專利名稱：一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一氧化氮的熒光測定技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種可用于水溶液及生物 體系中一氧化氮熒光測定的銪配合物熒光探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在生物體系中，一氧化氮(NO)能通過生物體自動合成并能在動物、植物、真 菌、細菌體內(nèi)與其他一些自由基分子或金屬蛋白快速反應(yīng)，從而發(fā)揮重要的生理、病理 作用。在生物體內(nèi)，低濃度的NO作為細胞內(nèi)及細胞間一種信號傳導(dǎo)分子在血液循環(huán)、 免疫、神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用(文獻1 :R. Μ. J. Palmer, A. G. Ferrige，S. Moncada， Naturel987，327，524 ；文獻 2 :S. H. Snyder，Sciencel992，257，494 ；文獻 3 :V. Holan, M. Krulova, A. Zajicova, J. Pindjakova, Mol. Immunol. 2002, 38,989 ；文獻 4 :S. Jasid, Μ. Simontacchi, C. G. Bartoli, S. Puntarulo, Plant Physiol. 2006，142，1246)，而當(dāng) NO 的 濃度過高時，便與體內(nèi)其他活性氧物種(ROS)反應(yīng)產(chǎn)生大量的活性氮物種(RNS)(文獻5 F. L. M. Ricciardolo, P. J. Sterk, B. Gaston, G. Folkerts, Physiol. Rev. 2004，84，731)，進而 對核酸、脂肪以及蛋白質(zhì)等生物分子造成損害。由于NO具有非常重要的生理作用，建立靈敏的NO檢測方法，特別是生物體系中的 NO檢測方法越來越引起人們的關(guān)注。目前，NO檢測主要有以下幾種方法(1)利用NO是一種自由基特征的磁共振波譜法(文獻6 :T. Yoshimura, H. Yokoyama, S. Fujii, F. Takayama, K. Oikawa, H. Kamada, Nat. Biotechnol. 1996,14,992 ；文 獻 7 :Y. Katayama, N. Soh, Μ. Maeda, Chem. Phys. Chem. 2001，2，655)，但是，由于 NO 在液相中 半衰期極短，極容易被氧化成其它氮氧化物，使得該方法靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和應(yīng)用范 圍上略有不足。(2)分光光度法，利用NO易被氧化成N02_，進而在酸性條件下與Griess試劑反 應(yīng)生成重氮化物的方法(文獻 8 :L. C. Green，D. A. Wagner, J. Glogowski, P. L. Skipper, J. S. ffishnok, S. R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 1982，126，131)，該方法操作簡單，但準(zhǔn)確
度、靈敏度較低。(3)電化學(xué)法，利用NO容易被氧化而發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，從而對NO濃度進行測 定的方法(文獻 9 :T. Malinski, Ζ. Taha, Naturel992, 358,676 ；文獻 10 :F. Bedioui, N. Villeneuve, Electroanal. 2003，15，15)，該方法靈敏度高、電極穩(wěn)定性好、使用壽命長， 但可用于細胞內(nèi)NO測定的電極制作困難，且將這種電極插入細胞會對細胞產(chǎn)生較大的損 傷。(4)化學(xué)發(fā)光法，用氧化劑將NO氧化成二氧化氮后利用激發(fā)態(tài)二氧化氮返回基態(tài) 時釋放能量而發(fā)光的方法(文獻 11 J. F. Brien, B. E. McLaughlin, K. Nakatsu, G. S. Marks, Methods Enzymo 1. 1996，268，83)，該方法靈敏度高，但是操作復(fù)雜，而且在操作過程中使用 的氧化劑如臭氧、過氧化氫等對細胞的損害很大，很難用于細胞體系中NO的測定。(5)使用熒光探針的測定法(文獻 12 :H. Kojima，N. Nakatsubo, K. Kikuchi,S. Kawahara, Y. Kirino, H. Nagoshi, Y. Hirata, T. Nagano, Anal. Chem. 1998,70, 2446 ；文 獻 13 :M. H. Lim, D. Xu, S. J. Lippard, Nat. Chem. Biol. 2006，2，375 ；文獻 14 :Ε· W. Miller, C. J. Chang, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007,11,620)，該方法具有操作簡單、靈敏度高、選擇 性好等特點，是目前最為理想的檢測方法之一。但目前已有的NO熒光探針?biāo)褂玫臒晒?團都是有機熒光分子，這些有機熒光團存在光穩(wěn)定性差、易被光漂白、Stokes位移較小，在 用于復(fù)雜生物體系測定時易受到體系共存雜質(zhì)背景熒光干擾等缺點(文獻15 :Z. Zhang, S. Achilefu, Org. Lett. 2004，6，2067)。另外，雖然這些熒光探針分子能夠穿過細胞膜與細 胞內(nèi)的NO反應(yīng)而產(chǎn)生熒光信號，但這些探針分子與NO的反應(yīng)產(chǎn)物也很容易從細胞中溢出 (文獻 16 :L. Ε. McQuade, S. J. Lippard, Curr. Opin. Chem. Biol. 2009，14，1)，從而在熒光測 定時產(chǎn)生誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、選擇性及水溶性好、適用范圍廣、 可用于水溶液及生物體系中NO熒光測定的銪配合物熒光探針及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下以三價銪離子與有機配位體4，- [4- (3，4- 二氨基苯氧基)苯基]-2，2，6，，2 ”_聯(lián) 三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸形成的配合物(簡稱DATTA-Eu3+)為一氧化氮熒光探針，其中 所述有機配位體DATTA結(jié)構(gòu)式為 與細胞共培養(yǎng)可進入細胞的三價銪離子與有機配位體4’ -[4-(3，4_ 二氨基苯氧 基)苯基]_2，2’:6’，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亞甲基酯形成的配合物為
一氧化氮熒光探針，其中所述有機配位體結(jié)構(gòu)式為 所述基于上述銪配合物的NO熒光探針的應(yīng)用過程為在各類生物及非生物環(huán)境 中，利用所述的銪配合物熒光探針-Eu3+與體系中NO反應(yīng)生成DATTA的苯并三唑衍生物 4，-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸與Eu3+的 配合物(簡稱ΒΡΤΤΑ-Eu3+)，導(dǎo)致探針在612nm波長處的熒光強度顯著增強，然后通過熒光 測定法確定NO的產(chǎn)生及生成量。所述熒光測定法除了常規(guī)的熒光測定法外，還包括時間分 辨熒光測定法、熒光顯微鏡成像測定法及時間分辨熒光顯微鏡成像測定法。所述NO測定用銪配合物熒光探針可用于含有其組份的測定試劑盒及相關(guān)試劑 中。本發(fā)明的熒光探針具有如下優(yōu)點1.具有很好的水溶性，適用于水溶液中各種化學(xué)、生物化學(xué)、細胞及生物組織等體 系中NO的測定。2.熒光壽命長，可用于百微秒級的時間分辨熒光測定，以消除背景熒光對測定的 干擾。3.穩(wěn)定性高，能長期保存使用。4.具有較高的NO測定靈敏度，最低檢測下限為8. 4nmol/L。5.對NO有很好的選擇性，與其他的活性氧物種作用時熒光信號幾乎無變化。6.在生理pH值的水溶液中可迅速與NO反應(yīng)導(dǎo)致熒光強度增強，其熒光量子效率 增大47倍。7.經(jīng)溴甲基乙酸酯酯化后在普通培養(yǎng)條件下即可進入活細胞內(nèi)，特異性地與細胞 內(nèi)的一氧化氮反應(yīng)，引起探針的熒光強度顯著增強，進而用于活細胞中NO的熒光測定。


圖1是有機配位體DATTA的合成路線圖。圖2是BPTTA-Eu3+與NO的反應(yīng)原理圖及反應(yīng)前后溶液的熒光顏色變化。圖3 是在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸緩沖溶液中 DATTA_Eu3+(2· 0 μ mol/L,實線) 及其與NO反應(yīng)產(chǎn)物BPTTA-Eu3+(2. 0 μ mol/L，虛線)的熒光光譜圖。圖 4 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其與 NO 反應(yīng)產(chǎn)物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在 不同PH值的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光強度變化圖。圖 5 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其與 NO 反應(yīng)產(chǎn)物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在不同PH值的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光壽命變化圖。圖6是DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)在pH值7· 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中與各 種活性氧物種(10 μ mol/L)反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度比較圖。圖7 是 DATTA-Eu3+(1. 0 μ mol/L)與不同濃度 NO 在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸緩 沖溶液中反應(yīng)后其產(chǎn)物熒光光譜的變化情況圖。圖8是DATTA-Eu3+在pH值7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中檢測NO的工作曲線圖。圖9是DATTA-Eu3+標(biāo)記的桅子細胞在不同培養(yǎng)時間下的明場成像、熒光成像及時 間分辨熒光成像測定結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合技術(shù)方案和附圖詳細敘述本發(fā)明的具體實施例。本實施例僅用于對本發(fā) 明進行說明，基于相同原理和類似原料的方法也屬本發(fā)明的范圍。實施例1 有機配位體DATTA的合成合成路線如圖1所示，基體操作過程如下。(1)4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物1)的合成在300mL含有24. 2克(0. 2mol) 2_乙?；拎さ娜芤褐屑尤?0mL的10mol/L氫 氧化鉀，室溫攪拌30分鐘后加入13. 6克的4-甲氧基苯甲醛(0. Imol)，室溫繼續(xù)攪拌15 分鐘后再加入150mL的濃氨水。反應(yīng)液在50°C下攪拌12小時，過濾收集沉淀，用水充分洗 滌后再用少量的冷甲醇洗滌。粗產(chǎn)品經(jīng)過乙醇重結(jié)晶后得到17克的化合物1，產(chǎn)率50%。 1HNMr(CDCI3)測定結(jié)果8. 74(s，2H)，8· 69 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 92-7. 90 (m, 4H), 7. 37 (t, J =6. 4Hz，2H)，7. 04 (d, J = 8. OHz, 2H) ,3. 89(s，3H)。(2)6，6”_ 二腈基-4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物2)的 合成將1. 82克化合物1 (5. 4mmol)溶于IOOmLCH2Cl2后加入3. 70克的間氯過氧化苯甲 酸(m-CPBA，21.4mmol),反應(yīng)液室溫攪拌24小時。用IOOmL的10% Na2CO3水溶液洗滌有機 相2次，再用無水硫酸鈉干燥有機相，蒸去溶劑。所得固體真空干燥后溶于40mL的CH2Cl2 中，加入3. 73克的三甲基氰基硅(37. 5mmol)，室溫攪拌20分鐘后，慢慢滴加入3. 02克的苯 甲酰氯，反應(yīng)液室溫攪拌24小時。蒸去一半的溶劑后，加入30mL的10% K2CO3水溶液，室溫 攪拌1小時。過濾收集沉淀，用水充分洗滌后再用少量的CH3CN洗滌，真空干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)二 氧六環(huán)重結(jié)晶后得到1.40克的目標(biāo)化合物2，產(chǎn)率67%。1HNMR(CDCI3)測定結(jié)果8. 86 (d, J = 8. 4Hz，2H)，8. 79(s，2H)，8· 02 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 76 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 10 (d, J = 8. 4Hz,2H)，3. 92 (s, 3H)。 (3) 4，- (4-甲氧基苯基)-2，2， 6，，2 ” -聯(lián)三吡啶-6，6 ” - 二甲酸二甲酯(化合物 3)的合成 將1. 56克的化合物2(4. Ommol)加入50mL的40%氫溴酸與25mL的冰乙酸中， 110°c下攪拌反應(yīng)8小時后反應(yīng)液倒入200mL的冰水中，過濾收集沉淀，水充分洗滌后真空 干燥。將產(chǎn)物加入到含有在4. 77克氯化亞砜(40. Immol)的120mL甲醇溶液中，攪拌回流 18小時后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物用飽和NaHCO3水溶液及純水洗滌后，真空干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)二氧六環(huán)重結(jié)晶后得到1. 17克的目標(biāo)化合物3，產(chǎn)率64%。1HNMR(CDCI3)測定結(jié)果8. 84 (d, J = 8. 0Hz, 2H) ,8. 79(s，2H)，8· 19 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 03 (t, J = 8. OHz, 2H) 7. 88 (d, J = 8. 8Hz，2H)，7. 06 (d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 07(s，6H)，3. 90(s，3H)。(4) 6，6”-二羥甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶(化合物4)的 合成將1. 50克的化合物3 (3. 3mmol)及0. 50克的NaBH4 (13. 2mmol)加入60mL的無水乙醇 中，反應(yīng)液室溫攪拌2小時后，再回流攪拌8小時。減壓蒸除溶劑，加入IOmL的飽和NaHCO3 水溶液，回流攪拌10分鐘，反應(yīng)液倒入30mL的冰水中。過濾收集沉淀，用水充分洗滌后再 用少量的CH3CN洗滌，真空干燥，得到1.22克的目標(biāo)化合物4，產(chǎn)率93%。1HNMR(⑶Cl3)測 定結(jié)果8. 68(s，2H)，8· 58 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (t, J = 8. OHz, 2H) ,7. 82 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7. 29 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7. 08 (d, J = 8. 8Hz，2H)，4. 88(s，4H)，4. 06 (br, 2H), 3. 91 (s, 3H)。(5) 6，6”-二溴甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物5) 的合成將3. 65克PBr3 (13. 5mmol)加入70mL的干燥二甲基甲酰胺，室溫攪拌15分鐘后 加入2. 17克的化合物4(5. 4mmol)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時。溶液中加入飽和NaHCO3水溶 液中和，過濾收集沉淀，用水充分洗滌后，再用少量ch3cn洗滌，真空干燥，得到2. 67克的 目標(biāo)化合物 5，產(chǎn)率 94%。1HNMr(CDCI3)測定結(jié)果8. 73 (s，2H)，8. 57 (d，J = 7.6Hz，2H)， 7. 86-7. 92(m，4H)，7. 51(d，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，4· 69 (s，4Η)，3· 91 (s， 3H)。(6) 6，6”-二溴甲基-4，- (4_羥基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物6)的 合成在0°C氬氣氛圍下將含有2. 82克BBr3 (11. 3mmol)的15mLCH2Cl2溶液慢慢滴加入 含有1. 48克的化合物5(2. 8mmol)的130mLCH2Cl2溶液中，反應(yīng)液在攪拌下逐漸升至室溫 并繼續(xù)攪拌過夜。滴加入80mL的冷水，攪拌30分鐘后，過濾收集沉淀，用水充分洗滌，真空 干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)甲醇重結(jié)晶后得到0. 71克的目標(biāo)化合物6，產(chǎn)率49%。1HNMR(DMSO-CI6)測 定結(jié)果8. 67(s，2H)，8. 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 08 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 81 (d，J = 8. 4Hz, 2H),7. 71 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 02 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 87(s，4H)。(7)4，-(4-羥基苯基)-2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸乙酯(化合 物7)的合成在氬氣氛圍下將0. 13克NaH(5.4mm0l)加入到含有1.02克二乙酸乙酯基胺 (5. 4mmol)的60mL干燥CH3CN中，室溫攪拌15分鐘后加入1. 15克的化合物6 (2. 2mmol)。室 溫攪拌14小時后過濾收集濾液，蒸除溶劑，產(chǎn)物再溶于20mLCHCl3中，用20mL水洗滌CHCl3 溶液2次，無水Na2SO4干燥有機相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物用硅膠柱分離，淋洗劑為1 1的 石油醚-乙酸乙酯，產(chǎn)物再用1 5的乙醇-水重結(jié)晶得到0.67克的目標(biāo)化合物7，產(chǎn)率 41%。1HNMr(CDCI3)測定結(jié)果8. 61(s，2H)，8. 53(d，J = 7. 6Hz，2H)，7. 88 (t，J = 7. 6Hz, 2H)，7· 69(d, J = 8. 4Hz，2H)，7· 66(d, J = 8. 0Hz，2H)，7· 97(d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 22(s，4H)， 4. 16 (q, J = 7. 2Hz，8H)，3. 70(s，8H)，1. 23 (t, J = 7. 2Hz, 12H)。(8)4，-[4-(3-氨基-4-硝基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶 _6，6” - 二 甲胺四乙酸乙酯(化合物8)的合成
在氬氣氛圍下將0.024克NaH(LOmmol)加入到含有0. 73克化合物7 (1. Ommol) 的35mL干燥CH3CN中，室溫攪拌15分鐘后加入0. 23克的5-氟-2-硝基苯胺(1. 5mmol)。 反應(yīng)液50°C下攪拌8小時，過濾收集濾液，蒸除溶劑，產(chǎn)物再溶于20mLCHCl3中，用2OmL水 洗滌CHCl3溶液2次，無水Na2SO4干燥有機相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以2 1的石油醚-乙酸 乙酯為淋洗劑用硅膠柱分離純化，得到0.71克的目標(biāo)化合物8，產(chǎn)率82%。1HNMR(⑶Cl3)測 定結(jié)果8. 71(s，2H)，8. 56 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 13 (d, J = 9. 6Ηζ，1Η)，7· 92 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7· 88 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7· 65 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 22 (d, J = 8. 0Hz，2H)，6· 39 (d, J = 9. 6Hz, 1H), 6. 35 (br, 2H), 6. 27 (s, 1Η), 4. 21 (s, 4Η), 4. 16 (q, J = 7· 2Hz，8Η)，3· 70 (s，8Η)， 1. 24 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(9)4’ -[4_(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2”-聯(lián)三吡啶 _6，6” - 二甲胺 四乙酸乙酯(化合物9)的合成將0. 82克化合物8(0. 95mmol)溶于40mL乙醇后加入0. 05克10%的Pd/C催化 劑，在氬氣氛圍下滴加入20mL含有1. 0克NaH2PO2 (11. 4mmol)的水溶液，反應(yīng)液攪拌回流6 小時，過濾除去Pd/C催化劑，濾液減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于20mL的CHCl3中，用20mL水洗 滌CHCl3溶液2次，無水Na2SO4干燥有機相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以1 5的石油醚-乙酸乙 酯為淋洗劑用硅膠柱分離純化，得到0. 46克的目標(biāo)化合物9，產(chǎn)率58%。1HNMR(⑶Cl3)測 定結(jié)果8. 68(s，2H)，8· 54 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 86 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 83 (d, J = 8. 8Hz, 2H)，7· 63(d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 09(d, J = 8. 8Hz，2H)，6· 72(d, J = 8. OHz, 1H)，6· 50 (s, 1H)，
6.46 (d, J = 8. OHz, 1Η)，4· 19(s，4H)，4· 16 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 70(s，8H)，1. 23 (t, J =
7.2Hz,12Η)。(IO)DATTA 的合成在氬氣氛圍下將0. 46克的化合物9 (0. 55mmol)加入0. 93克K0H_20mL乙醇_5mL 水的溶液中，室溫攪拌24小時后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的鹽 酸調(diào)節(jié)溶液的PH值到2-3，室溫攪拌3小時。過濾收集沉淀，用水洗滌后真空干燥。將產(chǎn) 物加入20mL的干燥CH3CN中，攪拌回流10分鐘，過濾收集沉淀真空干燥，得到0. 24克的 目標(biāo)化合物 DATTA，產(chǎn)率 60%。1MR(DMSO-Cl6)測定結(jié)果8. 65 (s，2H)，8. 53 (d，J = 7. 6Hz, 2H)，8. 01(t，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 62 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，6. 59 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，6. 35 (s, 1Η)，6. 22 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，4. 10(s，4H)， 3. 57(s，8H)。13CNMR (DMS0-d6)測定結(jié)果:172· 93，160. 6，159. 05，156. 0，154. 80，149. 25， 147. 72，138. 42，137. 53，131. 17，128. 79，123. 89，119. 83，117.85，115.99，108.74，106.89， 59. 54，54. 91。元素分析測定結(jié)果計算值(C37H35N7O9 · 1. 5H20) =C = 59. 35%,H = 5. 12%, N = 13. 09% ；測定值C = 58. 96%，Η = 5. 08%，Ν = 12. 94%。質(zhì)譜(ESI-MS)測定結(jié)果 m/z = 720. 2[Μ-ΗΓ。實施例2 =DATTA的乙酸亞甲基酯(簡稱AM-DATTA)的合成在氬氣氛圍下將11. 58毫克的DATTA · 1. 5Η20(15. 5 μ mol)溶于193微升的二甲 基亞砜中，加入61微升的乙酸溴甲基酯(618 μ mol)及89微升的三乙基胺(617 μ mol)，溶 液室溫下攪拌14小時，離心除去微量的不溶物后，上清液即為AM-DATTA的溶液，4°C保存待 用。質(zhì)譜(ESI-MS)測定結(jié)果m/z = 1009.8，[M+H]+。實施例3 =DATTA與NO反應(yīng)產(chǎn)物(簡稱BPTTA)的合成
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(1)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸乙酯(化合物10)的合成將430 毫克 4，- [4- (3，4_ 二氨基苯氧基)苯基]_2，2，:6，，2 ”-聯(lián)三吡啶 _6，6，，- 二 甲胺四乙酸乙酯(實施例1中化合物9，0. 52mmol)溶于含有63毫克乙酸的4mL水中，5°C 下滴加入含有43毫克NaNO2 (0. 62mmol)的2mL水溶液，5°C下攪拌10分鐘后再室溫攪拌5 小時。反應(yīng)液中加入20mL的CHCl3攪拌10分鐘，分出有機相。用20mL水洗滌CHCl3溶液 2次，無水Na2SO4干燥有機相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以1 2的石油醚-乙酸乙酯為淋洗劑用 硅膠柱分離純化，得到171毫克的目標(biāo)化合物，產(chǎn)率39%。1HNMR(⑶Cl3)測定結(jié)果8. 64(s, 2H)，8· 54 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 93 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，7· 85 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 79 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，7· 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 34 (s，1Η)，7· 17 (d, J = 7. 6Hz, 1Η)，7· 12 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 22(s，4H)，4· 15 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 71(s，8H)，1. 20 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(2)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸(BPTTA)的合成將171毫克的化合物10 (0. 20mmol)加入336毫克K0H_20mL乙醇_5mL水的溶液 中，室溫攪拌24小時后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的鹽酸調(diào)節(jié) 溶液的PH值到2-3，室溫攪拌3小時。過濾收集沉淀，用水洗滌后真空干燥。將產(chǎn)物加入 IOmL的干燥CH3CN中，攪拌回流10分鐘，過濾收集沉淀真空干燥，得到56毫克的目標(biāo)化 合物 BPTTA，產(chǎn)率 38%。1HnMR(DMSO-CI6)測定結(jié)果8. 71 (s，2H)，8. 58 (d，J = 7. 6Ηζ,2Η), 8. 07-8. 00(m，5H)，7· 66 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 54 (s，1H)，7· 28-7. 26(m，3H)，4· 20(s，4H)， 3. 68(s，8H)。13CNMR(DMS0-d6)測定結(jié)果172. 55，158. 75，158. 23，156. 02，154. 66，149. 10， 138. 63，133. 02，129. 29，128. 67，124. 13，120. 05，119. 54，118. 14，59. 49，54. 90。元素分析 測定結(jié)果計算值(C37H32N8O9 · 4H20) =C = 55. 20%,H= 5.01%,N= 13. 92% ；測定值C = 55. 41%, H = 4. 88%, N = 14. 12%0 質(zhì)譜(ESI-MS)測定結(jié)果:m/z = 731. 3[Μ_ΗΓ。實施例4 探針DATTA-Eu3+及其與NO反應(yīng)產(chǎn)物BPTTA-Eu3+的性質(zhì)測定(1)光譜性質(zhì)用ρΗ值為7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液作為溶劑測定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+(兩種配合物中配位體與金屬離子的摩爾比為1 1)的紫外可見光譜、熒光光 譜、摩爾消光系數(shù)(ε)、熒光量子收率(φ)及熒光壽命(τ)。紫外可見光譜測定用儀器為 Perkin Elmer Lambda 35型分光光度計，熒光測定儀器為Perkin Elmer LS 50B熒光分光 光度計，熒光量子產(chǎn)率使用4’ -苯基_2，2，6’，2”_聯(lián)三吡-6，6”_ 二甲胺四乙酸與Eu3+ 及Tb3+的配合物作為標(biāo)準(zhǔn)物按文獻方法測得(文獻16 :M. Latva, H. Takalo, J. Kankare, J. Lumin. 1997,75,149)。測定結(jié)果見表 1。表1. DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+在硼酸緩沖溶液中的吸收及熒光性質(zhì)
化合物最大吸收波 長(nm)^326 nm (Cm-1Iiior1L)最大發(fā)光波 長(nm)Φ (%)熒光壽命 (ms)DATTA-Eu3+292,3262.03χ1046120.251.08BPTTA-Eu3+293,3262.05χ10461211.81.30
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由表1可見，探針DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)前后其熒光量子產(chǎn)率發(fā)生了很大的變化， DATTA-Eu3+的熒光量子產(chǎn)率只有0. 25%，而BPTTA-Eu3+的熒光量子產(chǎn)率達到了 11. 8%，表 明探針DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)后其量子產(chǎn)率增加了 47倍。DATTA-Eu3+與NO的化學(xué)反應(yīng)式 如圖2所示，兩種化合物的熒光光譜如圖3所示。(2)溶液pH值對DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+熒光性質(zhì)的影響用不同pH值的0. 05mol/L的硼酸緩沖溶液作為溶劑測定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+在不同pH值下的熒光強度與熒光壽命，結(jié)果見圖4及圖5。由圖4可見，當(dāng)pH大 于6時，DATTA-Eu3+的熒光非常微弱且穩(wěn)定，但當(dāng)pH小于6時，DATTA-Eu3+的熒光隨著溶液 酸度的增加而逐漸變強，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是在酸性溶液中DATTA的2個氨基可發(fā)生質(zhì) 子化反應(yīng)，導(dǎo)致其對銪配合物發(fā)光部位的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移消光作用減弱。與DATTA-Eu3+相 比，BPTTA-Eu3+在pH小于6的溶液中可發(fā)出很強的熒光且強度不受pH的影響，但當(dāng)pH大 于6時，BPTTA-Eu3+的熒光隨著溶液酸度的減小而逐漸變?nèi)?，這是由于在堿性溶液中BPTTA 的三唑環(huán)上的氫可發(fā)生電離形成三唑環(huán)負離子，導(dǎo)致其對銪配合物發(fā)光部位的光誘導(dǎo)電子 轉(zhuǎn)移消光作用增強。總體來看，在生理PH值范圍內(nèi)，BPTTA-Eu3+與DATTA-Eu3+的熒光強度 比值很大(在pH = 6. 5和pH = 7. 4時兩者的熒光強度比值分別為50. 5和47. 4)，說明 DATTA-Eu3+可作為熒光探針用于生理條件溶液中NO的高靈敏測定。另外，圖5結(jié)果說明 DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+的熒光壽命基本不受溶液pH值的影響。 (3)探針DATTA-Eu3+對NO測定的選擇性分別考察了活性物種H2O2、· 0H、0C1_、單線態(tài)氧(1O2)、N02_、N03_、0N00_、02_ 以及 NO 與探針DATTA-Eu3+的反應(yīng)情況，在相同濃度與反應(yīng)條件(所有反應(yīng)都在0. 05mol/L的pH值 7. 4的硼酸緩沖溶液中室溫下進行，反應(yīng)時間為1小時，DATTA-Eu3+濃度=0. 1 μ mol/L ；活 性物種濃度= ο μ mol/L)下9種活性物種與DATTA-Eu3+反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度測定結(jié)果如 圖6所示(測定儀器為PerkinElmer Victor 1420時間分辨熒光測定儀)。由圖6可見， 探針DATTA-Eu3+與H2O2、· OH、0ClV02、N02_、N03_、0N00_、02_反應(yīng)后的熒光強度沒有發(fā)生明 顯變化，表明DATTA-Eu3+不與這些活性物種發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)后，由于形 成了強熒光性的BPTTA-Eu3+，導(dǎo)致探針的熒光強度顯著增強。上述結(jié)果表明探針DATTA-Eu3+ 對NO測定具有很好的選擇性。實施例5 使用DATTA-Eu3+測定水溶液中NO的濃度在pH值為7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中分別加入DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)和 不同濃度的N0，攪拌反應(yīng)0.5小時后測定熒光強度。測定用儀器為Perkin Elmer LS 50B 熒光分光光度計，測定結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，伴隨著NO濃度的增加，探針的熒 光強度也逐漸增加，表明DATTA-Eu3+可用于定量測定溶液中生成的NO的濃度。圖8給出了使用DATTA-Eu3+檢測NO的工作曲線(測定儀器為Perkin ElmerVictor 1420時間分辨熒光測定儀)。如圖所示，NO的濃度與熒光強度具有很好的線性關(guān)系，用本 底信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計算最低檢出限為8. 4nmol/L，表明使用DATTA-Eu3+定量檢測NO具 有很高的靈敏度。實施例6 探針DATTA-Eu3+用于植物細胞中內(nèi)源性NO的熒光成像測定將培養(yǎng)中的桅子細胞過濾收集后加入到含有200 μ mol/L的AM-DATTA及 200 μ mol/L的EuCl3的等滲鹽溶液中形成密度為每毫升1. 7 X IO5細胞的懸浮液，在室溫下振蕩培養(yǎng)。每隔一段時間取一定量的細胞液在4°C下每分鐘600轉(zhuǎn)離心5分鐘后，用等滲 鹽溶液充分洗滌除去未進入細胞的配合物，將洗滌后的細胞置于載玻片上進行明場成像、 熒光成像及時間分辨熒光成像測定(測定用儀器為配有時間分辨熒光成像功能的Nikon TE2000-E 型倒置式熒光顯微鏡，見文獻 17 :B. Song, G. L. Wang，Μ. Q. Tan, J. L. Yuan, J. Am. Chem. Soc. 2006，128，13442)。 圖9給出了不同培養(yǎng)時間下桅子細胞的成像測定結(jié)果，由圖可見，隨著培養(yǎng)時間 的增加，細胞發(fā)出的熒光也明顯增強，表明在培養(yǎng)過程中桅子細胞內(nèi)可持續(xù)產(chǎn)生NO。通過對 細胞的熒光強度分布進行分析，發(fā)現(xiàn)細胞核區(qū)域的熒光強度要明顯高于細胞質(zhì)區(qū)域，說明 植物細胞內(nèi)NO的生成發(fā)生在細胞核區(qū)域。另外，與常規(guī)熒光成像結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)，時間 分辨熒光成像中不存在細胞的背景熒光，表明時間分辨熒光成像測定方式可有效消除生物 樣品背景熒光對測定的干擾。
權(quán)利要求
一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針，其特征在于以三價銪離子與有機配位體4’ [4 (3，4 二氨基苯氧基)苯基] 2，2’6’，2” 聯(lián)三吡啶 6，6” 二甲胺四乙酸形成的配合物為一氧化氮熒光探針，其中所述有機配位體結(jié)構(gòu)式為。FDA0000023363620000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針，其特征在于與細 胞共培養(yǎng)進入細胞的三價銪離子與有機配位體4’ _[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2’: 6’，2”_聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亞甲基酯形成的配合物為一氧化氮熒光探 針，其中所述有機配位體結(jié)構(gòu)式為
3.權(quán)利要求1或2所述一氧化氮熒光探針的應(yīng)用，其特征在于在各類生物及非生物 體系中，利用所述的銪配合物熒光探針與體系中的NO特異性反應(yīng)，使得探針的熒光發(fā)光顯 著增強，然后通過熒光測定法來確定NO的生成量及分布情況；所述熒光測定法包括常規(guī)的 熒光分光光度計測定法、時間分辨熒光分光光度計測定法、熒光顯微鏡成像測定法或時間 分辨熒光熒光顯微鏡成像測定法。
4.根據(jù)3所述的應(yīng)用，其特征在于所述一氧化氮測定用銪配合物熒光探針用于含有 其組份的測定試劑盒及相關(guān)試劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于一氧化氮特異性熒光測定的新型銪配合物熒光探針及其應(yīng)用。該探針是以三價銪離子與有機配位體4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’6’，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物(簡稱DATTA-Eu3+)，其中所述有機配位體結(jié)構(gòu)式為該探針在生理pH值的含氧水溶液中可以特異性地與一氧化氮反應(yīng)，導(dǎo)致探針的熒光強度增加47倍以上，從而實現(xiàn)對體系中一氧化氮的選擇性熒光測定。
文檔編號G01N21/64GK101921586SQ20101022816
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者葉志強, 王桂蘭, 袁景利, 陳永剛 申請人:大連理工大學(xué)