保存的人膜聯(lián)蛋白V基因為模板，用PCR的方法擴增獲得膜聯(lián)蛋白V變體的編碼DNA序列，引物對的核苷酸序列為上游引物5’ -gttccatgggcgcacaggttctcagaggca-3’ ；下游引物5’ -tccgctcgagttagcagtcatcttctccacag agca_3’。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘后進行94°C變性30秒、58°C復(fù)性30秒、72°C延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72°C延伸7分鐘后保存于4°C。c. PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO上進行培養(yǎng);d.用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET28a，將回收后獲得的pET28a載體片段和人膜聯(lián)蛋白V變體DNA片段按I : 20的比例混合，以T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)菌，篩選陽性克隆進行酶切鑒定和DNA測序分析驗證其編碼序列的正確性。e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)內(nèi)，挑取單克隆于37°C振蕩培養(yǎng)過夜，然后以I : 100的體積接種于LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)2小時至0D600約為O. 6，加入IPTG至終濃度O. 5mM，37°C誘導(dǎo)表達4小時，收集菌體，用12% SDS-PAGE進行分析。分析結(jié)果如圖I所示1 :誘導(dǎo)表達后的菌體總蛋白；2 :菌體破碎后的表達上清液；3 :菌體破碎后的表達沉淀。膜聯(lián)蛋白V變體的表達水平為占菌體總蛋白的35. 4%，且絕大部分以可溶性形式存在。f·分別將質(zhì)粒 pET28a-Hi s-FADD 與 pET28a_Hi s-FADD (F25Y)轉(zhuǎn)化表達宿主菌E. coliBL21 (DE3)，生長于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C生長16小時之后，挑取單克隆接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L的卡那霉素)，37°C搖床振蕩培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600值達到O. 6左右，搖床溫度降至25°C繼續(xù)培養(yǎng)半小時，加入終濃度為O. 4mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達。在25°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時后，通過離心收集菌體。g.將步驟f收集得到的菌液，以5mL緩沖液(50mM NH4C1，pH9. O)懸浮I克濕菌的比例重新懸浮菌體，加入溶菌酶處理菌體，作用I小時后加入蔗糖至濃度為60%，然后稀釋到20倍體積的(50mM NH4Cl,20mM CaC12,pH9. O)緩沖液中，離心棄去上清，保留沉淀。沉淀物用5mL解吸液(50mMNH4Cl，pH 9. O, 20mMEDTA)重新懸浮I克沉淀的比例重新懸浮沉淀，離心取上清。將上述獲得的上清進行硫酸銨分級沉淀，收集40% -70%部分的沉淀，重新溶解后進行透析，過濾去除不溶物。用初始緩沖液(50mM NH4Cl, pH 9.0)平衡Super Q-650M層析柱(日本TOSOH公司)，用洗脫緩沖液(50mM NH4Cl,pH 9.0,200mM NaCl)洗脫，收集洗脫峰。用初始緩沖液(20mM NH4Cl,80mM NaCl，15mM CaCl2,pH 9.0)平衡SP層析柱，用洗脫緩沖液(20mM NH4Cl, 400mM NaCl, pH 9.0)洗脫，收集洗脫峰。SDS-PAGE分析各收集液，其結(jié)果如圖2所示1、分子量標準品(自上至下分別為:116. 0,66. 2,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4kDa) ;2、解吸附產(chǎn)物；3、4、硫酸銨分級沉淀產(chǎn)物；5、Super Q-650M層析純化樣品；6、Super 0-65011層析的穿過峰；7、5即61 Q-650M層析的洗脫峰；8、SP層析的純化樣品；9、SP層析的穿過峰；10、SP層析的洗脫峰。經(jīng)過上述純化方法獲得了純度超過97%的膜聯(lián)蛋白V變體，每升發(fā)酵液可純化獲得IlOmg以上的膜聯(lián)蛋白V變體。膜聯(lián)蛋白V變體通過Super Q柱和SP柱這兩種互補性 極強的純化方式，幾乎可以除去全部的雜蛋白，實驗結(jié)果也顯示，經(jīng)過這兩步純化后，蛋白純度已經(jīng)超過97%。h.膜聯(lián)蛋白V及膜聯(lián)蛋白V變體的FITC熒光標記將含有3mg膜聯(lián)蛋白V及膜聯(lián)蛋白V變體的溶液放入截留分子量為IOKDa的超濾管中，使用PH9. O的O. IM碳酸氫鈉溶液進行超濾、離心、倒上清，再加入碳酸氫鈉溶液，重復(fù)三次，測量蛋白濃度，終濃度應(yīng)為5mg/ml左右，反應(yīng)前取出200 μ I置于細胞凍存管，攪拌。使用Iml的O. IM碳酸氫鈉(ρΗ9· O)溶解2mg的FITC,在室溫下迅速攪拌,取出適量的FITC溶液(使FITC與蛋白的摩爾比在60 100 I)，緩慢地滴加到蛋白溶液中，反應(yīng)終體積不得超過250 μ I。在室溫下避光攪拌反應(yīng)兩個小時。將反應(yīng)液用超濾管，對PBS (ρΗ7. 2)溶液超濾，至濾過液中看不到淡綠色的FITC分子為止，產(chǎn)物應(yīng)為黃橙色透明溶液。得到的偶聯(lián)物用錫箔紙包好，放入-20度冰箱保存。i.重組膜聯(lián)蛋白V與重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡的生物活性比較人肺癌A549(L 5X IO5)細胞經(jīng)終濃度為100ng/ml的重組人TRAIL處理6小時，用胰蛋白酶酶消化、4°C 800rpm離心5分鐘收集細胞，每個樣品分別加入400 μ I的含有O. 36ηΜ，0. 12ηΜ，0. 036ηΜ的FITC標記的重組膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白V變體，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。每個重組膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白V變體濃度重復(fù)3個實驗，以不標記的細胞樣品作為對照。生物活性對比結(jié)果如圖3所示3Α :不同濃度(綠色0. 36nM ;粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)的重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡；3B :不同濃度(綠色O. 36nM ;粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)的重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡；3C :不同濃度的重組膜聯(lián)蛋白V與重組膜聯(lián)蛋白V變體檢測細胞凋亡的生物活性比較(綠色0. 36nM ；粉紅色0. 12nM ;藍色0. 036nM)。同顏色時，峰高的探針為FITC-膜聯(lián)蛋白V變體。j.膜聯(lián)蛋白V及膜聯(lián)蛋白V變體的核素標記取SnCl2 3. 5mg 溶于 IOml pH = 7. 4 的 PBS 緩沖液中制成 O. 35 μ g/ml 的 SnCl2 溶液備用。在室溫下取100 μ I (35 μ g) SnCl2,向其加入O. 6 μ g/ μ I的膜聯(lián)蛋白V及膜聯(lián)蛋白V變體各20 μ 1，輕搖5分鐘。向其中加入體積小于O. 1ml，放射量約5mci的99Tcm04_溶液，然后滴入ΙΟμΙ Vc室溫下靜置30min，HPLC測定標記蛋白質(zhì)的放化純，大于95%方可應(yīng)用。k.核素標記的重組膜聯(lián)蛋白V與重組膜聯(lián)蛋白V變體體外穩(wěn)定性測定將99mTc-膜聯(lián)蛋白V、99mTc_膜聯(lián)蛋白V變體在室溫下分別放置I小時，2小時，3小時，然后測定放化純。此外，99mTc-膜聯(lián)蛋白V放置3小時后，比放為95%，放置24小時后，比放為65%;而99mTc-膜聯(lián)蛋白V變體放置3小時后，比放為98%，放置24小時后，比放仍大于90%。因此，膜聯(lián)蛋白V變體核素標記時具有更好的穩(wěn)定性。我們將核素標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V和標記99mTc-膜聯(lián)蛋白V變體注射到動物體內(nèi)，它們都表現(xiàn)出相同的組織分布和代謝特性，因此都可以用來進行體內(nèi)的顯像檢測。以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種膜聯(lián)蛋白V變體，具有序列表中序列I氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其特征在于是序列I中的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與序列I的氨基酸殘基序列相同活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膜聯(lián)蛋白V變體，其特征是在膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽為1-25氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成，并含有1-3個半胱氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膜聯(lián)蛋白V變體，其特征在于膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加ー個半胱氨酸。
4.ー種上述膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于按如下步驟進行 a.利用計算機輔助分子設(shè)計，在膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加氨基酸序列進行分子模建和設(shè)計； b.設(shè)計膜聯(lián)蛋白V蛋白編碼序列的引物對，以膜聯(lián)蛋白V基因為模板進行PCR擴增； c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO上進行培養(yǎng)； d.用限制性內(nèi)切酶NcoI和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET28a，將得到的兩種目的基因片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質(zhì)粒； e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主菌內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種； f.將步驟e獲得的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體； g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化后的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于所述引物對的核苷酸序列為上游引物5’ -gtt cca tgg gcg cac agg ttc tea gag gca_3’ ；P*功子弓I物5’ -tcc get cga gtt age agt cat ctt ctc cac aga gca_3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于步驟g中純化的步驟依次為沉淀解吸、硫酸銨分級沉淀、Super Q-650M層析和SP層析。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的制備方法，其特征在于進行熒光化學(xué)標記或者核素標記。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的應(yīng)用，其特征在于在制備細胞凋亡監(jiān)測試劑、疾病監(jiān)測藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種膜聯(lián)蛋白V變體的設(shè)計、制備方法及應(yīng)用。該膜聯(lián)蛋白V變體是具有序列表中序列1氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其特征在于序列1中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與序列1的氨基酸殘基序列相同活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。通過該膜聯(lián)蛋白V變體制備方法生產(chǎn)的膜聯(lián)蛋白V變體純度好、產(chǎn)率高、標記方便及標記效率和穩(wěn)定性高且不影響膜聯(lián)蛋白V變體的生物學(xué)功能，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步研究膜聯(lián)蛋白V變體及其在細胞凋亡監(jiān)測試劑、疾病監(jiān)測藥物等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/58GK102690345SQ20111007245
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者華子春, 胡敏進 申請人:江蘇靶標生物醫(yī)藥研究所有限公司