MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其編碼基因和應(yīng)用。1、一種蛋白質(zhì)，為如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）序列表的序列1自N末端第4至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b）序列表的序列1自N末端第1至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（c）序列表的序列1自N末端第4至249位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（d）序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)MERS-CoV可能有一個潛在的受體結(jié)合域(Receptor?Binding?Domain,RBD)，對RBD進行深入研究有助于發(fā)現(xiàn)阻斷該病毒入侵的關(guān)鍵靶點，對于該病毒的治療藥物和預(yù)防疫苗的研發(fā)具有重要的理論參考價值。
【專利說明】MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndromecoronavirus,簡稱MERS-CoV)于2012年首次在中東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)感染人類，隨后這種病毒感染引發(fā)的疾病又先后出現(xiàn)在歐洲幾個國家和地區(qū)。超過半數(shù)的感染病人均會出現(xiàn)嚴重的呼吸道疾病，其臨床癥狀同2013年爆發(fā)的由SARS-CoV引起的疾病非常相似。由于這種疾病可以人傳染給人，因此引起了全世界的高度關(guān)注。
[0003]MERS-CoV屬于beta冠狀病毒，但其來源和宿主仍沒有確定。同其他冠狀病毒類似，MERS-CoV利用其表面的膜蛋白S糖蛋白進入易感細胞。S糖蛋白由位于N端的SI結(jié)構(gòu)域和位于近膜端的S2結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域組成。其中病毒對細胞易感性是由SI結(jié)構(gòu)域決定的。通過利用MERS-CoV SI結(jié)構(gòu)域進行共純化實驗，在2013年初Raj的研究小組確定了dipeptideyl peptidase4 (dipeptideyl peptidase4, DPP4,也稱為 CD26)為 MERS-CoV 的受體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其編碼基因和應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自MERS-CoV，為如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)或(f):`[0006](a)序列表的序列I自N末端第4至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0007](b)序列表的序列I自N末端第I至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0008](c)序列表的序列I自N末端第4至249位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0009](d)序列表的序列I所示的蛋白質(zhì)；
[0010](e)將(a)或(b)或(C)或(d)所述的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)；
[0011](f)與(a)或(b)或(C)或(d)所述的蛋白質(zhì)具有70%以上同源性且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0012]編碼所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]所述基因可為如下(I)至(7)中任一所述的DNA分子:
[0014](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0015](2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0016](3)序列表中序列5自5’末端第1-843位核苷酸所示的DNA分子；
[0017](4)序列表中序列5自5’末端第124-864位核苷酸所示的DNA分子；
[0018](5)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0019](6)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；[0020](7)與(I)限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0021]上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0022]含有所述基因的表達盒，重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組病毒或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]以所述蛋白質(zhì)為免疫原得到的抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024]本發(fā)明還保護所述蛋白質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下(I )或(II ): ( I )治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II)治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。所述哺乳動物具體可為人。所述哺乳動物細胞具體可為Huh7細胞。
[0025]本發(fā)明還保護所述抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下(I )或(II):(I )治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II )治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。所述哺乳動物具體可為人。所述哺乳動物細胞具體可為Huh7細胞。
[0026]本發(fā)明還保護一種產(chǎn)品，其活性成分為所述蛋白質(zhì)或所述抗體；所述產(chǎn)品的功能為如下(I )或(II): ( I )治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II )治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。所述哺乳動物具體可為人。所述哺乳動物細胞具體可為Huh7細胞。
[0027]本發(fā)明還保護所述蛋白質(zhì)在制備具有結(jié)合DPP4或DPP4胞外區(qū)片段的功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明還保護一種具有`結(jié)合DPP4或DPP4胞外區(qū)片段的功能的產(chǎn)品，其活性成分為所述蛋白質(zhì)。
[0029]所述DPP4胞外區(qū)片段為如下(g)或(h)或(i)或(j)或(k)或(I):
[0030](g)序列表的序列6自N末端第4至731位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0031](h)序列表的序列6自N末端第I至731位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0032](i)序列表的序列6自N末端第4至737位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0033](j)序列表的序列6所示的蛋白質(zhì)；
[0034]( k )將(g )或(h )或(i )或(j )所述的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)；
[0035](I)與(g)或(h)或(i)或(j)所述的蛋白質(zhì)具有70%以上同源性且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0036]本發(fā)明確定了 MERS-CoV的S糖蛋白的受體結(jié)合域(Receptor BindingDomain, RBD)所在的位置，RBD片段可以同DPP4特異結(jié)合。本發(fā)明通過構(gòu)建MERS-CoV的假型病毒侵染模型，證實了 RBD片段、RBD片段的動物免疫血清均具有良好的抑制MERS-CoV侵染細胞的活性(外加的RBD片段或外加的RBD片段的動物免疫血清均可競爭性抑制MERS-CoV與DPP的結(jié)合)。RBD片段可以作為阻斷MERS-CoV侵染細胞的靶點，開發(fā)各種新型藥物。本發(fā)明對治療和預(yù)防MERS-CoV引起的疾病具有重要的理論指導(dǎo)價值和廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為實施例3中pull-down實驗的結(jié)果。[0038]圖2為實施例3中凝膠過濾實驗的結(jié)果。
[0039]圖3為實施例5中RBD-His蛋白的中和活性的結(jié)果。
[0040]圖4為實施例5中特異抗體溶液的中和活性的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0042]pcDNA3.1( + ):購自 Invitrogen 公司。pFastBac?dual vector:1nvitrogen 公司，貨號為10712-024。DHlOBac感受態(tài)細胞=Invitrogen公司，貨號為10361-012。Sf9細胞:Invitrogen公司，貨號為11496-015。293T細胞:ATCC，貨號為CRL-1573。Huh7細胞:中國科學(xué)院細胞庫，貨號為TCHul8。昆蟲細胞培養(yǎng)基(Insect-XpressTM Media):Lonza WokinghamLtd.,貨號為12-730F。已掛鎮(zhèn)的親和層析柱料(親和beads) (Chelating SepharoseTM FastFlow):GE Healthcare，貨號為 17-0575-02。
[0043]在pcDNA3.1 ( + )的HindIII和XhoI酶切位點之間插入序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子，得到能夠表達MERS-CoV全長膜蛋白的真核表達質(zhì)粒(命名為重組質(zhì)粒戊)。
[0044]pNL4_3R-E_luciferase 質(zhì)粒:參考文獻:
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì),為如下(a)或(b)或(C)或(d)或(e)或(f): Ca)序列表的序列I自N末端第4至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)序列表的序列I自N末端第I至243位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (c)序列表的序列I自N末端第4至249位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (d)序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)； (e)將(a)或(b)或(C)或(d)所述的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)； (f)與(a)或(b)或(C)或(d)所述的蛋白質(zhì)具有70%以上同源性且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下(I)至(7)中任一所述的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)序列表中序列3所示的DNA分子； (3)序列表中序列5自5’末端第1-843位核苷酸所示的DNA分子； (4)序列表中序列5自5’末端第124-864位核苷酸所不的DNA分子； (5)序列表中序列5所示的DNA分子； (6)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子； (7)與(I)限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達盒，重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組病毒或重組菌。
5.以權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)為免疫原得到的抗體。
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在制備廣品中的應(yīng)用；所述廣品的功能為如下(I)或(II):(I )治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II)治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。
7.權(quán)利要求5所述抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下(I)或(11):(I)治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II)治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。
8.一種產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求5所述抗體；所述產(chǎn)品的功能為如下(I )或(II): ( I )治療和/或預(yù)防MERS-CoV感染；(II)治療和/或預(yù)防MERS-CoV浸染哺乳動物細胞。
9.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在制備具有結(jié)合DPP4或DPP4胞外區(qū)片段的功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.一種具有結(jié)合DPP4或DPP4胞外區(qū)片段的功能的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C07K14/165GK103554235SQ201310461299
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月17日
【發(fā)明者】王新泉, 張林琦, 王年爽, 史宣玲 申請人:清華大學(xué)