鯉皰疹病毒3型囊膜蛋白o(hù)rf132的單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種保藏編號(hào)為CCTCCN O：C2014172的雜交瘤細(xì)胞株，以及該雜交瘤細(xì)胞株分泌鯉皰疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的單克隆抗體。所述的鯉皰疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的單克隆抗體，可以識(shí)別天然鯉皰疹病毒3型，并具有很好的特異性，可廣泛用于鯉皰疹病毒3型的病原學(xué)診斷、血清學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測及防治、ORF132蛋白功能研究等。
CCTCC NO:C2014172
20141023
【專利說明】鯉皰疹病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體、雜交瘤細(xì) 胞株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白ORF132的單克隆 抗體、雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鯉皰瘆病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又稱錦鯉皰瘆病 毒（Koi Herpesvirus，KHV)，屬于痕疼病毒目（Herpesvirales)，異痕疼病毒科 (Alloherpesviridae)，鯉皰瘆病毒屬（Cyprinivirus)，是一種雙鏈線性DNA病毒，具 有囊膜結(jié)構(gòu)。該病毒嚴(yán)重威脅鯉（Cyprinus carpio)及其觀賞品種：錦鯉，致死率高達(dá) 80% -100%。鯉皰瘆病毒3型基因組約295kb，編碼156個(gè)不同的0RF，目前已經(jīng)確定其中 的14個(gè)0RF編碼囊膜蛋白。囊膜蛋白位于病毒最外層，在病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別、互作以 及入侵過程中發(fā)揮著重要作用，也是建立檢測方法和防治手段的重要靶分子。
[0003] 0RF132是鯉皰瘆病毒3型的一個(gè)高度保守并且特異的囊膜蛋白分子， 也是病毒的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（Michel B, Leroy B 等，The genome of cyprinid herpesvirus3encodes 40proteins incorporated in mature virions,Journal of General Virology, 2010, 91:452 - 462 ；Yi Y, Zhang H等，Extracellular virion proteins of two Chinese CyHV-3/KHV isolates, and identification of two novel envelope proteins, Virus Research，2014, 191:108 - 116)，對(duì)其核苷酸序列和氨基酸使用 NCBI blast軟件在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線分析顯示：0RF132是鯉皰瘆病毒3型的 特有基因，目前GenBank中已經(jīng)登錄了 4個(gè)毒株的0RF132序列，包括GZ11株，美國株（U)、 以色列株（I)、日本株（J)，其中GZ11株、U株、J株的0RF132基因序列完全一致，與上述3 個(gè)毒株相比，I株的0RF132基因存在一個(gè)堿基的差異：第17位堿基由T變?yōu)锳，對(duì)應(yīng)的第 6位氨基酸由異亮氨酸（lie)變?yōu)樘於０罚ˋsn)。根據(jù)文獻(xiàn)（劉振興，柯浩等，錦鯉皰瘆 病毒囊膜蛋白0RF132的克隆及分析，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，6:134-136)報(bào)道，0RF132蛋白的 97-170位氨基酸片段為主要B細(xì)胞表位區(qū)段，具有良好的免疫原性，并且該片段的氨基酸 序列在已知的鯉皰瘆病毒3型中完全一致，是一個(gè)理想的鯉皰瘆病毒3型診斷靶位。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種分泌鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體 的雜交瘤細(xì)胞株4E11。
[0005] 本發(fā)明還提供了由上述保藏編號(hào)為CCTCCNO :C2014172的雜交瘤細(xì)胞株制備的單 克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在檢測鯉皰瘆病毒3型上的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種分泌鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4E11，已 于2014年10月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏編號(hào)為 CCTCCNO :C2014172。
[0009] -種鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CCTCC NO: C2014172的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0010] 所述單克隆抗體為IgGl亞類。
[0011] 一種檢測鯉皰瘆病毒3型的試劑盒，含有保藏編號(hào)為CCTCCNO :C2014172的雜交瘤 細(xì)胞株產(chǎn)生的鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體。
[0012] 本發(fā)明所述的分泌鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞株4E11已于2014年10月23日保藏于國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC，地址：武漢大學(xué)），保藏日期2014年10月23日，保藏編號(hào)CCTCCNO: C2014172。
[0013] 本發(fā)明主要具有如下有益效果：
[0014] 本發(fā)明通過發(fā)明人長期研宄鯉皰瘆病毒3型，選取了該病毒特有的，且具有較高 的免疫原性的鯉皰瘆病毒3型0RF132基因，通過大量的實(shí)驗(yàn)研宄，篩選到能穩(wěn)定分泌鯉皰 瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4E11。
[0015] 本發(fā)明制備得到的雜交瘤細(xì)胞株4E11能穩(wěn)定、大量制備鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白 0RF132的單克隆抗體，該抗體為IgGl亞類，可以識(shí)別天然鯉皰瘆病毒3型，并且與同屬于 異皰瘆病毒科的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV ;又稱為鮰皰瘆病毒1型， Ictalurid herpesvirus l，IcHV-l)無交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出很好的特異性，可廣泛用于鯉皰瘆 病毒3型的病原學(xué)診斷、血清學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測及防治等。
[0016] 本發(fā)明制備的單克隆抗體可以特異性識(shí)別鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132,可以 與該蛋白特異性結(jié)合，應(yīng)用于免疫共沉淀、抗體封閉等0RF132相關(guān)的蛋白功能研宄。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為重組CyHV-30RF132的誘導(dǎo)表達(dá)，其中，1:未誘導(dǎo)的重組CyHV-30RF132蛋 白工程菌裂解液，2 :IPTG誘導(dǎo)的重組CyHV-30RF132蛋白工程菌裂解液，3:純化的重組 CyHV-30RF132 蛋白。
[0018] 圖2為重組蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果，其中，1 :純化的重組CyHV-30RF132蛋 白，2 :誘導(dǎo)的重組CyHV-30RF132蛋白工程菌裂解液。
[0019] 圖3為CyHV-3感染的CCB細(xì)胞IFA檢測結(jié)果；其中，A1 :DAPI染色，示細(xì)胞核；A2 : Cy3免疫染色A3 :A1、A2疊加圖。
[0020] 圖4為未感染的CCB細(xì)胞IFA檢測結(jié)果；其中，B1 :DAPI染色，示細(xì)胞核；B2 :Cy3 免疫染色，B3 :B1、B2疊加圖。
[0021] 圖5為CCV感染的CC0細(xì)胞IFA檢測結(jié)果；其中，Cl :DAPI染色，示細(xì)胞核；C2 :Cy3 免疫染色，C3 :C1、C2疊加圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024] 主要實(shí)驗(yàn)材料和來源：按照水產(chǎn)動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)（OIE，2013)的方法分離鯉皰 瘆病毒3型，分尚的毒株命名為：HZ419株。
[0025] 實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株CCTCC NO :C2014172,單克隆抗體4E11的制備和應(yīng)用
[0026] 一、免疫原的制備
[0027] 1、鯉皰瘆病毒3型0RF132重組表達(dá)載體的構(gòu)建、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒 定
[0028] 參照文獻(xiàn)（劉振興，柯浩等，錦鯉皰瘆病毒囊膜蛋白0RF132的克隆及分析，廣東農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2011，6:134-136)以末端帶有￡(：〇1?1和把11(1111酶切位點(diǎn)的引物01^132?((11^八八 TTCCGCCGTATATCGAGGCACTT SEQ ID NO. 1)/0RF132R(CCCAAGCTTTCTTAGACCTTTTAGACGATTTT GG，SEQ ID NO. 2)擴(kuò)增該基因的主要B細(xì)胞表位區(qū)段編碼序列（289?510位核苷酸），反應(yīng) 程序：94°C預(yù)變性 2min，之后 35 個(gè)循環(huán)：94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 5min。將 上述PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)HindIII、EcoRI雙酶切后插入pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組0RF132 的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO。測序證實(shí)，該段基因正確插入到表達(dá)載體，并且此段序 列與GZ11株，U株、J株、I株的對(duì)應(yīng)核苷酸序列一致性為100%。將包含上述載體的ToplO 工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Rosetta菌株中。參照pET表達(dá)手冊(cè)（Novagen)，進(jìn)行重組 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，參照MERCK蛋白純化說明書純化重組蛋白并進(jìn)行Western Blot鑒定。結(jié) 果見圖1，圖2。如圖所示，構(gòu)建的重組工程菌株誘導(dǎo)以后可以觀察到一條28kDa的目的條 帶，經(jīng)Western Blot鑒定為重組表達(dá)的鯉皰瘆病毒3型0RF132蛋白。
[0029] 二、動(dòng)物免疫及抗體效價(jià)檢測
[0030] 以純化的重組0RF132蛋白作為抗原免疫12周齡BALB/c小鼠，免疫3次，每次間 隔兩周，第一次免疫，抗原加等體積的弗氏完全佐劑，后兩次加等體積的弗氏不完全佐劑， 免疫劑量為60 y g/只，免疫途徑為背部和腹部皮下多點(diǎn)注射。采用間接ELISA檢測免疫小 鼠的血清抗體效價(jià)。具體方法如下：
[0031] 2. 1 ELISA所用溶液的配制：
[0032]包被緩沖液：（0. 05mol/L 碳酸鹽緩沖液 pH9. 6):1. 59g Na2C03, 2. 93g NaHC03溶于 800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至9. 6,并定容至1000mL。
[0033]洗滌緩沖液（pH7. 4PBST) :0? 2g KH2P04,2. 9g Na2HP04.12H20,8. 0g NaCl，0. 2gKCl， 0.5mL Tween-20 (0.05 % V/V)以上各物質(zhì)準(zhǔn)確稱量后，加雙蒸水完全溶解后，調(diào)pH值至 7. 4,定容至 1000mL。
[0034] 封閉液：牛血清白蛋白（BSA) lg加入100mL的PBST中，混勻溶解。
[0035] 抗體稀釋液：0. lg BSA溶于100mL PBST中，混勻溶解。
[0036]底物緩沖液：A液：Na2HP04 ? 12H20 7. 16g溶于100mL雙蒸水；B液：C6H807 ? H20 2. lg，溶于100mL雙蒸水。
[0037] TMB底物顯色液：TMB 50mg溶于25mL無水乙醇中4°C避光保存。
[0038] TMB工作液：臨用前配制，TMB底物顯色液0.5mL，底物緩沖液：A液2. 57mL，底物 緩沖液液2. 43mL，雙蒸水5mL，再加入30% H2020. 8 y L混勾，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0039]終止液：（2mol/L H2S04):雙蒸水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸（98% ) 21. 7mL〇
[0040] 2. 2 間接ELISA步驟：
[0041] 1、包被：用包被液稀釋重組ORF132蛋白至濃度為3. 125yg/mL，100yL/^L，WA 96孔ELISA板，4°C包被過夜；棄去包被液，加入200 y L/孔PBST洗滌液，靜置3min，棄洗滌 液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0042] 2、封閉：加封閉液，100 y L/孔，37°C條件下封閉2h，棄去封閉液，加入200 y L/孔 PBST，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0043] 3、加樣：每孔加入100yL血清，37°C作用lh，作用完畢后棄去血清樣品。加入 200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0044] 4、加酶標(biāo)二抗：每孔加lOOyL 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 抗體，37°C作用lh，作用完畢后棄去二抗，加入200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，將 ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0045] 5、加顯色液：加入100 y L/孔的TMB底物顯色液，顯色液要用新鮮配制的，37°C避 光顯色lOmin。
[0046] 6、加入終止液：顯色完畢后，立即加入終止液終止反應(yīng)，每孔50 yL。
[0047] 7、測0D值：用酶標(biāo)儀測定0D450nm處吸光值。
[0048] 三、雜交瘤細(xì)胞的融合、篩選與擴(kuò)大培養(yǎng)
[0049] 根據(jù)上述間接ELISA的檢測結(jié)果，取效價(jià)較高的免疫小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前 三天加強(qiáng)免疫，用不加佐劑抗原腹腔注射，劑量為60 y g/只。取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞 與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，按常規(guī)PEG融合法制備雜交瘤細(xì)胞；用重組表達(dá)的0RF132包被ELISA 板，進(jìn)行間接ELISA檢測（操作方法同二），初步篩選到43株陽性克隆，再通過鯉皰瘆病毒3 型全病毒包被的ELISA板（包被濃度為20 y g/mL)，采用間接ELISA (除包被抗原更換為全 病毒外，其他操作方法同二）從初篩的陽性克隆中篩選能夠識(shí)別天然鯉皰瘆病毒3型的陽 性克隆4株，并擴(kuò)大培養(yǎng)；同時(shí)采用有限稀釋法對(duì)陽性克隆進(jìn)行亞克隆，進(jìn)行3次；對(duì)亞克 隆后的細(xì)胞株進(jìn)行3次凍存、復(fù)蘇試驗(yàn)，最終篩選到2株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤 細(xì)胞株。經(jīng)過抗體亞類分析，2株細(xì)胞分泌的單克隆抗體分別為IgM和IgGl亞類，由于小鼠 IgM半衰期短，并且通常會(huì)形成多聚體，分子量大，在免疫組化等試驗(yàn)中會(huì)影響其組織、細(xì)胞 的穿透性，因此，我們對(duì)IgGl亞類的單克隆抗體進(jìn)一步研宄，并將分泌IgGl亞類單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞株4E11，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年10月23日， 保藏編號(hào)為CCTCCNO :C2014172。其中，雜交瘤細(xì)胞4E11分泌抗體的穩(wěn)定性分析和單克隆 抗體亞類鑒定如下。
[0050] 雜交瘤細(xì)胞4E11分泌抗體的穩(wěn)定性分析：
[0051] 將雜交瘤細(xì)胞CCTCCNO :C2014172在液氮中凍存1個(gè)月后復(fù)蘇，以純化的鯉皰瘆病 毒3型全病毒為抗原包被ELISA板，（包被濃度為20 y g/mL)采用間接ELISA法（除包被 抗原更換為全病毒外，其他操作方法同二）測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià)，然后再次 放入液氮中凍存；1個(gè)月后再次取出復(fù)蘇，如此連續(xù)重復(fù)凍融3次。比較分析幾次雜交瘤細(xì) 胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)的測定值。結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞CCTCCNO :C2014172經(jīng)過3次反復(fù) 凍融，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗體效價(jià)恒定，均為1:2560,說明分泌的單抗具有良好的穩(wěn)定性。
[0052] 單克隆抗體亞類鑒定：
[0053]米用 Sigma 公司的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，測定雜 交瘤細(xì)胞4E11分泌的免疫球蛋白的亞類類型，結(jié)果表明本發(fā)明所述的單克隆抗體4E11為 IgGl亞類。
[0054] 四、雜交瘤細(xì)胞株4E11培養(yǎng)上清與腹水單抗效價(jià)的測定
[0055] 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和制備的腹水，連續(xù)倍比稀釋，然后用間接ELISA(操作方 法同上）測定其效價(jià)。結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)為1:2560,腹水抗體效價(jià) 為 1:102400。
[0056] 五、單克隆抗體4E11腹水的大量制備
[0057] 取10周齡雌性健康BALB/c小鼠，lmL/只腹腔注射石蠟油；1周后，0.5mL/只腹腔 注射濃度為5X 107/mL的雜交瘤細(xì)胞CCTCCNO :C2014172;待腹水產(chǎn)生足量后，收集腹水并 以2000g離心5min，上清液即為含單克隆抗體4E11的腹水。所獲得的腹水可于一 80°C或 液氮中保存。
[0058] 六、單克隆抗體4E11的純化
[0059] 采用rProteinG(GE Healthcare)親和層析方法從上述腹水中純化單克隆抗體，具 體步驟按試劑盒的說明書操作。純化后的單克隆抗體4E11調(diào)整到250 y g/mL，經(jīng)ELISA測 定（操作方法同二），其效價(jià)為1:102400。
[0060] 七、單克隆抗體4E11用于鯉皰瘆病毒3型的免疫熒光檢測
[0061] 相關(guān)試劑配制同上。免疫熒光操作步驟參考博士德公司SABC_Cy3免疫組化試劑 盒進(jìn)行，具體步驟如下。
[0062] 1、樣品制備：鯉皰瘆病毒3型（HZ419株）接種96孔板培養(yǎng)的CCB細(xì)胞（鯉腦細(xì) 胞系），待出現(xiàn)CPE后，用-20 °C預(yù)冷甲醇固定，室溫固定30min。棄去甲醇，加入200 y L/孔 PBST，靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0063] 2、封閉：加入200 y L/孔封閉液，37°C孵育2h，棄去封閉液，加入200 y L/孔PBST， 靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0064] 3、單抗結(jié)合：用抗體稀釋液將純化的4E11單克隆抗體（250 y g/mL) 1:100稀釋， 37°C孵育lh，棄去抗體反應(yīng)液，加入200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0065] 4、二抗結(jié)合：用抗體稀釋液將生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 1:100稀釋，37°C孵育 lh，棄去抗體反應(yīng)液，加入200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0066] 5、SABC-Cy3結(jié)合：用抗體稀釋液將SABC-Cy31:100稀釋，37°C孵育30min，棄去 SABC-Cy3,加入200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0067] 6、DAPI染色：加入100 y L/孔DAPI染色5min，棄去染液，加入200 y L/孔PBST， 靜置3min，棄洗滌液，重復(fù)3次。
[0068] 7、熒光倒置顯微鏡（AxioObserverA1)觀察拍照。
[0069] 結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在CCB細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)能觀察到紅色熒光，單克隆抗體4E11 可以特異性識(shí)別鯉皰瘆病毒3型的天然抗原（0RF132蛋白），能夠應(yīng)用于鯉皰瘆病毒3型的 檢測。
[0070] 八、單克隆抗體4E11的特異性檢測
[0071] 采用七中的免疫熒光檢測方法，對(duì)未感染鯉皰瘆病毒3型的CCB細(xì)胞（鯉腦細(xì) 胞系）和感染斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV;又稱為鮰皰瘆病毒1型， Ictalurid herpesvirus l，IcHV-l)的CC0細(xì)胞（斑點(diǎn)叉尾鮰卵巢細(xì)胞系）進(jìn)行免疫焚光 檢測。結(jié)果見圖4和圖5。其中，圖4顯示，在未感染CyHV-3的細(xì)胞中未檢測到紅色熒光， 說明單抗4E11與CCB細(xì)胞無交叉反應(yīng)。圖5顯示，在感染CCV的CCO細(xì)胞中未檢測到紅色 熒光，說明單抗4E11與CCV無交叉反應(yīng)。
[0072] 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，單克隆抗體4E11與CCB細(xì)胞以及CCV無交叉反應(yīng)，顯示了良好 的特異性。
[0073] 九、單克隆抗體4E11應(yīng)用于鯉皰瘆病毒3型的抗原捕獲ELISA
[0074] 相關(guān)試劑配制同上，具體步驟如下：
[0075] 1、捕獲抗體包被：用包被液稀釋純化的單克隆抗體4E11至終濃度為4 y g/mL， 100 y L/孔，加入ELISA板，4°C包被過夜；棄去包被液，加200 y L/孔PBST洗滌液，靜置 3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0076] 2、封閉：加封閉液，lOOyL/孔，37°C條件下封閉2h，棄去封閉液，加200 yL/孔 PBST，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0077] 3、加樣：加入感染鯉皰瘆病毒3型（采用0IE推薦的PCR檢測方法確診）的錦鯉的 血清以及設(shè)立健康錦鯉血清的陰性對(duì)照，100 UL/孔，37°C作用lh，作用完畢后棄去樣品。 加200 y L/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0078] 4、加檢測抗體：加100 y L/孔，終濃度5 y g/mL的雞抗鯉皰瘆病毒3型 IgY (制備方法參照 Zhenxing Liu, Hao Ke 等，Oral Passive Immunization of Carp Cyprinus carpio with Anti-CyHV-3Chicken Egg Yolk Immunoglobulin(IgY), Fish Pathology, 2014, 49 (3) : 113 - 120)，37°C作用lh，作用完畢后棄去檢測抗體，加200 y L/孔 PBST，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0079] 5、加酶標(biāo)抗體：加100 yL/孔1:8000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗雞抗體 (Sigma)，37°C作用lh，作用完畢后棄去酶標(biāo)抗體，加200 yL/孔PBST，靜置3min，棄洗滌液， 將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復(fù)三次。
[0080] 6、加顯色液：加入100 yL/孔TMB底物顯色液，顯色液要用新鮮配制的，37°C條件 下避光顯色5min。
[0081] 7、加入終止液：顯色完畢后，立即加入終止液終止反應(yīng)，每孔50 yL。
[0082] 8、測0D值：用酶標(biāo)儀測定0D450nm處吸光值。
[0083] 結(jié)果顯示，陽性血清與陰性血清的0D值分別為1. 102、0. 245, P/N>2. 1，由雜交瘤 細(xì)胞CCTCCNO :C2014172產(chǎn)生的單克隆抗體4E11可以應(yīng)用于鯉皰瘆病毒3型感染的血清學(xué) 診斷。
[0084] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種分泌鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編 號(hào)為 CCTCCNO :C2014172。
2. 鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體，其特征在于，其由保藏編號(hào)為 CCTCCNO :C2014172的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體，其特征在 于，所述單克隆抗體為IgGl亞類。
4. 權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體在制備 檢測鯉皰瘆病毒3型的試劑中的應(yīng)用。
5. -種檢測鯉皰瘆病毒3型的試劑盒，其特征在于，包括有保藏編號(hào)為CCTCCNO : C2014172的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的鯉皰瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104450627SQ201410823311
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】劉振興, 柯浩, 馬艷平, 郝樂, 馬江耀, 梁志凌 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所