專利名稱：一種檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)疾病檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及囊型包蟲(chóng)病的檢測(cè)試條及其制備方 法。
背景技術(shù)：
M-^t^M (echinococcosis)(Hydatid disease Hydatidosis), 是由棘球?qū)俳{蟲(chóng)的幼蟲(chóng)寄生于人、畜體內(nèi)引起的一種人畜共患寄生蟲(chóng)病，能感染人類 的棘球?qū)俳{蟲(chóng)有4種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲(chóng) (Echinococcus multilocularis, Em)、少節(jié)棘球緣蟲(chóng)(E. oligarthrus)禾口伏氏棘球會(huì)條蟲(chóng) (E. vogeli)。這4種棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)期形態(tài)不同，可引起不同類型的棘球蚴病。我 國(guó)有兩種棘球蚴病即細(xì)粒棘球蚴病(cystic echinococ-cosis，CE)又稱囊型包蟲(chóng)病，和多 MMW-M'-M (alveolar echinococcosis, AE) 31 禾爾ifeM^S^^；^!。包蟲(chóng)病是一個(gè)重要的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題，廣泛流行于歐、亞、非和地中海區(qū)域沿 岸國(guó)家，以及澳洲和南美。在我國(guó)包蟲(chóng)病主要流行于西部的農(nóng)牧區(qū)，其中新疆、青海、甘肅、 寧夏、西藏、內(nèi)蒙和四川西部最為嚴(yán)重，是世界上包蟲(chóng)病患病率最高的地區(qū)。此外，吉林、陜 西、云南、貴州和河南等省局部地區(qū)也有小范圍流行。包蟲(chóng)病流行區(qū)受威脅人口約7000萬(wàn)。 新近完成的全國(guó)寄生蟲(chóng)病調(diào)查結(jié)果表明流行區(qū)人群包蟲(chóng)病的患病率平均為1.084%。據(jù)此 推算，目前流行區(qū)約有病人38萬(wàn)人。由于B超診斷結(jié)果有一定的漏檢率，實(shí)際患病病人數(shù) 可能達(dá)60萬(wàn)人以上。血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)人群的感染率平均為11. 98%，感染人數(shù)約為700萬(wàn) 人。在四川甘孜洲普查人群5414人，查出感染者1624人，感染率達(dá)30. 5% ；包蟲(chóng)病患者709 人，患病率為13. 1%。包蟲(chóng)病需要手術(shù)或長(zhǎng)期服藥治療，其中泡型包蟲(chóng)病被稱為“蟲(chóng)癌”，10-15年的病死 率高達(dá)90%以上。漏診的包蟲(chóng)病患者失去治療時(shí)機(jī)而危及生命。包蟲(chóng)病不但給患者帶來(lái)極 大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且發(fā)病的高峰為20-50歲的青壯年，給社會(huì)帶來(lái)極大的壓力， 系西部農(nóng)牧區(qū)群眾因病致貧，因病返貧的重要原因。此外，由于包蟲(chóng)病在牛羊的感染率相當(dāng) 高(可達(dá)90%)，每年因包蟲(chóng)病也給我國(guó)畜產(chǎn)品造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億。因此包蟲(chóng)病不 但嚴(yán)重危害人民的生命健康，而且嚴(yán)重影響社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展、邊疆穩(wěn)定。我國(guó)政府對(duì)包蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅我國(guó)西部人民健康的問(wèn)題密切關(guān)注，已在四川設(shè)立了 中央支持地方包蟲(chóng)病防治項(xiàng)目。在政府的重視下，包蟲(chóng)病的防治工作將全面開(kāi)展，為滿足包 蟲(chóng)病診斷和現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查的需要，研制合適的包蟲(chóng)病檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。目前對(duì)包蟲(chóng)病的診斷極大地依賴影像學(xué)方法，如X光檢查、B型超聲診斷、CT掃描、 核磁共振等物理診斷方法。雖然影像學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用，且能對(duì)包塊損害的部位、大小和物 理性狀等做出較為明確的判斷，但不能進(jìn)行早期診斷(影像學(xué)診斷出的包蟲(chóng)病人已不太適 合藥物治療)，且對(duì)有些囊腫、膿腫或腫塊不能進(jìn)行有效鑒別而誤診。由于影像檢查設(shè)備攜 帶不便，加之昂貴，且對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，在疾病診斷與流行病學(xué)調(diào)查中(特別在 邊遠(yuǎn)地區(qū)連電力供應(yīng)都受到限制)的應(yīng)用受到限制。
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免疫學(xué)方法在包蟲(chóng)病診斷上的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，最有效的免疫學(xué)診斷方法 是應(yīng)用純化天然抗原或重組抗原檢測(cè)包蟲(chóng)病人特異抗體，常用檢測(cè)方法有間接血凝法 (Indirect haemagglutination assay ；IHA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印 漬法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ;EITBA),以及金標(biāo)免疫點(diǎn)印漬 法(Gold-labelled dot blotting ；⑶B ；俗稱膜法或滲濾法)。但這些方法或費(fèi)時(shí)費(fèi)力、或 需要冷鏈系統(tǒng)保存試劑、或?qū)x器設(shè)備及操作人員的要求較高而不適合現(xiàn)場(chǎng)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一組用于免疫學(xué)方法檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的試劑，用于檢測(cè) 包蟲(chóng)病以及病原體的種屬。本發(fā)明的另一目的是提供一種快速檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病以及病原體種屬的免疫層析 試條(Immuno-Chromatographic Aassay, ICA)。本發(fā)明的再一目的是提供一種快速檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病以及病原體種屬的免疫層析 試條的制備方法。本發(fā)明的第一方面，提供了一組用于免疫學(xué)方法檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病以及病原體種屬 的試劑，包括⑴囊型包蟲(chóng)病的天然抗原，⑵抗人IgG的標(biāo)記抗體；其中囊型包蟲(chóng)病天然抗原按如下方法制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離 心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于4°C下透析過(guò)夜，將透析過(guò)夜的包囊液6000r/ min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊性包蟲(chóng)病天然抗原；其中抗人IgG的標(biāo)記抗體是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他動(dòng)物獲得的多抗或 單克隆抗體，所說(shuō)的標(biāo)記酶標(biāo)計(jì)、膠體金標(biāo)記或者其他標(biāo)記。優(yōu)選的，所說(shuō)的標(biāo)記抗體是鼠 抗人IgG的單克隆抗體。更優(yōu)選的，所說(shuō)的標(biāo)記抗體是鼠抗人IgG4的單克隆抗體。本發(fā)明的第二方面，提供了一種快速檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病以及病原體種屬的免疫層析 試條，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊 緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金 標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測(cè)線；其中所述的檢測(cè)線由囊型包蟲(chóng)病的天然抗原組成，所述的囊型包蟲(chóng)病的天然抗原 為來(lái)源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液；所述的膠體金標(biāo)記抗體為以人IgG為抗原免疫動(dòng)物 獲得的抗體；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體組成。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，所述標(biāo)記抗體為以人IgG作為抗原免疫BALB/C小鼠獲得的 單克隆抗體，所述作為質(zhì)控線的抗抗體為羊抗鼠抗體。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度為1 10mg/mL，噴涂 量為10 μ L/cm2 ；膠體金標(biāo)記抗體濃度(以蛋白濃度計(jì))1 5mg/15 20mL ；羊抗鼠抗抗 體溶液濃度為0. 1 5mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2。所述支持檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素 膜；所屬支持膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊可以是濾血膜 樣品墊，所述的濾血膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素的混合物，適合 于全血樣品；所述樣品墊也可以是玻璃纖維或吸水紙樣品墊，適合于血清樣品；所述吸水
5墊由吸水材料制備，如吸水紙。所述纖維素膜寬度控制在2. 5 3. Omm ；所述吸水墊可寬度為20 40mm，厚度為 0. 1 0. 2mm ；所述金標(biāo)墊的寬度為5 IOmm ；所述樣品墊寬度為20 40mm。所述免疫層析試條背面可設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板，背板材料的選擇是多種多 樣的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等?？蓪⑺鰩в斜嘲宓拿庖邔游鲈嚄l裝入一個(gè)盒體中，該盒體對(duì)應(yīng)于濾血膜樣品墊 的部位設(shè)有檢測(cè)孔，對(duì)應(yīng)于檢測(cè)線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測(cè)窗。檢測(cè)樣品時(shí)將全血或血清 加入檢測(cè)孔中。本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備上述檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的方 法，包括以下步驟(1)制備囊型包蟲(chóng)病的天然抗原，將來(lái)源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度 調(diào)整到1 lOmg/mL ；制備膠體金標(biāo)記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗 體加入IOOmL膠體金溶液，離心取沉淀，復(fù)溶到15 20mL ；制備與膠體金標(biāo)記抗體特異結(jié) 合的抗抗體，將溶液濃度調(diào)整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲(chóng)病的天然抗原溶液噴到所述纖維素膜上形成檢測(cè)線，將能與膠體 金標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體溶液噴到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標(biāo)記抗體溶液，制備金標(biāo)墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離檢測(cè)線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素 膜的靠近檢測(cè)線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊上與所述纖維素膜相對(duì)的一端，得到檢測(cè) 囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，上述纖維素膜在噴有檢測(cè)線、質(zhì)控線后，先在37°C下干燥 0.5 2小時(shí)，再粘貼吸水墊。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，為使膠體金標(biāo)記抗體溶液與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結(jié) 合，可向膠體金標(biāo)記探針溶液中添加2% 10%的蔗糖；為使金標(biāo)墊更易于纖維素膜粘貼， 可將金標(biāo)墊在37°C下干燥0. 5小時(shí)，再與纖維素膜粘貼。本發(fā)明的免疫層析試條具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)敏感性及特異性高實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果 顯示，本發(fā)明的免疫層析試條總的敏感性可達(dá)87. 16%，特異性為97%; (2)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、 快速檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本處理簡(jiǎn)單，血清或全血都可以直接使用，無(wú)需處理，不需要專門儀器 和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，標(biāo)本中的抗體經(jīng)5 分鐘左右的紙層析后，即可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線，從而為包蟲(chóng)病人的治療爭(zhēng)取了時(shí)間，很 適合現(xiàn)場(chǎng)和基層使用；(3)制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在包 蟲(chóng)病的檢測(cè)及其相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)示意2、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)示意圖其中1為樣品墊2為金標(biāo)墊3為纖維素膜4為吸水墊5為檢測(cè)線6為質(zhì)控線7為背板
具體實(shí)施例方式樣品與抗棘球蚴抗體^ ^f (Hydatid disease Hydatidosis) X ^ # it ^J (echinococcosis) 病，是由棘球?qū)俳{蟲(chóng)的幼蟲(chóng)寄生于人、畜體內(nèi)引起的一種人畜共患寄生蟲(chóng)病，能感染人類 的棘球?qū)俳{蟲(chóng)有4種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲(chóng) (Echinococcus multilocularis, Em)、少節(jié)棘球緣蟲(chóng)(E. oligarthrus)禾口伏氏棘球會(huì)條蟲(chóng) (E. vogeli)。這4種棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)期形態(tài)不同，可引起不同類型的棘球蚴病。包 蟲(chóng)病患者體內(nèi)血液中含有能特異性結(jié)合所感染的棘球蚴抗原的抗棘球蚴抗體，檢測(cè)受試者 體內(nèi)血液中是否含有抗棘球蚴抗體，可作用受試者是否患有包蟲(chóng)病的指標(biāo)。本發(fā)明的的檢測(cè)包蟲(chóng)病以及病原體種屬的免疫層析試條適用于從囊型包蟲(chóng)病患 者體內(nèi)抽取的全血樣品和血清樣品。對(duì)于全血樣品，本發(fā)明的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病以及病原體 種屬的免疫層析試條中的樣品墊采用濾血膜樣品墊；對(duì)于血清樣品，本發(fā)明的檢測(cè)囊型包 蟲(chóng)病以及病原體種屬的免疫層析試條中的樣品墊可采用玻璃纖維或吸水紙樣品墊?？乖c檢測(cè)線可以將棘球蚴抗原固定在纖維素膜等支持物上作為固相抗原，用以捕獲受試者者 血樣中的抗棘球蚴抗體。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，將我國(guó)常見(jiàn)的細(xì)粒棘球蚴的天然抗 原(來(lái)源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液)固定在纖維膜上形成檢測(cè)線，該固相抗原可以捕 獲受試者血樣中相應(yīng)的抗棘球蚴抗體，在檢測(cè)線位置形成抗原抗體復(fù)合物沉淀。膠體金標(biāo)記抗體探針包蟲(chóng)病患者體內(nèi)血液中含有的抗棘球蚴抗體的優(yōu)勢(shì)抗體類型為IgG抗體，優(yōu)勢(shì)亞 類為IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4等亞類。膠體金標(biāo)記抗體探針采用抗人IgG抗體或抗 人IgG4抗體制備，該抗人IgG抗體或抗人IgG4抗體可以是購(gòu)買的商品化抗體，或按照常規(guī) 方法自行制備。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中采用膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG4的單克隆抗體 作為檢測(cè)探針，該膠體金標(biāo)記抗體附著于金標(biāo)墊上。檢測(cè)過(guò)程中，復(fù)溶的膠體金標(biāo)記抗體可 與受試者血樣中的人IgG4抗體結(jié)合，從而當(dāng)受試者血樣中存在包蟲(chóng)病特異性抗體時(shí)在檢 測(cè)線位置形成色帶。膠體金標(biāo)記抗體不限于鼠抗人IgG4的單克隆抗體，也可采用鼠抗人IgG的單抗或 多抗，或者采用其他動(dòng)物如兔抗人IgG抗體，同樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，這是領(lǐng)域的一 般技術(shù)人員都知曉的。質(zhì)控線可以將與膠體金標(biāo)記抗體特異性結(jié)合的抗抗體固定在纖維素膜上作為質(zhì)控線。在 本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方案中，膠體金標(biāo)記抗體是鼠抗人IgG4的單克隆抗體，相應(yīng)的，質(zhì)控線 采用羊抗鼠的抗抗體。無(wú)論待檢樣品中是否含有抗棘球蚴抗體，本發(fā)明的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病 以及病原體種屬的免疫層析試條中質(zhì)控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測(cè)過(guò)程是 否正常和免疫層析試條是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控線不限于羊抗鼠的抗抗體，只要能與選定的膠體金標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，同 樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，這是領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都知曉的。免疫層析試條
如圖所示，圖1為檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)圖，圖2為檢測(cè)包蟲(chóng) 病的免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)圖。檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條由吸水墊4、硝酸纖維 素膜(NC膜)3、金標(biāo)墊2和濾血樣品墊1四部分粘貼在PVC底板7上組成；硝酸纖維素膜3 上設(shè)有檢測(cè)線5和質(zhì)控線6。檢測(cè)原理與結(jié)果判斷測(cè)定時(shí)將樣本血清或全血加在濾血膜樣品墊1上，1分鐘后滴一滴(約50 μ L)樣 本稀釋液，稀釋液帶動(dòng)樣品按樣品墊1、金標(biāo)墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4的方向移動(dòng)，流 經(jīng)金標(biāo)墊2時(shí)使金標(biāo)墊2上的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)溶，并帶動(dòng)其向硝酸纖維素膜3、吸水墊4 移動(dòng)。膠體金標(biāo)記抗體(本發(fā)明實(shí)施例為鼠抗人抗體)可與樣品中的抗體或抗體亞類結(jié) 合，形成免疫復(fù)合物。此免疫復(fù)合物流至檢測(cè)線5時(shí)，若標(biāo)本中有待測(cè)抗體或抗體亞類(抗 囊型包蟲(chóng)病抗原的抗體)，即被檢測(cè)線5的特異性固相抗原所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的 檢測(cè)線5位置顯出紅色檢測(cè)線條；此免疫復(fù)合物流經(jīng)質(zhì)控線6時(shí)，即被質(zhì)控線6的固相抗體 (本發(fā)明實(shí)施例為羊抗鼠抗體)所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的質(zhì)控線6位置顯出紅色質(zhì)控 線條。 陽(yáng)性標(biāo)本既顯示檢測(cè)線，又顯示質(zhì)控線；陰性標(biāo)本沒(méi)有檢測(cè)線，僅顯示質(zhì)控線。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法；所述百 分含量如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/體積百分含量或體積/體積百分含量。實(shí)施例1、包蟲(chóng)病人血清對(duì)粗抗原的反應(yīng)分析及優(yōu)勢(shì)特異抗體亞類的分析1、針對(duì)囊型包蟲(chóng)病的天然抗原的制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于 4°C下透析過(guò)夜，將透析過(guò)夜的包囊液6000r/min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊液 粗抗原，凍干后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?、方法以ELISA法進(jìn)行分析，以囊液粗抗原為包被抗原分別與包蟲(chóng)病人、非包蟲(chóng) 病人和健康人血清進(jìn)行反應(yīng)，再以羊抗人IgGl抗體辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(購(gòu)自美國(guó)BD 公司)、鼠抗人IgE抗體辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(購(gòu)自美國(guó)BD公司)、鼠抗人IgG4抗體辣 根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(購(gòu)自美國(guó)BD公司)進(jìn)行識(shí)別，在酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)讀取OD值。 以20個(gè)非疫區(qū)健康人的酶標(biāo)OD值均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(X+2SD)定為陽(yáng)性閾值。3、結(jié)果如表1所示，用抗人IgG4抗體作為酶標(biāo)二抗檢測(cè)包蟲(chóng)病人血清的敏感性和 特異性都較好。表1包蟲(chóng)病人血清對(duì)粗抗原的反應(yīng)分析及優(yōu)勢(shì)特異抗體亞類的分析結(jié)果
8 實(shí)施例2、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的制備1、針對(duì)囊型包蟲(chóng)病的天然抗原的制備同實(shí)施例1。2、抗棘球蚴抗原的優(yōu)勢(shì)特異抗體亞類的單克隆抗體的制備按常規(guī)方法用人IgG4抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞融 合，融合成功能高效分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次克隆后注射小鼠生產(chǎn)腹水。采用常 規(guī)的飽和硫酸銨鹽析法對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行純化，用免疫瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抗體效價(jià)， 結(jié)果抗體滴度均大于1 128，表明獲得的單克隆抗體具有較好的特異性和親和性。3、制備免疫膠體金探針及金標(biāo)墊用下述方法制備鼠抗IgG4抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針及金標(biāo)墊1)采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4 (滬試牌購(gòu)于上 海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成0. 01 %水溶液，取IOOmL加熱至沸騰，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加 入1. 6mL的的檸檬酸三鈉水溶液，待液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液。2)確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度用0. 2M K2CO3調(diào)節(jié)步驟1)制備的膠體金溶液的pH值至9. 2，準(zhǔn)備5支潔凈試管， 分別加入ImL膠體金溶液。將步驟1)制備的經(jīng)純化的抗IgG4抗體稀釋為0. 5mg/mL,分別 向4支試管中加入20 μ L、25 μ L、30 μ L、35 μ L，另一支為空白對(duì)照，混勻后于室溫下放置5 分鐘，加入10% NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變 時(shí)所含最少抗體量即為穩(wěn)定ImL膠體金溶液所需抗體的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20%抗 體量即為膠體金偶聯(lián)抗體飽和溶液。結(jié)果維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為25 μ L，即 偶聯(lián)抗體濃度為12.5yg/mL。3)鼠抗人IgG4抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針及金標(biāo)墊的制備取50mL膠體金溶液，用0. 2M K2CO3調(diào)節(jié)pH值為8. 5 (8-8. 5均可)，按12. 5 μ g/mL 加入已純化的鼠抗IgG4抗體，得到含有濃度為12. 5 μ g/mL鼠抗人IgG4抗體的免疫膠體金 探針溶液50mL，攪拌1小時(shí)，再加入終濃度為0. 05% PEG20000，攪拌1小時(shí)，IOOOOrpm離心 30分鐘，棄上清，用20mM硼酸緩沖液洗滌沉淀，并將其保存于IOmL含5%蔗糖的20mM硼酸 緩沖液中，得到鼠抗人IgG4抗體標(biāo)記的膠體金探針溶液。取5mL鼠抗人IgG4抗體標(biāo)記的 膠體金探針溶液均勻加在玻璃纖維膜上，37°C下干燥0. 5小時(shí)，得到金標(biāo)墊。4、檢測(cè)包蟲(chóng)病的免疫層析試條的制備
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該試條的制備方法包括以下步驟1) NC膜的包被羊肝棘球蚴包囊液抗原包被用0. OlM pH7. 2PBS稀釋實(shí)施例1制備的棘球蚴包囊 液抗原至終濃度為2mg/mL，用于包被檢測(cè)線；質(zhì)控抗體羊抗鼠IgG(購(gòu)自捷寧生物公司)的包被用0. OlM pH7. 2PBS稀釋羊抗 鼠IgG至終濃度為0. 5mg/mL，用于包被質(zhì)控線；BIODOT公司XZ1000噴膜機(jī)將分別噴于300mm長(zhǎng)、25mm寬的硝酸纖維素膜(購(gòu)自 MILLIP0RE公司)上，噴涂量為10 μ L/cm2，形成一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，37°C下干燥1小 時(shí)。2)檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的制備用一塊單面涂了不干膠的PVC背板，中間粘貼上處理好的NC膜；NC膜靠近質(zhì)控線 的一端緊密粘貼吸水墊(購(gòu)于MILLIP0RE公司)；NC膜靠近質(zhì)控線的一端緊密粘貼金標(biāo)抗 體墊；金標(biāo)抗體墊另一端緊密粘貼濾血膜樣品墊(購(gòu)自WHATMAN公司)。得到檢測(cè)包蟲(chóng)病 的免疫層析試條，可按所需大小進(jìn)行切割，加干燥劑后密封保存。5、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的檢測(cè)包蟲(chóng)病的免疫層析試條裝入試劑盒中，加干 燥劑后密封保存。該試劑盒對(duì)應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點(diǎn)樣孔，對(duì)應(yīng)于檢測(cè)線和質(zhì)控線的部 位設(shè)有觀測(cè)窗。實(shí)施例3、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的制備用購(gòu)買自美國(guó)BD公司的鼠抗人IgG4單克隆抗體(貨號(hào)555881)制備膠體金標(biāo)記 抗體作為檢測(cè)探針，其他步驟同實(shí)施例2。實(shí)施例4、檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的實(shí)驗(yàn)室考核1、檢測(cè)方法于實(shí)施例1制備的免疫層析試條的濾血膜樣品墊加入待測(cè)血清，1分鐘后加入樣 本稀釋液(PBS) 1滴(約50 μ L)，2分鐘后開(kāi)始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。結(jié)果判定如 果檢測(cè)線5和質(zhì)控線6均出現(xiàn)紅色條帶，即判為囊型包蟲(chóng)病，如果僅有質(zhì)控線6出現(xiàn)紅色條 帶，即判為陰性。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果用本發(fā)明實(shí)施例2制備的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果 如表2所示。由表2可以看出本發(fā)明的免疫層析試紙的敏感性可達(dá)87. 16%，特異性可達(dá) 97%。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的免疫層析試條可用于囊型包蟲(chóng)病的快速檢測(cè)。表2本發(fā)明檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果 用本發(fā)明實(shí)施例3制備的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考核，結(jié)果 與表2所示結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例4、檢測(cè)包蟲(chóng)病的免疫層析試條的濾血效果考核1、樣品制備取確診包蟲(chóng)病人血清10份，正常人血清10份，正常人全血10份，確診囊型包蟲(chóng)病 人全血5份。用部分正常人全血離心去除血清，加入同樣量的包蟲(chóng)病人血清混合，成為包蟲(chóng) 抗體陽(yáng)性混合全血血樣。2、試驗(yàn)方法按實(shí)施例3的方法檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病人血清10份，包蟲(chóng)抗體陽(yáng)性混合全血血樣10 份，正常人血清10份，正常人全血10份，確診囊型包蟲(chóng)病人全血5份。其中檢測(cè)血清用量 20 μ L，檢測(cè)全血用量40 μ L。3、試驗(yàn)結(jié)果全血檢測(cè)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)和血清檢測(cè)結(jié)果完全一致，包蟲(chóng)抗體陽(yáng)性混合全血血樣的 反應(yīng)強(qiáng)度與加入的包蟲(chóng)病人血清的反應(yīng)強(qiáng)度完全一致。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的免疫層 析試條可用于囊型包蟲(chóng)病人全血血樣的快速檢測(cè)。本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各 個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的 內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)，所 述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于免疫學(xué)方法檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的試劑，包括以下組分(1)囊型包蟲(chóng)病的天然抗原；(2)抗人IgG的標(biāo)記抗體；所述的囊型包蟲(chóng)病天然抗原按如下方法制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于4℃下透析過(guò)夜，將透析過(guò)夜的包囊液6000r/min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊型包蟲(chóng)病天然抗原；所述的抗人IgG的標(biāo)記抗體是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他動(dòng)物獲得的多抗或單克隆抗體，所說(shuō)的標(biāo)記包括酶標(biāo)記、膠體金標(biāo)記或者其他標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)包蟲(chóng)病的試劑，其特征在于，其中所述的標(biāo)記抗體是鼠抗人 IgG的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的試劑，其特征在于，其中所述的標(biāo)記抗體是鼠 抗人IgG4的單克隆抗體。
4.一種快速檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，包括以下組分樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密 連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊 的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置一條檢測(cè)線；所述的檢測(cè)線由囊型包蟲(chóng)病的天然抗原組成，所述的囊型包蟲(chóng)病的天然抗原為來(lái)源于 羊肝棘球蚴包囊液的上清液；所述的膠體金標(biāo)記抗體為以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗 體；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，所述金標(biāo)墊的膠 體金標(biāo)記抗體為以人IgG作為抗原免疫小鼠獲得的單克隆抗體，所述質(zhì)控線為羊抗鼠抗抗 體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，羊肝棘球蚴包囊 液的上清液蛋白濃度為1 10mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2 ；膠體金標(biāo)記抗體濃度以蛋白濃 度計(jì)為1 5mg/15 20mL ；羊抗鼠抗抗體溶液濃度為0. 1 5mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中的任一項(xiàng)的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，所 述支持檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜選自硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述支持膠體金標(biāo) 記抗體的金標(biāo)墊選自玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊選自濾血膜、玻璃纖維或吸水紙，其 中濾血膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素混合物；所述吸水墊為吸水 紙。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，其中所述的纖維 素膜寬度為2. 5 3. Omm ；吸水墊寬度為20 40mm，厚度為0. 1 0. 2mm ；金標(biāo)墊的寬度為 5 IOmm ；樣品墊寬度為20 40mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，所述免疫層析試 條背面設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板，背板材料為塑料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條，其特征在于，將所述帶有背板 的免疫層析試條裝入一個(gè)盒體中，該盒體對(duì)應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有檢測(cè)孔，對(duì)應(yīng)于檢測(cè)線 和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測(cè)窗。
11.根據(jù)權(quán)利要求4的檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟(1)制備囊型包蟲(chóng)病的天然抗原，將來(lái)源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度調(diào)整 至Ij 1 10mg/mL ；制備膠體金標(biāo)記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體加入IOOmL膠 體金溶液，離心取沉淀，復(fù)溶到15 20mL ；制備與膠體金標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體，將溶液濃度調(diào)整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲(chóng)病的天然抗原溶液噴涂到所述纖維素膜上形成檢測(cè)線，將能與膠體金 標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體溶液噴涂到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標(biāo)記抗體溶液，制備金標(biāo)墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離檢測(cè)線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測(cè)線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊上與所述纖維素膜相對(duì)的一端，得到檢測(cè)囊型 包蟲(chóng)病的免疫層析試條。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備囊型包蟲(chóng)病的天然抗原，將來(lái)源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度調(diào)整 至Ij 1 10mg/mL ；制備膠體金標(biāo)記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體加入IOOmL膠 體金溶液，離心取沉淀，復(fù)溶到15 20mL，加入蔗糖使蔗糖的終濃度為2% 10% ；制備與膠體金標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體，將溶液濃度調(diào)整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲(chóng)病的天然抗原溶液噴到所述纖維素膜上形成檢測(cè)線，將能與膠體金標(biāo) 記抗體特異結(jié)合的抗抗體溶液噴到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線；將噴涂有檢測(cè) 線、質(zhì)控線的纖維膜在37°C下干燥0. 5 2小時(shí)；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標(biāo)記抗體溶液，制備金標(biāo)墊；將金標(biāo)墊在37°C下干 燥0.5小時(shí)；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離檢測(cè)線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測(cè)線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊上與所述纖維素膜相對(duì)的一端，得到檢測(cè)囊型 包蟲(chóng)病的免疫層析試條。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)囊型包蟲(chóng)病的免疫層析試條及其制備方法。該試條包括濾血膜樣品墊、緊密連接于所述濾血膜樣品墊的含有抗棘球蚴抗原優(yōu)勢(shì)特異抗體亞類的抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上設(shè)有一條檢測(cè)線和一條指控線；所述檢測(cè)線含有針對(duì)囊型包蟲(chóng)病的粗抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述抗棘球蚴抗原優(yōu)勢(shì)特異抗體亞類的抗體特異結(jié)合的抗抗體。本發(fā)明的免疫層析試條具有簡(jiǎn)便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點(diǎn)，適于臨床和現(xiàn)場(chǎng)使用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101881773SQ200910050688
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者朱慧慧, 楊玥濤, 汪俊云, 王立英, 石鋒, 高春花 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所