專(zhuān)利名稱(chēng)：合成的hcv包膜蛋白和它們用于接種的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于肝炎病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及合理設(shè)計(jì)的合成E2蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述E2蛋白質(zhì)包含在來(lái)源于全世界的77種不同HCV 1b分離株的E2中發(fā)現(xiàn)的最保守氨基酸的共有序列。更具體地，本發(fā)明涉及包含合成的E2蛋白質(zhì)的疫苗。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是單鏈正RNA病毒，其已經(jīng)被分類(lèi)為黃病毒科屬成員(Bartenschlager和Lohmann，2000 J Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。它的基因組由高度保守的5’非編碼區(qū)，接著是單個(gè)的大約10,000個(gè)核苷酸的可讀框組成，所述可讀框被翻譯成3010-3033個(gè)氨基酸的多蛋白前體。隨后通過(guò)宿主和HCV編碼的蛋白酶的酶切割(Hijikata等，1991PNAS USA 88，5547-51；Lin等，1994 J.Virology 68，5063-73；Lin等，1994 J.Virology 68，8147-57 Grakoui等，1993 PNAS USA 90，10583-7；Grakoui等，1993 J Virology 67，2832-43)產(chǎn)生至少10種不同的多肽，其可以分成結(jié)構(gòu)核心和包膜蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)解旋酶，蛋白酶，依賴于RNA的RNA聚合酶。由此構(gòu)成HCV病毒體(Miyamura和Matsuura，1993 Trends Microbiology 1(6)229-31；Bartenschlager和Lohmann，2000 J.Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。由于它產(chǎn)生導(dǎo)致慢性肝病和有時(shí)肝細(xì)胞癌(Hoofnagel，1997 Hepatology 26(3 Suppl 1)15S-20S)的嚴(yán)酷感染的能力，HCV是主要的公共衛(wèi)生憂慮。目前，抗病毒療法是不足的，因此開(kāi)發(fā)改善的療法和有效的HCV疫苗是高度優(yōu)先的(關(guān)于綜述參見(jiàn)Rosen和Gretch，1999 Mol Med Today 5(9)393-9)。
包括HCV疫苗的有效抗HCV藥物的開(kāi)發(fā)受HCV作為一組至少6種來(lái)源于基因型1-6的不同蛋白質(zhì)存在的事實(shí)阻礙(Simmonds等，1993 J.ofGen.Virology 74，2391-9)。感染HCV的個(gè)體可能包含來(lái)源于一種顯性基因型的不同HCV準(zhǔn)種的譜系，這增加了另外的復(fù)雜度(Forns等，1999Trends Microbiology 7(10)402-10)。HCV的這種內(nèi)在的超突變可能性是由HCV RNA聚合酶的低保真度導(dǎo)致(NS5B；Bartenschlager和Lohmann，2000 J.Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。因此，某些大概本質(zhì)上是親水的和表面表達(dá)的HCV肽基序是免疫原性但高度易變的，可以逃脫免疫監(jiān)視。符合這些性質(zhì)的一個(gè)基序已經(jīng)被定義為(coin)高變區(qū)I(HVR 1)并組成在包膜蛋白E2的N’-末端處27個(gè)氨基酸的一段序列。HVR1包含許多T和B細(xì)胞表位(Weiner等，1992 PNAS USA89(8)3468-72；Scarselli等，1995 J Virology 69(7)4407-12；Zibert等，1995 Virology 208，653-61)并且針對(duì)該區(qū)域的抗體已經(jīng)顯示抑制HCV與人成纖維細(xì)胞的結(jié)合和感染(Zibert等，1995 Virology 208，653-61；Shimizu等，1996 Virology 223(2)409-12)，在結(jié)合中和(NOB)測(cè)定中部分消除E2 CHO與MOLT-4細(xì)胞的結(jié)合(Rosa等，1996 PNAS USA 93，1759-63)，在免疫沉淀測(cè)定中捕捉HCV(Esumi等，1996 J Virol Methods 59(1-2)91-8)和改善至少部分，在黑猩猩中的HCV感染性(Farci等，1994 PNAS USA 91(16)7792-6；Farci等，1996 PNAS USA 93，15394-9；Shimuzu等，1996 Virology 223(2)409-12)。
許多努力致力于研究作為候選疫苗的HVR1，例如，Goto等(2001Hepatology Research 19270-283)用合成的HVR1肽免疫黑猩猩并獲得保護(hù)。Carlos等(2000，Vaccine Weekly，July 26，17頁(yè))報(bào)導(dǎo)設(shè)計(jì)一種合成的構(gòu)建體，其結(jié)合許多通常在病毒高變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的突變。該肽構(gòu)建體包括在病毒的HVR1和HVR2中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。
另外認(rèn)為涉及HCV中和的重要區(qū)域存在于HVR1之外，因?yàn)榘珽1/E2的保護(hù)性疫苗產(chǎn)生具有對(duì)于HVR1的極低結(jié)合效價(jià)的超免疫血清(Choo等，1994 PNAS USA 901294-1298)。然而Choo的疫苗僅對(duì)于HCV的同源毒株是保護(hù)性的。
已經(jīng)進(jìn)行數(shù)次嘗試將E2蛋白質(zhì)用于免疫。Bukh等在WO 200121807中公開(kāi)了編碼缺少HVR1的HCV的核酸分子和它的免疫用途。Zucchelli等，(2001 Hepatology 33692-703)公開(kāi)了某種HVR1肽模擬物(模擬表位(mimotopes))，其與E2蛋白質(zhì)的胞外域融合，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液反應(yīng)。
因此似乎E2包膜蛋白總體上代表中和HCV感染的可行的靶位點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)作為適于異種HCV亞型的預(yù)防以及治療疫苗的適當(dāng)E2抗原是極其重要的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及合成的E2蛋白質(zhì)的氨基酸和推斷的核酸序列，所述合成的E2蛋白質(zhì)(“E2多數(shù)(majority)”)包含在77種不同HCV 1b分離株的E2中發(fā)現(xiàn)的最保守氨基酸的共有序列。本發(fā)明還涉及缺少HVR1的截短的E2蛋白質(zhì)(“E2多數(shù)w/o”)的氨基酸和推斷的核苷酸序列以及E2多數(shù)蛋白質(zhì)的氨基酸和推斷的核苷酸序列，其中用R9模擬表位(Puntoriero等，The EMBO Journal 17卷，No.13，3521-3533頁(yè)，1998)替代HVR1(“E2多數(shù)R9”)。本發(fā)明還涉及與公開(kāi)序列具有至少98％同源性的本發(fā)明E2多數(shù)蛋白質(zhì)的變體。
本發(fā)明另外涉及來(lái)源于本文公開(kāi)序列的蛋白質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)可以通過(guò)將編碼本發(fā)明的E2蛋白質(zhì)的核酸序列插入表達(dá)載體和在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的重組方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及這些蛋白質(zhì)作為疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼本發(fā)明E2蛋白質(zhì)的核酸序列的表達(dá)載體作為基于核酸的疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明另外涉及包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的藥物組合物，其用于預(yù)防或治療個(gè)體中的丙型肝炎。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可用于檢測(cè)生物樣品中HCV特異的抗體。因此可以在HCV感染的治療期間作為診斷工具來(lái)鑒定和監(jiān)視HCV感染，疾病進(jìn)展和治療劑的功效。
本發(fā)明的另一方面是用于檢測(cè)生物樣品中HCV特異的抗體的試劑盒，其中所述試劑盒實(shí)質(zhì)上包含純化和分離的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面涉及對(duì)于本發(fā)明E2蛋白質(zhì)的抗體和該抗體在被動(dòng)免疫療法或預(yù)防中的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.E2多數(shù)，E2多數(shù)R9和E2多數(shù)-w/o的氨基酸序列。在推定的糖基化位點(diǎn)下面劃線。
圖2.蛋白質(zhì)印跡照片，其顯示不同HCV血清基因型與各種E2蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。在非還原條件下在SDS-PAGE凝膠上跑純化的桿狀病毒生產(chǎn)的HCV E2蛋白質(zhì)(泳道1-4)，哺乳動(dòng)物中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞生產(chǎn)的E2(泳道5)，和非相關(guān)的陰性對(duì)照蛋白質(zhì)硫氧還蛋白(泳道6)，并用代表HCV基因型1a，1b，2a/2c，3a，4，5和6的不同的人血清探測(cè)。對(duì)照包括下列各項(xiàng)抗組氨酸單克隆抗體(α-His mAb)，ABXTL68人抗E2mAb，作為陽(yáng)性對(duì)照，抗HCV陰性(α-HCV-ve)和抗乙型肝炎核心陽(yáng)性(α-HBC+ve)血清被包括作為陰性對(duì)照。
圖3.蛋白質(zhì)印跡照片，其顯示不同HCV血清基因型與各種E2蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。在非還原條件下在SDS-PAGE凝膠上跑純化的桿狀病毒生產(chǎn)的天然E2和E2多數(shù)蛋白質(zhì)(泳道1和2)，和非相關(guān)的陰性對(duì)照蛋白質(zhì)硫氧還蛋白(泳道3)，并用代表HCV基因型1b，2a/2c，3a，和4的不同的人血清探測(cè)。ABXTL68人抗E2 mAb，作為陽(yáng)性對(duì)照。
圖4.是通過(guò)用各種E2蛋白質(zhì)免疫稚鼠產(chǎn)生的超免疫血清的結(jié)合性能的圖示。在(A)中使用包被各種抗原的ELISA平板檢驗(yàn)結(jié)合。每個(gè)框表示用于包被的不同抗原。數(shù)據(jù)表示為作為血清稀釋度的函數(shù)的O.D.測(cè)量。在(B)中使用蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)結(jié)合，其中在凝膠上跑各種E2制劑并與不同的超免疫血清反應(yīng)。
圖5.是小鼠單克隆抗體與各種E2制劑和作為陰性對(duì)照的硫氧還蛋白的結(jié)合性能的圖示。mAb 18是針對(duì)天然E2產(chǎn)生的并且mAb 21是針對(duì)E2多數(shù)R9產(chǎn)生的。使用蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)結(jié)合，其中在凝膠上跑各種E2制劑并且與不同單克隆抗體反應(yīng)。印跡左側(cè)的數(shù)字表示以KD表示的估計(jì)的分子量。
圖6.是在移植后第19天在它們的血清中具有陽(yáng)性HCV RT-PCR信號(hào)的HCV-Trimera小鼠的平均病毒負(fù)荷和百分比(圓括號(hào)中的數(shù)字)的圖示。線條表示不同的實(shí)驗(yàn)組其中移植的肝臟用HCV感染血清和免疫前血清(對(duì)照)預(yù)先溫育的組；和其中移植的肝臟用HCV感染血清和各種抗E2IgG制劑預(yù)先溫育的組。
現(xiàn)在將參考下列實(shí)施例，其是為了舉例說(shuō)明而不是意圖限制本發(fā)明而提供。
實(shí)施例本發(fā)明涉及意外的發(fā)現(xiàn)即合成的，非天然修飾的E2蛋白質(zhì)(“E2多數(shù)”，“E2多數(shù)R9”和“E2多數(shù)w/o”)被從感染各種HCV基因型的患者獲得的血清和來(lái)源于感染各種形式的E2的小鼠的超免疫血清識(shí)別。此外，這些合成蛋白質(zhì)可以引起能夠中和動(dòng)物模型中HCV感染的強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。這些結(jié)果提示合成的E2蛋白質(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可以引起針對(duì)各種形式的E2的免疫應(yīng)答，因此使其成為疫苗的理想候選物。
材料和方法所有常規(guī)材料購(gòu)自Sigma(Israel)。哺乳動(dòng)物E2 CHO購(gòu)自AustralBiologicals(CA)。
以下所述的所有表達(dá)和純化方法涉及本發(fā)明公開(kāi)的所有類(lèi)型的E2(E2多數(shù)，E2多數(shù)R9和E2多數(shù)w/o)以及天然E2。
合成HCV E2 cDNA的產(chǎn)生1.E2-多數(shù)R9該構(gòu)建體是使用2個(gè)分開(kāi)的PCR反應(yīng)，#1和2，通過(guò)循環(huán)PCR合成的。在PCR反應(yīng)#1中，在單個(gè)管子中將下列5個(gè)有意義和5個(gè)反義引物混合在一起引物數(shù)據(jù)被刪除在這第一個(gè)PCR中，以25pmol/μl的儲(chǔ)存濃度將所有有意義(1-5號(hào))和反義引物(1-5號(hào))混合在一起。取3μl混合引物的等分試樣用于PCR，其使用下列程序使用Bio-X-Act DNA聚合酶(Bioline，London，UK)95℃，3分鐘，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，30次，接著72℃延伸5分鐘。
在PCR#1后，取出1μl等分試樣用于使用外部旁側(cè)的小寡核苷酸的PCR#2。在該反應(yīng)中，有意義引物是5’cgc-gga-tcc-cag-acc-acc-gtg-gtt-g 3’，反義引物是5’ccg-gaa-ttc-tta-tca-gtg-gtg-gtg-g 3’。使用的PCR條件與用于PCR#1的相同，除了程序包括20個(gè)循環(huán)以外。在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR片段電泳，在UV下用溴化乙錠顯現(xiàn)并純化，隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)克隆。用BamHI和EcoRI限制酶酶切純化的片段并連接于預(yù)先用BamHI和EcoRI消化的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pAcGP67B(Pharmingen，USA)之中。
2.E2-多數(shù)w/o使用下列有意義和反義引物在先前所述包含E2多數(shù)R9 cDNA的重組質(zhì)粒pGP67B上進(jìn)行PCR刪除引物數(shù)據(jù)PCR條件與上述反應(yīng)#1相同。將產(chǎn)生的PCR片段凝膠純化，用BamHI和EcoRI消化并連接于同樣消化的pAcGP67B質(zhì)粒中。
3.E2多數(shù)結(jié)合使用限制酶消化和循環(huán)PCR構(gòu)建E2多數(shù)。
a)用BamHI和AscI限制酶完全消化E2多數(shù)R9。在1％瓊脂糖凝膠上將消化物電泳并切除和純化較大的～10kb的片段。
b)如反應(yīng)#1使用下列具有25鏈節(jié)突出端的19x～50鏈節(jié)的寡核苷酸進(jìn)行循環(huán)PCR反應(yīng)刪除引物數(shù)據(jù)在1％瓊脂糖凝膠上將產(chǎn)生的～400bp片段進(jìn)行電泳，純化，用BamHI/AscI消化并再純化。其后將該片段連接到先前產(chǎn)生的消化的E2多數(shù)R9質(zhì)粒中(上述部分(a))。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中后，培養(yǎng)細(xì)菌克隆，分離質(zhì)粒DNA并進(jìn)行DNA測(cè)序。將與預(yù)測(cè)DNA序列匹配的克隆進(jìn)一步培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA以產(chǎn)生重組質(zhì)粒pAcGP67B E2多數(shù)。
桿狀病毒細(xì)胞系在補(bǔ)充yeastolate，乳白蛋白水解物，10％胎牛血清，和50μg/ml慶大霉素的Grace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)(TNM-FH培養(yǎng)基)中維持SF9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))貼壁細(xì)胞。這些細(xì)胞只用于涉及轉(zhuǎn)染，終點(diǎn)稀釋試驗(yàn)(EPDA)和產(chǎn)生高效價(jià)重組病毒的方案。維持作為貼壁或搖床培養(yǎng)物的High-Five細(xì)胞(粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)并在無(wú)血清培養(yǎng)基(Insect Xpress，Bio Whittaker，MD；Ex-Cell 405 media，JRH Biosciences，Andover UK)中培養(yǎng)。這些細(xì)胞用于蛋白質(zhì)表達(dá)研究。所有細(xì)胞在27℃下在冷凍培養(yǎng)箱(VELP Scientific)中供養(yǎng)。
重組桿狀病毒的產(chǎn)生所有重組桿狀病毒是使用線性化的BaculoGold試劑盒(Pharmingen，San Diego)產(chǎn)生的。按照Pharmingen的指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行EPDA和產(chǎn)生高效價(jià)重組病毒效價(jià)原液(2×108pfu/ml)的病毒擴(kuò)增程序。
桿狀病毒E2多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化High-Five細(xì)胞的適應(yīng)和感染在蛋白質(zhì)表達(dá)研究之前，使High-Five細(xì)胞適應(yīng)搖瓶。簡(jiǎn)單扼要地，將來(lái)自搖瓶(Corning Costar，MA)的貼壁細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/ml)轉(zhuǎn)移至11聚碳酸酯錐形瓶(Corning，MA)中，并在150rpm下在500ml無(wú)血清培養(yǎng)基中搖動(dòng)24小時(shí)。其后將燒瓶移出，放置在組織培養(yǎng)櫥(hood)中并傾斜5分鐘以將細(xì)胞團(tuán)塊從非聚集細(xì)胞分離。去除純系的單個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新錐形瓶，以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種并用E2多數(shù)重組桿狀病毒組感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)＝3。在感染后3天，收獲振蕩培養(yǎng)物，在離心后收集上清液，無(wú)菌過(guò)濾并在4℃或-70℃下保存。
在桿狀病毒E2多數(shù)感染的High-Five細(xì)胞上進(jìn)行RT-PCR為了證實(shí)E2多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化是來(lái)源于它特異的重組桿狀病毒，在一些表達(dá)實(shí)驗(yàn)期間取出5×106個(gè)細(xì)胞并用于使用Tri-Reagent BD(Molecular Research Center，OH)的RNA分離。取出等分試樣的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)，其使用寡-dT(Promega，WI)作引物并用AMV和MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，WI)催化。將cDNA用于使用pAcGP67B有意義和反義引物(參見(jiàn)以上)的PCR。PCR程序是94℃3分鐘(1次)，94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 1.5分鐘(33個(gè)循環(huán))，接著是在72℃下5分鐘的最終延伸步驟。將PCR片段凝膠純化并進(jìn)行使用pAcGP67B有意義和反義引物(參見(jiàn)以上)的直接DNA測(cè)序。
感染桿狀病毒E2多數(shù)的上清液的濃度使用Vivaflow 50,200(Vivascience，UK)或Pellicon-XL 50(Millipore，MA)再生的纖維素濃縮器裝置將各種體積的桿狀病毒E2多數(shù)的上清液(250ml至71)濃縮～10倍。在4℃下將濃縮物用PBS或天然裂解緩沖液(NLB，pH＝8)透析過(guò)夜，所述緩沖液包含50mM NaHPO4，300mM NaCl，10mM咪唑。僅對(duì)于針對(duì)NLB透析后的物質(zhì)，加入1/20稀釋度的10％Triton-X-100的NLB溶液中。其后將所有透析物質(zhì)無(wú)菌過(guò)濾并用于純化。桿狀病毒E2多數(shù)上清液的FPLC純化通過(guò)鎳(Ni-NTA)瓊脂糖柱純化在Pharmacia C柱中制備4.5-30ml鎳-NTA瓊脂糖(Qiagen，Hilden)柱。將柱與AKTA探測(cè)器(Pharmacia，NJ)連接并用3個(gè)柱體積的NLB以3ml/分鐘的流速洗滌。將E2多數(shù)上清液以1-2ml/分鐘的速率加樣并用5個(gè)柱體積的包含20mM咪唑的NLB以3ml/分鐘洗滌。用5個(gè)柱體積的包含300mM咪唑的NLB以3ml/分鐘的流速洗滌E2多數(shù)。在280nm下測(cè)量洗脫級(jí)分的光密度，合并并在4℃下針對(duì)PBS徹底地透析。
通過(guò)鏈親和素-瓊脂糖偶聯(lián)的抗E2 mAb 18柱純化將25mg，純化的mAb 18(參見(jiàn)以下)與1.25mg生物素(Pierce，Rockville，IL)偶聯(lián)，并針對(duì)PBS徹底透析。通過(guò)溫和攪拌將生物素化的mAb 18(22mg)與10ml鏈親和素瓊脂糖High Performance(Pharmacia，NJ)在室溫下偶聯(lián)30分鐘，接著加樣至HR 10/10-柱(Pharmacia，NJ)上。通過(guò)流過(guò)物質(zhì)的分光光度測(cè)定(A280nm)證實(shí)結(jié)合的生物素化的mAb 18，并用PBS洗滌柱。將先前針對(duì)PBS透析的濃縮的E2上清液以2ml/分鐘的速率加樣到柱上。在用PBS 5個(gè)柱體積的洗滌后，用1ml 0.1M甘氨酸(pH＝3)的級(jí)分洗脫結(jié)合物質(zhì)，并立即用50μl 1M Tris堿(pH＝9)中和。在280nm下測(cè)量洗脫級(jí)分的光密度，合并并在4℃下針對(duì)PBS徹底透析。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定通過(guò)Bradford測(cè)定(Bio-Rad，CA)測(cè)定純化的蛋白質(zhì)的濃度。
免疫印跡分析將在還原(在360mM β-巰基乙醇的存在下95℃加熱5分鐘)或非還原條件(在無(wú)β-巰基乙醇的情況下37℃ 10分鐘)下的補(bǔ)充LDS-加樣緩沖液的粗制或純化的蛋白質(zhì)樣品(100-200ng)加樣到4-12％NuPAGE凝膠上并在MES電泳緩沖液(Novex，San Diego)中電泳。使用XCell II Blotmodule(Novex，San Diego)通過(guò)濕轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)電印跡到硝化纖維膜，并4℃下在封閉緩沖液(PBS-0.04％ Tween-0.3％乳蛋白)中封閉過(guò)夜。在以0.02-2μg/ml加入五-組氨酸(Qiagen，Hilden)，小鼠或人抗E2 mAb后在新鮮封閉緩沖液中在室溫下將印跡溫育3小時(shí)。使用各種稀釋度的HCV患者血清進(jìn)行相同的方案。在封閉緩沖液中3次分開(kāi)的5分鐘洗滌后，將印跡與偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠(1∶10,000)或山羊抗人IgG(1∶20,000；Zymed Incorporation，South San Francisco)溫育并拿來(lái)用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)。
小鼠抗E2 mAb的產(chǎn)生免疫抗E2 mAb 18用10μg在完全弗氏佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)1∶1體積中的E2通過(guò)爪墊免疫BALB/C(5周齡)。每2周用5μg在不完全弗氏佐劑(Difco Labroatories，Detroit，MI)1∶1體積中的E2通過(guò)爪墊加強(qiáng)免疫小鼠2次。在收獲脾臟用于隨后融合之前3天用1μg E2(靜脈內(nèi))加強(qiáng)免疫小鼠。
超免疫血清和抗E2多數(shù)R9 mAb 21
用10μg E2或E2多數(shù)R9和100μg包含CpG(5′tcc-atg-acg-ttc-ctg-acg-tt 3′；Genset，F(xiàn)rance)和25μl 2％明礬(Sigma，MO)的硫代磷酸免疫BALB-C小鼠(5周齡)。在腹膜內(nèi)免疫之前將該抗原混合物渦旋并放在冰上30分鐘。在收獲脾臟用于融合之前3天，用2μg抗原進(jìn)一步靜脈內(nèi)免疫小鼠。
小鼠脾臟的融合將脾臟細(xì)胞與人-小鼠雜交骨髓瘤HMMA2.11 TG/0以3∶1的比率混合。使用50％(w/v)PEG 1500(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)進(jìn)行融合，并將融合的細(xì)胞以30,000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種到96-孔U形底微量滴定板(Nunc.Inc)完全RPMI培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT)添加物(1X)(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)。1周后用新鮮HAT培養(yǎng)基喂養(yǎng)細(xì)胞。
融合后2周，收獲上清液用于針對(duì)各種免疫原的ELISA以證明特異性抗體的存在。用新鮮的包含次黃嘌呤，胸苷(HT)的培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基。通過(guò)在96 U形-底微量滴定板中以0.5個(gè)細(xì)胞/孔的有限稀釋克隆分泌特異性抗E2或抗E2多數(shù)R9 mAb的雜交瘤培養(yǎng)物。
克隆18和21的腹水制劑用500μl降植烷(Sigma，MO)腹膜內(nèi)注射BALB-C小鼠。10天后，腹膜內(nèi)注射5×106特異的小鼠單克隆抗體。3-4周后，進(jìn)行腹膜灌洗并去除腹水流體。
腹水流體的純化用PBS 1∶1稀釋腹水流體并以5ml/分鐘加樣到5ml Hi-trap蛋白質(zhì)G柱(Pharmacia，NJ)上。在用40ml PBS洗滌后，用30ml 0.1M甘氨酸(pH＝2.7)洗脫結(jié)合的mAb并對(duì)PBS徹底透析。將MAb以1mg/ml的濃度-20℃保存。
ELISA
在4℃下用2μg/ml E2抗原的PBS溶液包被MaxiSorp ELISA平板(Nunc，Inc)(50μl/孔)過(guò)夜。在用200μl PBS/1％BSA/孔37℃封閉2小時(shí)后，在37℃下將連續(xù)稀釋的小鼠血清(1∶100-1∶200,000)或純化的mAb(1μg/ml)加入孔中2小時(shí)。在用PBS/0.04％吐溫-20洗滌后，在37℃下加入1∶10,000稀釋度的偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)1小時(shí)，接著在450nm下使用3，3’，5，5’-四甲基-聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(TMB，Sigma，MO)作為底物的比色法。
實(shí)施例1通過(guò)比較77種不同E2蛋白質(zhì)的氨基酸序列(來(lái)源于Genebank登記的序列)構(gòu)建E2多數(shù)。選擇在每個(gè)位點(diǎn)最頻繁出現(xiàn)的氨基酸并相應(yīng)地合成構(gòu)建體。E2多數(shù)w/o是缺少包含HVR1的開(kāi)始27個(gè)氨基酸的E2多數(shù)的截短形式。E2多數(shù)R9在HVR1區(qū)域包含先前鑒定的稱(chēng)為R9的HVR1模擬表位(27個(gè)氨基酸長(zhǎng))。E2多數(shù)，E2多數(shù)w/o和E2多數(shù)R9其它方面相同(圖1；序列表SEQ ID NO.1描述E2多數(shù)，SEQ ID NO.2描述E2多數(shù)w/o并且SEQ ID NO.3描述E2多數(shù)R9)。在位置31(命名為X)處的氨基酸可以為苯丙氨酸(F)或異亮氨酸(I)。
合成的構(gòu)建體是通過(guò)循環(huán)PCR方法產(chǎn)生。使用鳥(niǎo)槍法，將包含完整編碼多數(shù)序列的具有20個(gè)鏈節(jié)5’和3’突出端的各個(gè)引物(～100鏈節(jié))混合，并進(jìn)行PCR(參見(jiàn)方法)。為了產(chǎn)生用于克隆到pAcGP67B中的最終PCR產(chǎn)物，設(shè)計(jì)較小的5’和3’引物，其包含5’BamHI和3’EcoRI編碼位點(diǎn)。3’引物包含允許純化的組氨酸標(biāo)記。
將High-Five細(xì)胞作為振蕩培養(yǎng)物培養(yǎng)并用重組E2(多數(shù)，多數(shù)R9或多數(shù)w/o)桿狀病毒以感染復(fù)數(shù)(MOI)為3來(lái)感染。在隨后72小時(shí)期間取出上清液樣品并在蛋白質(zhì)凝膠上用抗His或抗E2 mAb探測(cè)。早在感染后8小時(shí)，雖然非常微弱，觀察到免疫反應(yīng)性的E2(Mw＝50kD)，其增加一直到感染后72小時(shí)。隨后選擇該時(shí)刻收集上清液。
為了獲得純的E2多數(shù)蛋白質(zhì)可以將包含蛋白質(zhì)的上清液濃縮，透析，并加樣到所述的鎳-NTA瓊脂糖柱或抗E2 mAb親和柱上(參見(jiàn)方法)?？梢詫⑾嗤牧魍?FT)，洗滌和洗脫(Eln)級(jí)分加樣到分開(kāi)的SDS-PAGE并分別進(jìn)行抗His mAb反應(yīng)性和考馬斯藍(lán)染色以檢驗(yàn)純化的效率。
實(shí)施例2為了研究合成的多數(shù)蛋白質(zhì)的功能性，進(jìn)行非還原性免疫印跡并用來(lái)源于各種HCV基因型的血清探測(cè)(圖2和3)。在圖2所示的蛋白質(zhì)印跡中在凝膠上跑各種桿狀病毒表達(dá)的E2制劑，等量(100ng)的E2 CHO和硫氧還蛋白。使用適當(dāng)?shù)难逑♂尫秶?1∶2,500-1∶10,000)，對(duì)于E2多數(shù)R9和E2多數(shù)w/o(泳道3和4)觀察到與大多數(shù)檢驗(yàn)血清型的強(qiáng)烈信號(hào)。其它E2蛋白質(zhì)也顯示與不同血清的反應(yīng)性。泳道2中的E2 w/o HVR1制劑缺乏E2 N-末端的31個(gè)氨基酸，即HVR1+另外4個(gè)氨基酸，并且是唯一的不與血清反應(yīng)的E2制劑。這間接暗示這4個(gè)氨基酸對(duì)于保存允許抗體識(shí)別的E2的正確構(gòu)象是非常重要的。ABXTL68(0.5μg/ml)，一種完全的人抗E2 mAb作為陽(yáng)性對(duì)照，而α-HCV陰性和α-HBC陽(yáng)性血清(都為1∶2500的稀釋度)作為陰性對(duì)照。
在分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行非還原性免疫印跡并用來(lái)源于HCV基因型1-4的血清探測(cè)(圖3)。E2多數(shù)被所有血清型和ABXTL68識(shí)別。
實(shí)施例3用天然E2，E2多數(shù)R9，和E2多數(shù)w/o將小鼠免疫。從小鼠中獲得超免疫血清并通過(guò)ELISA評(píng)估對(duì)固定的抗原的反應(yīng)性。來(lái)源于用E2多數(shù)R9，和E2多數(shù)w/o免疫的小鼠的超免疫血清顯示對(duì)所有4種桿狀病毒生產(chǎn)的E2蛋白質(zhì)的最高的反應(yīng)性(圖4A)。有趣地，對(duì)于哺乳動(dòng)物E2(E2 CHO)也觀察到顯著的反應(yīng)性，用來(lái)源于以天然E2免疫的小鼠的超免疫血清未觀察到效果。對(duì)于硫氧還蛋白未觀察到超免疫血清的反應(yīng)性(圖4A)。支持這些數(shù)據(jù)，在還原性SDS-PAGE上，來(lái)源于用E2多數(shù)R9或E2多數(shù)w/o免疫的小鼠的超免疫血清顯示對(duì)于所有桿狀病毒表達(dá)的E2抗原以及E2 CHO的特異的，廣泛的反應(yīng)性(圖4B)。相反，來(lái)源于用天然E2免疫的小鼠的超免疫血清顯示有限模式的反應(yīng)性(圖4B)。這些結(jié)果說(shuō)明與天然E2相比，多數(shù)蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)針對(duì)廣泛范圍的E2蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，所述天然E2能夠產(chǎn)生僅針對(duì)注射抗原的特異應(yīng)答。廣譜免疫應(yīng)答說(shuō)明作為疫苗多數(shù)蛋白質(zhì)可具有比天然E2高的優(yōu)勢(shì)。
類(lèi)似地，針對(duì)E2多數(shù)R9產(chǎn)生的單克隆抗體(mAb)與幾種類(lèi)型的E2反應(yīng)，而針對(duì)天然E2產(chǎn)生的mAb在它們的識(shí)別范圍方面更受限制。在用E2或E2多數(shù)R9免疫和隨后脾臟融合后，產(chǎn)生兩種不同mAb。在還原性SDS-PAGE上檢驗(yàn)這些mAb的結(jié)合特性，α-E2 mAb 18只識(shí)別天然E2(具有或w/o HVR1)而抗E2多數(shù)R9 mAb 21識(shí)別所有桿狀病毒表達(dá)的E2抗原以及E2 CHO(圖5)。
實(shí)施例4使用下列HCV-Trimera動(dòng)物模型表征針對(duì)各種E2制劑的血清的生物活性處理小鼠以便允許人肝臟片段的穩(wěn)定移植。處理包括強(qiáng)烈照射，接著移植scid(重度聯(lián)合免疫缺損)小鼠骨髓。使用HCV陽(yáng)性人血清體外進(jìn)行人肝臟片段的病毒感染(美國(guó)5,849,987)。
將0.5ml包含7.5×105HCV-RNA拷貝/ml和無(wú)可檢測(cè)的抗E2 IgG的人血清樣品與按照下列各項(xiàng)的各種抗血清室溫預(yù)先溫育3小時(shí)來(lái)源于用天然E2(300μg)免疫的小鼠的IgG級(jí)分；來(lái)源于用E2多數(shù)R9(300μg)免疫的小鼠的IgG級(jí)分；來(lái)源于用E2多數(shù)w/o(300μg)免疫的小鼠的IgG級(jí)分；作為陰性對(duì)照的免疫前血清。
隨后將預(yù)溫育的血清用于體外感染正常人肝臟片段。在感染后，將肝臟片段移植到小鼠中并在19天后測(cè)定血清中的HCV-RNA。圖6顯示各種抗E2抗體制劑在抑制HCV的肝臟感染中的作用，如通過(guò)平均病毒負(fù)荷和HCV-RNA陽(yáng)性小鼠的百分比所證明。針對(duì)天然E2，E2-多數(shù)R9和E2-多數(shù)w/o產(chǎn)生的血清顯著降低平均病毒負(fù)荷和感染動(dòng)物的百分比。
序列表<110>XTL生物制藥有限公司<120>合成的HCV包膜蛋白質(zhì)用于接種<130>HCVvacIL<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>278<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>合成的<400>1(E2多數(shù))Thr Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gly Phe1 5 10 15
Ala Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Xaa Asn20 25 30Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp35 40 45Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe50 55 60Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp65 70 75 80Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Glu Pro Gly Ser85 90 95Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly100 105 110Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro115 120 125Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr130 135 140Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg145 150 155 160Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly165 170 175Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly180 185 190Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu195 200 205
Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys210 215 220Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn225 230 235 240Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg245 250 255Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu260 265 270Asp Arg Asp Arg Ser Glu275<210>2<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>合成的<400>2(E2多數(shù)w/o)Ile Gln Leu Xaa Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala1 5 10 15Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe20 25 30
Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser35 40 45Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr50 55 60Ala Glu Pro Gly Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala65 70 75 80Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val85 90 95Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser100 105 110Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu115 120 125Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp130 135 140Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn145 150 155 160Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe165 170 175Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp180 185 190Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr195 200 205Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly210 215 220
Gly Val Glu His Arg Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu225 230 235 240Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu245 250<210>3<211>278<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>合成的<400>3(E2多數(shù)R9)Gln Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Gln Ser His Thr Val Arg Gly Leu1 5 10 15Thr Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Ser Gln Asn Ile Gln Leu Xaa Asn20 25 30Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp35 40 45Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe50 55 60Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp65 70 75 80
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Asp Arg Asp Arg Ser Glu275<210>4<211>834<212>DNA<213>人工序列<400>4(E2多數(shù))accacccacg tgaccggcgg cagcgccgcc cgcaccacca gcggcttcgc cagcctgttc 60agccccggcg ccaagcagaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 834<210>5<211>834<212>DNA
<213>人工序列<400>5(E2多數(shù)w/o)cagaccaccg tggttggcgg tagccagtct cacaccgtgc gtggcctgac cagcctgttc 60agcccgggtg cctctcaaaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 834<210>6<211>834<212>DNA<213>人工序列<400>6(E2多數(shù)R9)cagaccaccg tggttggcgg tagccagtct cacaccgtgc gtggcctgac cagcctgttc 60agcccgggtg cctctcaaaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180
acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 83權(quán)利要求
1.一種純化和分離的E2蛋白質(zhì)或其變體，所述E2蛋白質(zhì)具有選自SEQ ID NO1-3的序列。
2.按照權(quán)利要求1的純化和分離的E2蛋白質(zhì)，其另外與另一種多肽連接。
3.一種組合物，其實(shí)質(zhì)上包含按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)和適當(dāng)?shù)妮d體。
4.一種純化和分離的核酸，其編碼按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)。
5.一種純化和分離的核酸，其編碼按照權(quán)利要求1的E2蛋白質(zhì)，其具有選自SEQ ID NO4-6的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，其包含按照權(quán)利要求4或5的核酸。
7.一種宿主生物，其用按照權(quán)利要求6的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
8.一種E2蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求7的宿主生物生產(chǎn)。
9.一種預(yù)防丙型肝炎的方法，其包含以能夠刺激生產(chǎn)足夠水平的保護(hù)性抗體的量對(duì)個(gè)體給藥權(quán)利要求3的組合物。
10.一種治療丙型肝炎的方法，其包含以能夠引發(fā)針對(duì)HCV的免疫應(yīng)答的量對(duì)HCV攜帶者給藥權(quán)利要求3的組合物。
11.一種用于免疫個(gè)體抗丙型肝炎的疫苗，其實(shí)質(zhì)上由藥用載體中按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)組成。
12.一種組合物，其包含按照權(quán)利要求6的表達(dá)載體。
13.一種預(yù)防丙型肝炎的方法，其包含以能夠刺激生產(chǎn)足夠水平的保護(hù)性抗體的量對(duì)個(gè)體給藥權(quán)利要求12的組合物。
14.一種治療丙型肝炎的方法，其包含以能夠引發(fā)針對(duì)HCV的免疫應(yīng)答的量對(duì)HCV攜帶者給藥權(quán)利要求12的組合物。
15.一種用于免疫個(gè)體抗丙型肝炎的疫苗，其實(shí)質(zhì)上由藥用載體中按照權(quán)利要求6的表達(dá)載體組成。
16.抗E2抗體，其具有對(duì)于選自SEQ ID NO1-3的E2氨基酸序列的特異的結(jié)合親和力。
17.一種預(yù)防丙型肝炎的方法，其包含以有效保護(hù)所述個(gè)體免于HCV攻擊的量對(duì)個(gè)體給藥權(quán)利要求16的抗體。
18.按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)用于制備HCV疫苗組合物的應(yīng)用。
19.按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)用于在慢性HCV攜帶者中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫的應(yīng)用。
20.按照權(quán)利要求19的E2蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其用于在其它任何治療之前，同時(shí)，或之后在慢性HCV攜帶者中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
21.按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其用于在肝臟移植之前或之后，或在推定的感染之后在感染HCV的個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
22.按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)用于預(yù)防性地誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫的應(yīng)用。
23.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的E2蛋白質(zhì)或組合物，其用作HCV疫苗。
24.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的E2蛋白質(zhì)或組合物，其用于在慢性HCV攜帶者中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
25.按照權(quán)利要求24的E2蛋白質(zhì)或組合物，其用于在其它任何治療之前，同時(shí)，或之后在慢性HCV攜帶者中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
26.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的E2蛋白質(zhì)或組合物，其用于在肝臟移植之前或之后，或在推定的感染之后在感染HCV的個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
27.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的E2蛋白質(zhì)或組合物，其用于預(yù)防性誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫。
28.按照權(quán)利要求16的特異性抗體治療或預(yù)防HCV感染的應(yīng)用。
29.用于檢測(cè)存在于生物樣品中的HCV抗體的試劑盒，其包含在適當(dāng)?shù)娜萜髦械陌凑諜?quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)。
30.用于檢測(cè)HCV抗體的免疫測(cè)定，所述免疫測(cè)定包含(1)提供按照權(quán)利要求1或2的E2蛋白質(zhì)，(2)在允許形成抗體-抗原復(fù)合體的條件下將生物樣品與所述E2蛋白質(zhì)溫育，(3)確定所述包含所述E2蛋白質(zhì)的抗體-抗原復(fù)合體是否形成。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成的E2蛋白質(zhì)的氨基酸和推斷的核酸序列，所述E2蛋白質(zhì)包含在全世界77種不同HCV 1b分離株的E2中發(fā)現(xiàn)的最保守氨基酸的共有序列。本發(fā)明另外涉及缺少HVR1的、E2蛋白質(zhì)的截短形式。本發(fā)明的另一方面涉及包含E2蛋白質(zhì)的疫苗。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1555415SQ02818082
公開(kāi)日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2002年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月13日
發(fā)明者劉易斯·內(nèi)維爾, 阿里·曹貝爾曼, 劉易斯 內(nèi)維爾, 曹貝爾曼 申請(qǐng)人:Xtl生物制藥有限公司