專利名稱：一種炭疽芽孢桿菌的抗原膠體金檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種炭疽芽孢桿菌抗原的檢測試紙和在
檢測炭疽芽孢桿菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炭疽是由炭疽桿菌所引起的一種人畜共患急性傳染病。人們從認(rèn)識這種疾病并與 其斗爭已經(jīng)有100多年的歷史，積累了豐富的防治經(jīng)驗(yàn)。然而，目前階段，炭疽對人類仍然 構(gòu)成威脅，在世界各地頻繁出現(xiàn)爆發(fā)流行，特別是在發(fā)展中國家。近年來在非洲最嚴(yán)重的人 間流行發(fā)病達(dá)萬余人，每年有大批的牲畜死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，人類炭疽病例也不斷 發(fā)生。 人是通過直接或間接接觸感染動物而發(fā)病，主要是剝食病畜肉、吸入污染炭疽芽 孢的氣溶膠而感染。所以，人類發(fā)病多為繼發(fā)感染，其傳染源為患病的草食動物。動物炭疽 通常是食入了被污染的水、草后感染炭疽。人類對炭疽普遍易感，其感染途徑經(jīng)消化道、呼 吸道或皮膚接觸而使人致病。其中皮膚炭疽是最常見的形式，易發(fā)生于接觸污染的動物或 動物制品的工業(yè)或農(nóng)業(yè)部門中。 現(xiàn)有的免疫學(xué)檢測方法常采用莢膜抗體作酶標(biāo)或熒光抗體染色進(jìn)行診斷，分子生 物學(xué)有PCR方法，還有多種傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、溶血性實(shí)驗(yàn)、莢膜染色、噬 菌體裂解實(shí)驗(yàn)、串珠實(shí)驗(yàn)等，但上述方法耗時(shí)長，而且必須進(jìn)行大量的純化細(xì)菌，要求購買 昂貴的儀器，操作繁瑣復(fù)雜，需要專業(yè)人士具備熟練的操作技能才能準(zhǔn)確檢測。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種方便、快捷地檢測炭疽芽孢桿菌的試紙。該試紙的 工作原理是利用特異性抗原_抗體的結(jié)合，用膠體金標(biāo)記抗體，與待檢抗原結(jié)合后，使與試 紙上結(jié)合的捕獲抗體顯色。 本實(shí)用新型能夠基于一份標(biāo)本和一個(gè)試紙，快速方便地檢測出標(biāo)本中的炭疽芽孢 桿菌或芽孢，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。 本實(shí)用新型涉及一種方便、快捷地檢測炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，它包含 (1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊； (3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗炭疽芽孢桿菌疫苗株sterne (St)多克隆抗體條 帶和質(zhì)控兔抗羊IgG的條帶； (4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的炭疽芽孢桿菌抗體。 本發(fā)明涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，它還包含樣品墊，該樣品墊的材料
選自聚脂膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖維。 本發(fā)明涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，其中反應(yīng)支持物選用PVC板。 本發(fā)明涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。[0015] 本發(fā)明涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，其中金標(biāo)抗體保護(hù)膜的材料選自聚 脂膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標(biāo)記的羊抗St抗體。 另一方面，本發(fā)明涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，其中，吸水墊、硝酸纖維 膜、金標(biāo)抗體保護(hù)膜、樣品墊和反應(yīng)支持物按照附圖1所示方式構(gòu)成；反應(yīng)支持物5位于底 層，硝酸纖維膜2位于反應(yīng)支持物5上的中部，該膜的T處是兔抗St多克隆抗體包被的檢 測條帶，并且C處是兔抗羊IgG包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體保護(hù)膜3位于硝酸纖維膜上部的 一側(cè)并與之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的羊抗St多克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維 膜2上部的相對于金標(biāo)抗體保護(hù)膜3而言的另一側(cè)并與2部分重疊；樣品墊4位于2上與 l相反的一側(cè)并與3部分重疊。 又一方面，本實(shí)用新型涉及的上述炭疽芽孢桿菌的檢測試紙，以吸水墊一側(cè)為起 始端，樣品墊一側(cè)為末端，羊抗St多克隆抗體的檢測條帶位于接近末端，兔抗羊IgG包被的 質(zhì)控條帶接近于起始端。 本實(shí)用新型檢測炭疽芽孢桿菌的試紙的制備方法，該方法包括以下步驟膠體金
探針的制備，金標(biāo)墊的制備，硝酸纖維膜的噴涂包被。 1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制為0. 01 %水溶液，磁力攪拌下準(zhǔn)確加入lml 1 %的HAuCl4，同 時(shí)加入1. 5-3ml 1 %的檸檬酸三鈉水溶液，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水補(bǔ)足 至100ml，4t:避光保存； (2)用K2C03調(diào)ra值為約7-9，優(yōu)選為約7. 8-8. 9，更優(yōu)選約8. 2-8. 5 ; (3)將膠體金調(diào)至pH 8. 2-8. 5，用5mM PB(pH 7. 2)稀釋抗體至0. 2mg/ml ; (4)保持膠體金穩(wěn)定。 本實(shí)用新型還披露一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗體最佳標(biāo)記劑量的方法，該方法 包括 a.取10只潔凈的1. 5ml離心管，分別加入膠體金溶液lml ; b.在1-10號管內(nèi)分別力B入10ii l、20ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii 1、70ii 1、
80iil、90iil、100ii1的5mM PB，再依次加入稀釋好的0. 2mg/ml的待標(biāo)記抗體90iU、
80 ii l、70ii l、60ii l、50ii l、40ii l、30ii l、20ii 1、10ii 1、0ii l，混勻，放置2分鐘； c.在10個(gè)管內(nèi)分別加入10% NaCl溶液100 iU，混勻后室溫靜置2小時(shí)，觀察顏
色變化。 未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的變化， 而加入抗體量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(l號管)相比， 顏色最接近、含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為lml膠體金所必須的抗體穩(wěn)定 劑量，在此基礎(chǔ)上再加20%單抗，即為抗體最佳標(biāo)記劑量。本實(shí)用新型經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)和分 析，得出的結(jié)果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為8-15ug，優(yōu)選抗體量10-12ug，更優(yōu)選 10. 5-11.5ug，最優(yōu)選為llug。 2、金標(biāo)墊的制備 取上述pH的膠體金以lml/管分裝于1.5ml的離心管中。每支管中加入8-15ug 標(biāo)記劑量，優(yōu)選抗體量10-12ug，更優(yōu)選10. 5-11. 5ug，最優(yōu)選為llug的抗體，輕搖混勻后放 置。每管中加入10X的BSA100ia，混勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000rpm、4t:下離心30分鐘，棄上清液。每支離心管中加入lml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上 清液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， 1000rpm，離心10分 鐘；取上清液，均勻滴在lcm寬的玻璃纖維上，37t:干燥。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機(jī)以50mm/s的噴膜速度包被兔抗St多克隆抗體和質(zhì)控兔 抗羊IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜； 在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是10-100mm/s，更優(yōu)選是45-55mm/s，最 優(yōu)選是50mm/s ;所述兔抗St多克隆抗體，其加入量為l_5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液 可以為PBS ;質(zhì)控兔抗羊IgG可以購自鼎國生物技術(shù)公司，其濃度為0. l-5mg/ml更優(yōu)選是 0. 5-2. 5mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml ; (2)制備含有膠體金標(biāo)記的羊抗St的金標(biāo)抗體保護(hù)膜，具體為將膠體金標(biāo)記的 羊抗St均勻涂布在玻璃纖維膜上來制備，其中，抗體用PB稀釋，pH為7-9，優(yōu)選7. 5-9，最
適ra值為8. 5。 本實(shí)用新型所述試紙?jiān)跈z測炭疽芽孢桿菌中的應(yīng)用，參見附圖2。 利用本實(shí)用新型試紙檢測炭疽芽孢桿菌的方法中，先將待測標(biāo)本放入裝有稀釋液 的小瓶內(nèi)，再用移液器將樣品混合液加入試紙"4"處(即末端)，樣品中的液體依靠虹吸作 用上行，一般需10-15分鐘判讀結(jié)果 如標(biāo)本中含有炭疽芽孢桿菌，則它將與試紙上膠體金標(biāo)記的炭疽芽孢桿菌多克隆 抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜上的炭疽芽孢桿菌多克隆抗體結(jié) 合，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。 無論是否含有相對應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記多克隆抗體繼續(xù)隨液體繼續(xù)上行并與該 膜上的兔抗羊IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失 效，此線就不會出現(xiàn)，說明試紙失效。 陽性結(jié)果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標(biāo)免疫分析儀進(jìn)行半定量檢測。 本實(shí)用新型的技術(shù)方案是采用純化的炭疽芽孢桿菌多克隆抗體、和兔抗羊IgG 分別固相于硝酸纖維膜上，結(jié)合膠體金標(biāo)記的羊抗炭疽多抗，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法的 原理檢測標(biāo)本中的炭疽芽孢桿菌。

圖1A本實(shí)用新型試紙的正面示意圖。 圖1B本實(shí)用新型試紙的側(cè)面示意圖。 其中，圖1A和1B :1 :吸水墊；2 :硝酸纖維膜(A :包被抗St多克隆抗體檢測條帶； C :包被兔抗羊IgG的質(zhì)控條帶)；3 :含有膠體金標(biāo)記羊抗St多克隆抗體的玻璃纖維膜；4 : 樣品墊；5 :反應(yīng)支持物。
圖2 :檢測結(jié)果示意圖；T、 C兩條線陽性；C 一條線陰性；無效。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本實(shí)用新型，但不用來限制本實(shí)用新型的范圍。[0046] 實(shí)施例1、檢測炭疽芽孢桿菌的膠體金試紙的制備 1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制成0. 01 %水溶液，取100ml純水加熱至沸騰。磁力攪拌下準(zhǔn) 確加入lml 1%的HAuCl4，同時(shí)加入1. 5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定 后繼續(xù)加熱煮沸15分鐘，冷卻至室溫后加純水補(bǔ)足至100ml，4t:避光保存。 (2) K2C03調(diào)PH值為8. 28. 5左右。 (3)將膠體金調(diào)至適宜的pH，優(yōu)選8. 0-8. 5，更優(yōu)選8. 2，用5mMPB (pH 7. 2)稀釋抗
體至0. 2mg/ml 。 2、金標(biāo)墊的制備 取pH 8. 2的膠體金以lml/管的量分裝于1. 5ml的離心管中。每支管中加入最佳 標(biāo)記劑量的抗體，輕搖混勻后放置5分鐘或稍長，此步為抗體與金顆粒結(jié)合。每管中加入 10%的BSA100iU，混勻放置10分鐘或稍長，此步為封閉。將上面初步制得的膠體金探針 以12000rpm，離心30分鐘，4。C，棄上清。每支離心管中加入lml重懸液懸浮沉淀后同上離 心。棄上清，留下管底暗紅色疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， 1000rpm，離心 10分鐘；取上清液，均勻的滴加在lcm寬的玻璃纖維上，37。干燥2. 5-3小時(shí)。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機(jī)以50mm/s的噴膜速度包被兔抗St多克隆抗體(1. 5mg/ml) 和質(zhì)控兔抗羊IgG(購自鼎國生物技術(shù)公司，lmg/ml)兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜； (2)含有膠體金標(biāo)記羊抗St llug的玻璃纖維膜，PB稀釋；最適ra值為8. 5 實(shí)施例2、炭疽芽孢桿菌抗原檢測試紙 參見圖l，反應(yīng)支持物為6. 2cmX0. 4cm PCV板；吸水墊為2cmX0. 4cm的濾油紙； 1. 8cmX0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗兔IgG(購自鼎國生物技術(shù)公司，lmg/ml)，兔抗 S t多克隆抗體2mg/ml ;含有0. 4cmX0. 4cm膠體金標(biāo)記的兔抗St多克隆抗體(標(biāo)金濃度 llug PB稀釋；最適ra值為8. 5)玻璃纖維膜；樣品墊為2. 7cmX0.4cm的玻璃纖維；即形成 了炭疽芽孢桿菌抗原檢測試紙。 實(shí)施例3、檢測方法 參見附圖2，將待測標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再用移液器將樣品混合液加入試紙樣 品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結(jié)果 如含有炭疽芽孢桿菌抗原，則與試紙上膠體金標(biāo)記的羊抗St多抗形成相應(yīng)的復(fù) 合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流兔抗St多抗結(jié)合，形成紅色線條，即在"T"處形成紅 色條帶。 無論是否含有相對應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記多抗繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的兔抗 羊IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就 不會出現(xiàn)，說明試紙失效。 陽性結(jié)果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。 實(shí)施例4、 DJM-3定量金標(biāo)免疫分析儀半定量檢測 1、可先用檢測法檢測炭疽芽孢桿菌試紙條20個(gè)陰性值，利用金標(biāo)儀檢測試其T/C 的比值平均計(jì)算出炭疽芽孢桿菌試紙條的定閾值。
6[0065] 2、其次利用定閾值來用金標(biāo)儀機(jī)器檢測炭疽芽孢桿菌試紙條能達(dá)到的最低濃度。 3、判讀結(jié)果時(shí)大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。 本實(shí)用新型所述的試紙可以配合小型儀器可進(jìn)行半定量檢測，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié) 果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢 測，適合流行病學(xué)調(diào)查，并對炭疽芽孢桿菌的感染診斷起到輔助作用。
權(quán)利要求一種檢測試紙，其特征在于，它包含(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗炭疽芽孢桿菌疫苗株sterne(St)多克隆抗體條帶和質(zhì)控兔抗羊IgG的條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，該膜中含有膠體金標(biāo)記的炭疽芽孢桿菌抗體；(5)樣品墊；所述反應(yīng)支持物位于底層，所述硝酸纖維膜位于反應(yīng)支持物上的中部，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜位于硝酸纖維膜上部的一側(cè)并與之部分重疊，所述吸水墊位于硝酸纖維膜上部的相對于金標(biāo)抗體保護(hù)膜而言的另一側(cè)并與硝酸纖維膜部分重疊；所述樣品墊位于硝酸纖維膜上與吸水墊相反的一側(cè)并與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于，所述硝酸纖維膜上有T、C兩個(gè)標(biāo)記處，其 中T處是兔抗炭疽芽孢桿菌疫苗株sterne (St)多克隆抗體條帶，并且C處是質(zhì)控兔抗羊 IgG的條帶。
3. 根據(jù)上述權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于，所述吸水墊一側(cè)為起始端，所述樣品 墊一側(cè)為末端，所述檢測抗體的條帶位于接近末端，所述質(zhì)控條帶接近于起始端。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測試紙，該試紙包含(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有炭疽芽孢桿菌抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的炭疽芽孢桿菌抗體。本實(shí)用新型試紙可以配合小型儀器可進(jìn)行半定量檢測，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢測，適合流行病學(xué)調(diào)查，并對炭疽芽孢桿菌的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/543GK201464477SQ20092010571
公開日2010年5月12日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者孫肖紅, 張曉龍, 李偉, 楊宇, 王靜, 胡孔新, 謝士嘉 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院