專利名稱：：有機(jī)化合物的制作方法有機(jī)化合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及有機(jī)化合物，并且涉及用于鑒定調(diào)節(jié)mRNA與靶蛋白質(zhì)如ELAVL1蛋白之間相互作用的物質(zhì)的測定法。技術(shù)背景大量基因的表達(dá)在信使RNA水平上受到控制。特別地，與某些刺激控制機(jī)制而得以促進(jìn)。這些過程主要由對信使RNA起作用的調(diào)控蛋白質(zhì)或因子介導(dǎo)。抑制或調(diào)節(jié)這類調(diào)控性靶mRNA-蛋白質(zhì)的相互作用代表了有吸引力的治療性干預(yù)手段。為了尋找抑制mRNA調(diào)控的低分子量抑制劑，需要一種監(jiān)測耙向mRNA-蛋白相互作用的測定法，理想地是在均質(zhì)溶液中進(jìn)行。所述測定法應(yīng)還適合于在高通量篩選(HTS)環(huán)境中實施，高通量篩選目前大部分通常基于熒光檢測。相對小的蛋白質(zhì)，如mRNA穩(wěn)定蛋白質(zhì)HuR(36kD)，與長mRNA或亞片段(281-1643個核苷酸，100-500kD)的直接結(jié)合，不能基于大小的相對增加來檢測，因為熒光標(biāo)記的RNA在復(fù)合物形成時衰減。有鑒于此，可以容易地排除基于轉(zhuǎn)動或平移擴(kuò)散時間檢測的光謙法(例如熒光相關(guān)光譜(FCS)、2D-FIDA-各向異性或其他熒光偏振測量法)。本發(fā)明的測定法代表了一種在真正平衡條件下監(jiān)測均質(zhì)溶液中的mRNA-蛋白質(zhì)相互作用的新方法。例如該法應(yīng)用高度敏感的單分子檢測法，由此直接適合于HTS平臺如EvotecMarkl1/111。由于所述檢測如共焦檢測具有高靈敏度和精確度，所以本發(fā)明的測定法代表了有吸引力的不同于常規(guī)電泳遷移率變動分析、濾膜結(jié)合試驗或核酸酶保護(hù)分析的可選方案。適應(yīng)常規(guī)的宏觀熒光強度檢測方法(例如熒光板讀出器)也將是直截了當(dāng)?shù)?，并不一定需要利用共焦儀器。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面提供了用于鑒定調(diào)節(jié)mRNA與靶蛋白質(zhì)之間相互作用的物質(zhì)的測定法，所述測定法包括a)提供長度至少為100個核苷酸的標(biāo)記的mRNA,任選作為均質(zhì)溶液提供，所述的標(biāo)記為對mRNA環(huán)境中的改變敏感的物質(zhì)；b)在不存在和存在候選化合物的情況下使靶蛋白質(zhì)如HuR與步驟a)中提供的mRNA接觸，所述候選化合物預(yù)期將在所述mRNA與所述乾蛋白質(zhì)如HuR之間能夠形成復(fù)合物的足夠長的時間內(nèi)調(diào)節(jié)所述mRNA與所述靶蛋白質(zhì)如HuR之間的相互作用；c)檢測步驟b)中形成的復(fù)合物；d)測定在步驟b)中不存在或存在候選化合物的情況下所形成的復(fù)合物的量是否存在差異；和e)將在步驟d)中測定到差異的候選化合物選為鑒定物質(zhì)。測定原理可以說明如下(例如，如圖1中所示)標(biāo)記mRNA，例如，通過肼醛連接化學(xué)在3，末端用Cy3標(biāo)記。一旦靶蛋白質(zhì)結(jié)合至標(biāo)記的mRNA，則所述標(biāo)記如Cy3的量子產(chǎn)率改變，例如增加，并且這種改變提供了mRNA與靶蛋白質(zhì)相互作用的讀出值。這一效應(yīng)顯然不涉及蛋白質(zhì)與標(biāo)記的直接接觸，而且，甚至對于把蛋白質(zhì)(如HuR)結(jié)合位點遠(yuǎn)離其3，端標(biāo)記的mRNA而言，也可;f見察到再現(xiàn)性。目前我們推斷這一結(jié)果可能是因為與靶蛋白質(zhì)形成復(fù)合物時，RNA三維構(gòu)象改變，通過長程效應(yīng)發(fā)生平移所致，并且歸因于標(biāo)記如Cy3的環(huán)境敏感性(例如，參見MujumdarR.B等，BioconjChem.1993，4(2)105-11)。因潛在抑制劑所致的蛋白質(zhì)-mRNA復(fù)合物形成的減少將檢測為讀出值如總熒光強度的下降，或具有更高分子亮度的物質(zhì)顆粒數(shù)量的減少。200680006844.0說明書第3/24頁在優(yōu)選的實施方案中，靶蛋白質(zhì)為HuR蛋白。mRNA可以為含ARE的mRNA,并且包括例如炎性靶標(biāo)，包括來自TNF-ot、IL-1P、IL-2、IL-8、Cox-2、IL畫4或AT-R1的ARE,而且包括其他ARE調(diào)控的靶標(biāo)家族。例如，原癌基因，如c-myc、c-jun或c-fos。在本發(fā)明的另一方面，mRNA選自編碼IL-2、IL-ip和TNF-a的序列，或這類序列含ARE的片段。在本發(fā)明的另一方面，mRNA具有100-500個核苷酸，優(yōu)選300個核苷酸的長度。標(biāo)記可以為常規(guī)的，例如生物素或酶，如堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)或過氧化物酶(POD)或熒光分子，例如熒光染料。優(yōu)選標(biāo)記為熒光染料，例如Cy3或Cy5，例如Cy3。在本發(fā)明的優(yōu)選的一方面，標(biāo)記為熒光標(biāo)記，例如Cy3或Cy5。靶蛋白質(zhì)可以為已知結(jié)合mRNA的任何蛋白質(zhì)，其中這類結(jié)合導(dǎo)致RNA三維構(gòu)象改變。在本發(fā)明的另一方面，耙蛋白質(zhì)為結(jié)合含ARE的mRNA的ELAVL1(=HuR)。為了檢測形成的復(fù)合物，可以使用檢測手段。這類檢測手段包括測定領(lǐng)域中那些常用的方法，例如熒光檢測測量法。用于本發(fā)明的檢測手段包括識別標(biāo)記mRNA的分子。例如，使用一維強度依賴性共焦熒光檢測方法FIDA(熒光強度分布分析)，能夠直接地、并且以大小獨立的方式、在均質(zhì)溶液中跟蹤乾蛋白質(zhì)如HuR與其耙mRNA的結(jié)合。在本發(fā)明的另一方面，通過測量熒光強度來檢測復(fù)合物。任選可以從非復(fù)合級分中分離出形成的復(fù)合物。例如，可以按照與常規(guī)方法類似的方法進(jìn)行分離，例如色譜法，例如大小排阻色鐠法。候選化合物包括可以測定其對mRNA與靶蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)作用的化合物(庫)。化合物(庫)包括例如寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、才莫擬物、小分子，例如低分子量化合物(LMW、s)。9物質(zhì)為影響(抑制)mRNA與靶蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物，例如在本發(fā)明提供的測定法步驟d)中檢測的物質(zhì)。物質(zhì)為選擇的候選化合物之一，并且可以包括寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、模擬物、小分子，例如低分子量化合物(LMW、s)。物質(zhì)包括一種或多種物質(zhì)，例如物質(zhì)的組合。本發(fā)明在另一方面提供了用于高通量篩選的本發(fā)明的測定法。本發(fā)明在另一方面提供了試劑盒，其包括-標(biāo)記的mRNA，例如熒光標(biāo)記的mRNA;-靶蛋白質(zhì)；-使用這類試劑盒的說明書；和-任選的候選化合物。本發(fā)明提供的這類試劑盒可以進(jìn)一步包括實體組分，包括待測樣品的適宜環(huán)境，以及例如測定待測樣品中候選化合物之效應(yīng)的適當(dāng)手段。本發(fā)明還涉及通過上述篩選測定法鑒定的有機(jī)化合物。本發(fā)明在另一方面提供了下式的化合物其中R為被如下基團(tuán)取代的(d》烷基未被取代或取代的(<:6.18)芳基或具有5或6個環(huán)成員和1-4個選自N、O和S的雜原子的雜環(huán)基；R2為被如下基團(tuán)取代的(CM)烷基羥基、g、M或未被取代或取代的(<:6.18)芳基，或R2為未被取代或取代的(C"8)芳基；且&為未#皮取代或取代的(<:6_18)芳基，或具有5或6個環(huán)成員和1-4個選自N、O和S的雜原子的雜環(huán)基.在式I化合物的一個優(yōu)選方面中，&為被如下基團(tuán)取代的(CL3)烷基未被取代或取代的苯基或具有5個環(huán)成員和N作為雜原子的雜環(huán)基；R2為被如下基團(tuán)取代的(d.2)烷基羥基、羧基、氨基或未被取代或取代的苯基，或R2為未被取代或取代的苯基；且R3為未被取代或取代的苯基，或具有5或6個環(huán)成員和N作為雜原子的雜環(huán)基。在式I化合物的另一優(yōu)選方面，R,為被對曱基苯基取代的甲基，或被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被^&取代的甲基，被對甲基苯基取代的甲基，被lH-吲味-3-基取代的甲基，被羥基取代的乙基，被氨基或?qū)趸交〈囊一?，且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中R4為1-哌啶或l-(對氨基羰基)-哌啶，Rs為甲氧基乙基、芐基或(對甲氧基苯基)-乙基；或下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>R6為對苯基或間吡啶；且R7為被間曱氧基苯基或l-氨基羰基-2-羥基丙基取代的甲基。如果文中不另作定義，那么烷基包括(d.s)烷基，例如(d-4)烷基。芳基包括(Cw8)芳基，例如苯基。雜環(huán)基包括5或6元環(huán)，具有1-4個選自S、O和N，例如N的雜原子；例如哌啶、吡啶和吡咯烷，其任選與另一環(huán)(系)稠合(anellated)，例如與苯環(huán)稠合；或例如與雜環(huán)稠合。烷基、芳基和雜丫ii環(huán)基包括未被取代或取代的烷基、芳基或雜環(huán)基，例如被有機(jī)化學(xué)中常規(guī)的基團(tuán)取代。氨基包括被取代和取代的胺，例如烷基胺和雙烷基胺。在式I的化合物中，單獨定義的各取代基可以為優(yōu)選的取代基，例如彼此獨立定義的取代基。本發(fā)明在另一方面提供了式I的化合物其中a)Ri為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被氨基取代的乙基；且R3為下式的化合物b)R,為被對甲基苯基取代的甲基，R2為被^J^取代的乙基；且R3為下式的化合物c)&為對甲基苯基取代的甲基，R2為被對^&甲基-苯J^代的甲基，且R3為如b)中定義的化合物；d)Ri為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被羥基取代的乙基，且R3為下式的化合物O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIe)Rt為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被^取代的甲基，且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIIf)Rn為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被1H-吲味-3-基取代的甲基，且Rs為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIIIg)R為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被對甲基苯基取代的甲基，且R3為如f)中定義的化合物。本發(fā)明提供的化合物在下文被命名為"(根據(jù))本發(fā)明的化合物"。本發(fā)明的化合物包括任何形式的化合物，例如游離形式，鹽形式，溶劑化物形式以及鹽和溶劑化物的形式。本發(fā)明在另一方面提供了鹽形式的本發(fā)明化合物。這類鹽優(yōu)選包括可藥用鹽，不過，可以包括不可藥用的鹽，例如用于制備/分離/純化目的。本發(fā)明化合物的鹽包括金屬鹽或酸加成鹽。金屬鹽包括例如堿金屬或堿土金屬鹽；酸加成鹽包括式I化合物與酸形成的鹽，所述的酸為例如氫富馬酸(hydrogenfumaricacid)、富馬酸、^1，5-磺酸、鹽酸、氘氯酸；優(yōu)選鹽酸。可以將本發(fā)明游離形式的化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鹽形式的化合物，反之亦然。可以將游離形式或鹽形式以及溶劑化物形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化成游離形式或非溶劑化形式的鹽形式的相應(yīng)化合物，反之亦然。本發(fā)明的化合物可以以純的異構(gòu)體或其混合物的形式存在；例如光學(xué)異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、順/反異構(gòu)體。本發(fā)明的化合物可以例如包含不對稱碳原子，且由此可以以對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體及其混合物，例如外消旋物的形式存在，任何不對稱碳原子均可以以(R)、(S)或(R，S)構(gòu)型，優(yōu)選(R)或(S)構(gòu)型存在。適用的情形下，可以按照，例如與常規(guī)方法類似的方式分離異構(gòu)體混合物而得到純的異構(gòu)體。本發(fā)明包括任何異構(gòu)體形式和任何異構(gòu)體混合物形式的本發(fā)明化合物。本發(fā)明還包括式I化合物的互變異構(gòu)體，在可以存在互變異構(gòu)體的情況下。本發(fā)明在另一方面提供了用于生產(chǎn)式I化合物的方法，其中-R3為式III的化合物，該方法包括步驟<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中RpR2、R6和R7如上述所定義，從而得到式I的化合物，并分離從反應(yīng)混合物中獲得的式I化合物；或-R3為式II的化合物，該方法包括步驟其中Ri、R2、R4和Rs如上述所定義，從而得到式I的化合物，并分離從反應(yīng)混合物中獲得的式I化合物。在式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中間體(原料)中，官能團(tuán)，如果存樹脂-連接基團(tuán)-Br樹脂-連接基團(tuán)-NH-R,NH-Z樹脂-連接基團(tuán)hooc-ivcooh樹脂-連接基團(tuán)a)+R7-NH2b)光解+1,4-二溴-2,3-丁二酮在的話，任選可以為被保護(hù)形式或鹽的形式，如果存在成鹽基團(tuán)的話。保護(hù)基任選存在，可以在適當(dāng)階段除去，例如按照與常規(guī)方法類似的方法。可以將如此獲得的式I化合物轉(zhuǎn)化成另一種式I化合物，例如或以游離形式獲得的式I化合物可以被轉(zhuǎn)化成式I化合物的鹽，反之亦然。式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中間體(原料)已知或可以按照，例如與常規(guī)方法類似的方法或如本文所述制備。適用的情形下，可以例如按照，例如與常規(guī)方法類似的方法，或例如本文詳細(xì)說明的方法制備本文所述的任何化合物，例如本發(fā)明的化合物以及式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中間體。本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明化合物作為抑制劑的用途，用于抑制含ARE的mRNA與靶蛋白質(zhì)如HuR蛋白之間復(fù)合物的形成。在優(yōu)選的方面，含ARE的mRNA選自IL-2、IL-ip和TNF-ou本發(fā)明的化合物，例如包括式I的化合物，表現(xiàn)出藥理學(xué)活性，由此可用作藥物。本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明化合物作為藥物的應(yīng)用。就藥物應(yīng)用而言，本發(fā)明的化合物包括一種或多種，優(yōu)選一種本發(fā)明的化合物，例如本發(fā)明兩種或多種化合物的組合。本發(fā)明在另一方面提供了藥物組合物，其包括發(fā)明的化合物與至少一種藥物賦形劑，例如適宜的載體和/或稀釋劑，例如包括填充劑、粘合劑、崩解劑、流動調(diào)節(jié)劑、潤滑劑、糖類和增甜劑、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽，和/或緩沖劑。本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明的藥物組合物，其還包括其他藥物活性物質(zhì)。例如，可以按照與常規(guī)方法類似的方法，例如通過混合、制粒、包衣、溶解或凍干法制備這類組合物'例如，單位劑型可以含有約0.5mg至約1000mg，如lmg至約500mg。本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明化合物在制備用于治療病癥的藥物例如藥物組合物中的用途，所述病癥具有與選自如下的物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)的病因細(xì)胞因子、生長因子、原癌基因或病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選所述物質(zhì)選自IL-1、IL畫2、IL-3、IL-4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox畫2、c-fos和c-myc。本發(fā)明在另一方面提供了治療病癥的方法，所述病癥具有與選自如下的物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)的病因細(xì)胞因子、生長因子、原癌基因或病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選所述物質(zhì)選自IL-1、IL-2、IL-3、IL畫4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c-fos和c-myc，所述治療方法包括對有這類治療需要的受試者施用有效量的本發(fā)明化合物；例如以藥物組合物的形式。治療包括治療和預(yù)防。就這類治療而言，適宜的劑量當(dāng)然根據(jù)例如所用的本發(fā)明化合物的化學(xué)性質(zhì)和藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)、宿主個體、給藥方式和所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度的不同而改變。然而，一般而言，對于較大的哺乳動物，例如人，為了取得令人滿意的效果，指示每日劑量范圍為約0.01g至約1.0g的本發(fā)明化合物；例如，便利的是每天分劑量施用多達(dá)4次。可以通過任何常規(guī)途徑給予本發(fā)明的化合物，例如腸內(nèi)給藥，例如包括鼻部、口含、直腸、口服給藥；非腸道給藥，例如包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下給藥；或局部給藥，例如包括表皮、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)給藥；例如以包衣或不包衣片、膠嚢、可注射溶液或混懸液的形式，例如以安瓿、小瓶的形式，霜劑、凝膠、糊劑、可吸入粉劑、泡沫劑、酊劑、唇骨、滴劑、噴霧劑的形式或栓劑的形式?？梢砸钥伤幱名}的形式給予本發(fā)明的化合物，例如酸加成鹽或金屬鹽；或游離形式；任選溶劑化物的形式。本發(fā)明鹽形式的化合物表現(xiàn)出與本發(fā)明游離形式，任選溶劑化物形式的化合物相同的活性等級。本發(fā)明的化合物可以單獨或與一種或多種其他藥物活性物質(zhì)聯(lián)合用于本發(fā)明的藥物療法。聯(lián)合用藥包括固定的組合，其中兩種或多種藥物活性物質(zhì)在相同的制劑中；試劑盒，其中在單獨的制劑中的兩種或多種藥物活性物質(zhì)作為同一包裝銷售，例如附帶共同施用的說明書；以及游離的組合，其中單獨包裝藥物活性物質(zhì)，但給出了同時或序慣施用的說明書。圖l:測定原理(圖示)一旦蛋白質(zhì)結(jié)合至標(biāo)記的(如Cy3-標(biāo)記的)mRNA(此處3，末端標(biāo)記)，則環(huán)境敏感性標(biāo)記(如Cy)的量子產(chǎn)率增加。這種增加可以檢測為適當(dāng)讀出值的增加，例如根據(jù)FIDA算法的分子亮度的增加，或例如為使用整體均值讀出值的總熒光強度的增加。對處于標(biāo)記(如Cy3標(biāo)記)近端(A)或遠(yuǎn)端(B)的mRNA序列內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合位點而言，等同地觀察到了這種效應(yīng)。圖2:代表性Cy3FIDA測定mRNA-蛋白質(zhì)結(jié)合曲線顯示了HuRn與IL-2(A)、IL-ip(B)和TNF-a(C)的3，末端Cy3標(biāo)記的3，UTR(-未翻譯區(qū))相互作用的代表性結(jié)合曲線。按照如下文實施例中給出的Eq.l測定解離常數(shù)(Kd)。為了排除HuR與Cy3的非特異性相互作用，使用游離染料(D)作為陰性對照.Cy3分子亮度在使用BSA卜牛血清白蛋白)作為對照蛋白質(zhì)(E)滴定IL-23，UTR時仍然保持不變，3，末端Cy3標(biāo)記的RNA的濃度在所有實驗中均為0.5nM。不含任何HuR結(jié)合位點的5SRNA在所有樣品中以100nM的濃度存在，作為非特異性竟?fàn)嶳NA。然而，在沒有任何竟?fàn)嶳NA存在的情況下記錄到了幾乎相同的結(jié)合曲線(TNF-a3，UTR，(F)所示)，圖3:圖2中所示的結(jié)合實驗的RNA轉(zhuǎn)錄物用Cy3標(biāo)記人IL-2、IL-ip和TNF-a的3，UTR體外轉(zhuǎn)錄物(GenBank登錄號NM—000589、NM_000576和NMJ)00594;分別為707-1035、897-1490和872-1568位)的3，末端。盡管HuR結(jié)合位點(藍(lán)色所示)與3，末端標(biāo)記的(序列)鄰近程度不同，但是在蛋白質(zhì)結(jié)合時一致性地觀察到了Cy3量子產(chǎn)率的增加。在下列實施例中，所有溫度均為攝氏度并且未校準(zhǔn)。使用下列縮寫B(tài)SA牛血清白蛋白Cy3熒光染料FCS熒光相關(guān)光鐠FIDA熒光強度分布分析HuRfl全長HuR蛋白HuR1)2HuRn的截短變體OD光密度PBS磷酸鹽緩沖鹽液RP-HPLC反相高效液相色鐠法rt室溫CONA共焦納米掃描DMF二甲基甲酰胺HuR12HuR的截短變體TMR5，氛基四甲基羅丹明rt室溫實施例A)篩選試驗使用酰肼活化的Cy3(AmershamBiosciences),按照標(biāo)準(zhǔn)方案(例如QinPZ等，Methods1999;18(1):60-70)對體外轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行3，末端標(biāo)記。通過RP-HPLC純化標(biāo)記的RNA。通過UV/VIS光鐠法控制1:1的化學(xué)計量。在測定緩沖液(PBS，0.1%(w/v)PluronicF-127,5mMMgCl2)中于80°將Cy3-標(biāo)記的mRNA加熱變性2分鐘并且通過以-0.13。s_1的梯度冷卻至室溫進(jìn)行重折疊。每份樣品中標(biāo)記RNA的終濃度為0.5nM，它可確保在下述^殳定條件下的共焦體積中的熒光顆粒的平均值<1?；趤碓从谄叫蠪CS評價的顆粒數(shù)量和共焦體積大小來測定每份樣品的精確濃度，這是通過調(diào)整點散布函數(shù)的^t得出的。隨著重組HuRfl或HuRw濃度的增加滴定熒光標(biāo)記的RNA。在真正平衡條件下，通過使用1D-FIDA測定分子亮度來監(jiān)測HuR-mRNA復(fù)合物的形成(例如KaskP.等，Introductiontothetheoryoffluorescenceintensitydistributionanalysis.FLUORESCENCECORRELATIONSPECTROSCOPY:THEORYANDAPPLICATIONS65PGL396-409.2001[Figures]-409;KaskP.等，F(xiàn)luorescence-intensitydistributionanalysisanditsapplicationinbiomoleculardetectiontechnology.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica924，13756-13761.23-11-1999)?；蛘?，可以使用常規(guī)整體均值檢測法，例如熒光平板讀出器測定Cy3熒光強度。在EvotecOAIPickoScreen3儀器上的96孔或384孔玻璃底微量滴定板(Whatman)中于室溫(恒定在23.5°)進(jìn)行FIDA測量?；贠lympus倒置顯微鏡1X70的儀器配備有2臺熒光檢測器，一面熒光M路徑中的二向色鏡。HeNe激光(Ji=543nm，激光能=478^W)用于熒光激發(fā)。使用具有OD=5的千涉屏障濾光片阻斷來自光檢測路徑的激發(fā)激光。利用測定緩沖液中的Cy3或TMR(c=0.5nM)調(diào)整共焦針孔(70nm)。對20個連續(xù)測量值(各10秒)的1D-FIDA信號的求平均值。使用FIDA算法分析原始數(shù)據(jù)以提取^與常規(guī)整體平均測量值相當(dāng)?shù)钠骄肿恿炼?；或〈^具有相應(yīng)分子亮度的各組分的平衡濃度(游離mRNA對復(fù)合物)。通過非線性最小二乘回歸擬合分子亮度數(shù)據(jù)(GraFit5.0.3，Erithacus軟件，London),以使用來源于質(zhì)量作用定律的結(jié)合方程式的準(zhǔn)確代數(shù)解法來提取平衡解離常數(shù)&,描述如下^平均穩(wěn)態(tài)信號q依賴于解離常數(shù)U所確定的(l:l)復(fù)合物形成程度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>方程式l其中,"iiAMc/:RNA的總濃度，HuR的總濃度，游離RNA的分子亮度，^^:RNA-HuR復(fù)合物的分子亮度，《在指定HuRo和RNAo濃度下穩(wěn)態(tài)平衡的平均分子亮度；W解離常數(shù)iQ所確定的游離及結(jié)合蛋白質(zhì)的mRNA的平衡濃度(分別為,m/AC4/,M/和/miA^.好《及/，通過FIDA分析直接得出)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>方程式2HuR與Cy3標(biāo)記的各耙mRNA相互作用的代表性結(jié)合曲線如圖2所示(所有列出的數(shù)據(jù)為20個FIDA測量值的平均值，并代表至少三次獨立的實驗)。概括地講，本測定法提供了新的監(jiān)測均質(zhì)溶液中(調(diào)控性)mRNA蛋白質(zhì)間相互作用的手段。該測定法組合了真正平衡條件與高檢測靈敏度和精確度的優(yōu)點，并適合于在高通量篩選中篩選相互作用的潛在抑制劑或調(diào)節(jié)劑。由于使用了大量轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的疾病相關(guān)靶標(biāo)，所述測定法基于新的RNA尋粑手段將可用作癌癥、炎癥、病毒或過敏性疾病的治療干預(yù)手段。B)分析方法a)HPLC:為了進(jìn)行分析分離，使用由2個泵單元306、動態(tài)混合室組件811C、測壓組件805、UV-檢測器UV/VIS155和自動注射器234組成的Abimed(D國Langenfeld)HPLC系統(tǒng)。在Grom(D-Herrenberg)生產(chǎn)的分析柱GromSil150ODS-5ST(3jim，120x2mm)上進(jìn)行分離。使用H2O/0,l%TFA(v/v)(洗脫液A)和乙腈/0，1°/。TFA(v/v)(洗脫液B)梯度，流速0.4mL/分鐘。分別在入=214和人二305nm處測定UV軌跡?；谠趉=214nm處測定的峰面積給出產(chǎn)物的純度。b)ES-MS:使用帶有Waters(D-Eschborn515裝配泵(等度流速60pL/分，乙腈/水1:1,含0，1%甲酸)和Abimed(D-Langenfeld)Gilson232X自動采樣器的Micromass(Altrinchan/UK)QuattroII三聯(lián)四^tti瞽儀進(jìn)行ES-MS-分析。c)LC-MS:使用帶有HPLC-系統(tǒng)2790AllianceHT分離組件和996二極管陣列檢測器的Waters-Micromass(D-Eschborn)ZQ質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS-分析。使用Grom(D-Herrenberg)生產(chǎn)的分析柱GromSil120ODS-5ST(3jim，60x2mm)。使用H2O/0，l%TFA(v/v)(洗脫液A)和乙腈/0，1%TFA(v/v)(洗脫液B)梯度，流速0.6mL/分鐘。d)制備型HPLC:為了進(jìn)行制備型分離，使用由泵單元322、UV檢測器UV/VIS151(X-305nm)和Gilson215液體處理器組成的Abimed(D-Langenfeld)HPLC系統(tǒng)。在Merck(D-Darmstadt)生產(chǎn)的制備柱PurospherRP18(5pm，125x25mm)上進(jìn)行分離。使用H2O/0，l%TFA(v/v)(洗脫液A)和乙腈/0，1%TFA(v/v)(洗脫液B)梯度，流速30mL/分鐘。實施例1-3:按照方案l合成化合物1-3<,NH，iTentaGelSNH2方案1Lr〇V^Br三rvPL、Br伯胺R1R，-NH24a,bor、r5a,5b4bH'NO6、NH2PLl)氨基酸6a-fPLr12)ct-脫保護(hù)^^5a,5b73~e,83-bNH，63幼6c6d6e6f被保護(hù)的氨基酸6a-f(R2)、Boc0、T、fmoc、t"8u、Ffnoc、Fmoc、Fmoc、Fmoco對稱二酸9a，9b7a，8a<bS、乂R，、乂OH9b對稱二酸R3一^PL義乂，R3、一OH"a乂PLB、乂.B、胺R'OO13aS、乂J5、12R413b~c1)脫保護(hù)ftHH2)光-裂解(366nm)jjHHcr、;V丫R'丫、'-^Ar丫V、'""13a《a)帶有連接基團(tuán)的固相支持物的上樣用DMF(4x20mL)預(yù)洗滌4.2gTentaGelSNHr樹脂1(上樣量-0.25mmol/g)。將0.82g的4-溴甲基-3-硝基苯曱酸2和0.482g的HOBt*H20溶于60mL8o/oDMF的DCM溶液中(v/v)。加入487的DIC。于室溫攪拌30分鐘后，將獲得的溶液轉(zhuǎn)入預(yù)洗滌的TentaGelSNHr樹脂1上。將獲得的混合物于室溫振搖19小時。過濾出獲得的樹脂3，用DMF(6x50mL)、DCM(6x50mL)和MeOH(6x50mL)洗滌，并減壓干燥。通過陰性Kaiser水合茚三酮試驗驗證反應(yīng)完成。b)樹脂3與伯胺類4a，4b的反應(yīng)向3.18g處于20mLDMSO中的樹脂3中加入2.133g1-(3-氨丙基)-吡咯烷-2-酮(4a)。向1.27g處于10mLDMSO中的樹脂3中加入0.73g的4-甲基芐胺(4b)。將獲得的混合物于室溫振搖3小時。過濾出獲得的樹脂5a和5b，用DMSO(3><6mL)、DMF(6x6mL)、DCM(6x6mL)、MeOH(6x6mL)洗滌，并減壓干燥。氯醌試驗為陽性。c)樹脂5a-b上被保護(hù)氨基酸6a-f的偶聯(lián)及N(a)保護(hù)基(Fmoc)的裂解將0.65g樹脂5a分成5等份。將0.65g樹脂5b分成2等份。將0.45mmol各N-保護(hù)的氨基酸6a-f(6a:N(a)-Fmoc畫N(y)-Boc-L-2，4曙二氨基丁酸，2倍；6b:Fmoc-(OTrt)-L-高絲氨酸；6c:Fmoc-Asp(OtBu)-OH;6d:Fmoc-Trp(Boc)-OH;6e:Fmoc-L-4-MePhe-OH;6f:Fmoc-L-(4國Boc-氨甲基)Phe-OH各自溶于5mLDMF、93jiLDIC和92mgHOBt*H20中。將獲得的溶液在室溫攪拌30分鐘。將獲得的活化6a的溶液分成2等份。將這2等份分別轉(zhuǎn)入樹脂5a和樹脂5b等份試樣中，得到側(cè)鏈被保護(hù)的樹脂7a和8a。將獲得的活化的6b-e溶液轉(zhuǎn)入剩余的樹脂5a等份試樣中，得到被保護(hù)的樹脂7b-e。將含6f的溶液轉(zhuǎn)入樹脂5b的第二等份試樣中，得到凈皮保護(hù)的樹脂8b。于室溫振搖16.5小時后，過濾出獲得的樹脂，并用DMF(9x10mL)，DCM(6x10mL)和MeOH(6x10mL)洗滌。減壓千燥完全4皮保護(hù)的樹脂7a-e和8a-b。所有氯醌試驗均為陰性。將哌啶DMF(400mL，1/1，v/v)貯液的等份試樣(5mL)加入到各0.66g被保護(hù)的樹脂7a-e和8a-b中，以裂解N(a)-Fmoc保護(hù)基。將獲得的混合物振搖30分鐘。過濾出獲得的脫保護(hù)的樹脂7a-e、8a-b，并反復(fù)用DMF(9x25mL)、DCM(6x25mL)和MeOH(6x25mL)洗滌。減壓干燥獲得的樹脂。Kaiser水合茚三酮試驗為陽性。d)含對稱二羧酸亞結(jié)構(gòu)的化合物14a-c的合成Fmoc脫保護(hù)的樹脂7a和8a-b上對稱二羧酸9a和9b的偶聯(lián)將對稱二羧酸9(9a:吡咬-2，6-二甲酸；9b:對苯二甲酸，2倍；各1.5mmol)溶于115mgHOBt*H20、485mgDIEA和95mgDIC的5mLDMF溶液中。將獲得的9a的溶液加入到樹脂7a中而得到樹脂10a。將獲得的2等份9b溶液分別加入到樹脂8a和8b中而得到樹脂10b和10c。于室溫振搖20小時后，過濾出獲得的樹脂10a-c,用DMF(9x20mL)、DCM(6x10mL)、二乙基醚(6xl0mL)洗滌，并減壓干燥。所有樹脂樣品的Kaiser水合茚三酮試驗均為陰性。e)樹脂結(jié)合的二羧酸單酰胺10a-c與氨基酸酰胺11和伯胺12的偶聯(lián)將339mg三氟乙酸五氟苯酯(pentafluorophenyltrifluoroacetate)和242nL吡咬的5mLNMP溶液加入到各650mg樹脂10a-c中。將獲得的混合物于室溫振搖2.5小時。過濾出獲得的樹脂，并用NMP(10x5mL)洗滌。將298mg(O-Trt)保護(hù)的L-蘇氨酸酰胺鹽酸鹽(ll)溶于20.3mg無水HOBt和3mmolDIEA的3.0mLNMP溶液中，并加入到650mg預(yù)活化的樹脂10a中而得到樹脂13a。將182mg3-甲氧基節(jié)胺(12)溶于40.6mg無水HOBt和1.5mmolDIEA)的6.0mgNMP溶液中。將獲得的溶液分成2個等份，將它們分別加入到預(yù)活化的樹脂10b和10c中而得到樹脂13b和13c。將獲得的混合物于室溫振搖14.5小時。過濾出獲得的樹脂，用NMP(6x10mL)、DMF(6x10mL)、DCM(6x10mL)和MeOH(6x10mL)洗滌，并減壓干燥。f)Boc-保護(hù)基自氨基酸6側(cè)鏈上的裂解將5mL50%TFA的DCM(v/v)溶液加入到650mg各樹脂13a-c中。將獲得的混合物于室溫振搖2小時。過濾出獲得的樹脂，用2(T/。TFA的DCM溶液(Wv，3x5mL)、DMF(6x10mL)、DCM(6x10mL)和無水EtOH(6x10mL)洗滌，并減壓干燥。g)最終化合物14a-c從樹脂13a-c上的裂解將5mLMeOH+1%TFAv/v)加入到脫保護(hù)的各樹脂13a-c中。將含樹脂的玻璃瓶置于塑料載體中用于光解。在配備有NECBlacklightT5，F(xiàn)L8B1，8W-燈的Stratagene，UVStrataliner1800上于366nm處攪拌進(jìn)行光解90分鐘。在光裂解過程中使用加壓氣流冷卻室。過濾出獲得的樹脂材料，并用DCM(2x5mL)洗滌。從獲得的濾液中蒸發(fā)溶劑?？梢酝ㄟ^制備型HPLC對此粗提材料進(jìn)一步進(jìn)行純化。實施例1:獲得吡啶-2，6-二甲酸2-({3-氨基-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙基氨基曱?；鵌-丙基}-酰胺)6-[(1-氨基曱?；?2-羥基-丙基)-酰胺l。iWTF-49丄5552保,^/7《丄8為、斧1C-MS/iW^i//:"2實施例2:獲得N-3-絲-l-(4-甲基-千絲甲?；?-丙基-N，-(3-甲緣-芐基)-對苯二甲酰胺。MfF=M&5"保蘿^A7:為、斧1C-MS/M"好/V4卵實施例3:獲得N-[2-(4-氨甲基-苯基)-l-(4-甲基-芐脈甲?；?-乙基-N，-(3-甲氧基-芐基)-對苯二甲酰胺。5".6P謬蘿^/>7:為、伊IC-MS/M4^/":565實施例4-7:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>a)樹脂7b-e的乙酰乙?；瘜(a)脫保護(hù)的樹脂7b-e放入5mL注射器。將359mgN-羥基琥珀酰亞胺基乙酰乙酸酯15溶于17.0mLDCM。加入310mgDIEA，并將4mL該J^液的等分試樣轉(zhuǎn)入650mg各樹脂7b-e的各注射器中。于室溫振搖5小時后，過濾出獲得的乙酰乙酰化樹脂16a-d，用DCM(3x5mL)、DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和MeOH(6x5mL)洗滌并干燥，Kaiser水合茚三酮試驗為陰性.b)樹脂l"-d與伯胺na-c的反應(yīng)(烯胺酮形成)將5mLTHF和TMOF的貯液(1/1，v/v)加入到650mg各樹脂16a-d中。加入1.5mmol各伯胺17a-c(17a:與樹脂16a反應(yīng)的2-甲氧基乙胺；17b:與樹脂16b反應(yīng)的2-(3-甲氧基苯基)-乙胺；2倍17c:分別與樹脂16c和16d反應(yīng)的千胺)，并于室溫將獲得的混合物振搖18小時。過濾出獲得的樹脂18a-d,用THF/TMOF(1/1，v/v)(3x6mL)、DMF(6x6mL)、DCM(6x6mL)和MeOH(6x6mL)洗滌并干燥。c)自樹脂結(jié)合的烯胺酮18a-d與1,4-二溴-2,3-丁二酮19合成吡咯將230mg2，6-二-叔丁基吡梵和292mg1，4-二溴-2，3-丁二酮19溶于24mL二噁烷而得到貯液。將獲得的貯液的等分試樣(6mL/樹脂)加入到650mg各樹脂18a-d中。將獲得的混合物于室溫振搖1.5小時。過濾出獲得的樹脂20a-d,用二巧悉烷(6x6mL)、DMF(6x6mL)、THF(6x6mL)和DCM(6x6mL)洗涂。d)用仲胺21a和21b取代樹脂結(jié)合的溴乙?；?吡咯20a-d將192mg各仲胺21(21a:與128mg樹脂20a反應(yīng)的哌咬-4-甲酰胺，21b:與128g樹脂20b-d反應(yīng)的哌咬)和DMSO(4x6mL)加入到650mg各樹脂20a-d中。將獲得的混合物于室溫振搖15.5小時。過濾出獲得的樹脂22a誦d,用DMSO(3x1mL)、DMF(6xlmL)、DCM(6x1mL)和MeOH(6x1mL)洗滌并干燥。e)保護(hù)基從氨基酸6側(cè)鏈上裂解(樹脂22a-c)將5mL20%TFA的DCM溶液(v/v)加入到各樹脂22a-c中以便除去RZ上的側(cè)鏈保護(hù)基(Trt、"Bu、Boc)。將獲得的混合物于室溫振搖1小時。過濾出獲得的脫保護(hù)的樹脂22a-c，用20°/。TFA的DCM溶液(v/v，3xlmL)、DMF(6x2mL)、DCM(6x2mL)、EtOH(6x2mL)和乙醚(3x2mL)洗涂并干燥。f)最終化合物23a-d從樹脂22a-d上裂解將5mL酸性甲醇和1%v/vTFA加入到各脫保護(hù)的樹脂22a-c和未經(jīng)TFA處理的樹脂22d中.將玻璃瓶置于塑料載體中。在配備有NECBlacklightT5，F(xiàn)L8B1，8W-燈的StratageneUVStratalinerTM1800上在攪拌和366nm輻照下光解90分鐘。在光-裂解過程中使用加壓氣流冷卻室，過濾出獲得的樹脂材料并用DCM(2x5mL)洗滌，蒸發(fā)獲得的合并濾液中的溶劑?？梢酝ㄟ^制備型HPLC對化合物的粗提材料進(jìn)一步進(jìn)行純化.實施例4:獲得1-{2-4-{3-羥基-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙基氨基甲?；鵯-丙基氨基甲?；鶀-1-(2-甲氧基-乙基)-5-甲基-111-吡咯-2-基1-2-氧代-乙基}-哌啶-4-甲酸酰胺。MTT=576.699保,時河2.^/為、斧丄C-AfS/M"jy/":577實施例5:獲得3-{1-2-(3-甲氧基-苯基)-乙基-2-甲基-5-(2-哌啶-1-基-乙酰基)-lH-吡咯-3-羰基卜氨基)-N-3-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-丙基-琥珀酸。3/fF=621756錄勢#/《7.59為、妒1C-MS7A^H廣實施例6:獲得1-芐基-2-甲基-5-(2-哌咬-1-基-乙酰基)-111-吡咯-3-甲酸口-(lH-吲咮-3-基)-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙氨基甲酰基-乙基}-酰胺。MW=65汰S2S錄^^/>7:為、妒LC-MS/Af1^/:65/實施例7獲得1-芐基-2-甲基-5-(2-哌咬-1-基-乙?；?-lH-吡^"3-曱酸{1-[3-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-丙氨基甲?；?-對甲苯基-乙基}-酰胺，實施例8:抑制結(jié)合HuR的mRNA穩(wěn)定性調(diào)控的小分子抑制劑的鑒定為了鑒定抑制結(jié)合HuR的mRNA穩(wěn)定性調(diào)控的小分子抑制劑，進(jìn)行了三種不同的互補HT篩選(1)使用處于IL-2或TNF-a富含AU元件控制下的螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞報告基因測定。設(shè)計本測定法用于抑制鑒定ARE介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定的細(xì)胞活性無毒性抑制劑。使用熒光素酶CDS在IL-2或TNF-a啟動子控制下的對照試驗中測試確認(rèn)的命中抑制劑，以排除在轉(zhuǎn)錄水平上起作用的化合物。作為定義，鑒定的命中化合物沿ARE路徑在一定水平上干擾短壽命AREmRNA的轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定。(2)使用共焦波動光鐠法體外篩選HuR-ARE抑制劑。本測定法使用2D-FIDA監(jiān)測HuR12即HuR截短變體與TMR標(biāo)記的ARERNA在溶液中的結(jié)合。預(yù)計在本篩選中鑒定的化合物通過結(jié)合ARE或HuR12而干擾HuR-ARE識別。(3)4吏用HuR的CONA。使用CONA對珠上的組合文庫篩選高親和力HuR結(jié)合劑。在采集了命中的珠并從固相支持物上裂解珠上的結(jié)合劑后，通過jiHPLC-MS對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解碼。在溶液中測試重新合成的命中化合物與HuR的結(jié)合。作為初步結(jié)果，鑒定的化合物代表了高親和力HuR結(jié)合劑。它們在功能上可以為任意HuR活性的抑制劑，所述HuR活性包括ARE識別、核質(zhì)穿梭和防止mRNA的ARE依賴性降解。基于^=^/wJ/(rT/wwJ+2()w^"，由各向異性數(shù)據(jù)計算結(jié)合的RNA級分》其中r三測量的各向異性，r油、r麵分別三游離和結(jié)合HuR的RNA的各向異性，gs猝滅。使用Mathematica5.0.0中的XMfl汰擬合的非線性曲線，假定l:l:l的化學(xué)計量竟?fàn)幮砸种?，來測定解離常勤W。。表l.HuR抑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>基于結(jié)合HuRn的ARERNA的竟?fàn)幮詫嶒灉y定化合物的解離常數(shù)權(quán)利要求1.鑒定調(diào)節(jié)mRNA與靶蛋白質(zhì)之間相互作用的物質(zhì)的測定法，包括a)提供長度至少為100個核苷酸的標(biāo)記的mRNA，任選作為均質(zhì)溶液提供，所述標(biāo)記為對mRNA環(huán)境中的改變敏感的物質(zhì)；b)在不存在和存在候選化合物的情況下使靶蛋白質(zhì)與步驟a)中提供的mRNA接觸，所述候選化合物預(yù)期將在所述mRNA與所述靶蛋白質(zhì)之間能夠形成復(fù)合物的足夠長的時間內(nèi)調(diào)節(jié)所述mRNA與所述靶蛋白質(zhì)之間的相互作用；c)檢測步驟b)中形成的復(fù)合物；d)測定在步驟b)中不存在或存在候選化合物的情況下所形成的復(fù)合物的量是否存在差異；和e)將在步驟d)中測定到差異的候選化合物選為鑒定物質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述的測定法，其中的標(biāo)記為熒光染料，如Cy3或Cy5。3.權(quán)利要求1或2中任一項所述的測定法，其中通過測量熒光強度來檢測復(fù)合物。4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的測定法，其中所述靶蛋白質(zhì)為HiiR蛋白。5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的測定法，其中mRNA選自IL-2、IL國1(J和TNF-a,6.權(quán)利要求1至5中任一項所述的測定法，其中mRNA長度為100至500個核苷酸，優(yōu)選300個核苷酸。7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的測定法，用于高通量篩選，8.試劑盒，其包括-標(biāo)記的mRNA，例如熒光標(biāo)記的mRNA;-把蛋白質(zhì)；-使用這類試劑盒的說明書；和-任選的候選化合物，9.下式I的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ri為被如下基團(tuán)取代的(Cw)烷基未被取代或取代的(Q.一芳基或具有5或6個環(huán)成員和1-4個選自N、O和S的雜原子的雜環(huán)基；R2為被如下基團(tuán)取代的(C一烷基羥基、氯基、氨基或未被取代或取代的(<:6.18)芳基，或R2為未被取代或取代的(Cw8)芳基；且R3為未被取代或取代的(Cw8)芳基，或具有5或6個環(huán)成員和1-4個選自N、O和S的雜原子的雜環(huán)基。10.權(quán)利要求9的化合物，其中&為被如下基團(tuán)取代的(Cw)烷基未被取代或取代的苯基或具有5個環(huán)成員和N作為雜原子的雜環(huán)基；R2為被如下基團(tuán)取代的(Cw)烷基羥基、羧基、氨基或未被取代或取代的苯基，或R2為未被取代或取代的苯基；且R3為未被取代或取代的苯基，或具有5或6環(huán)成員和N作為雜原子的雜環(huán)基。11.權(quán)利要求9或10中任一項的式I的化合物，其中R,為被對甲基苯基取代的甲基或被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基；R2為被g取代的甲基、被對甲基苯基取代的甲基、被111-吲哚-3-基取代的甲基、被羥基取代的乙基、被ll^或?qū)谆交〈囊一磺襌3為下式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R4為l-哌啶或l-(對氨基羰基)-哌啶；Rs為甲氧基乙基、芐基或(對甲氧基苯基)-乙基；或下式III的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R6為對苯基或間吡啶；且R7為被間甲氧基苯基或l-氨基羰基-2-羥基丙基取代的甲基,12.下式I的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中a)Ri為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被M取代的乙基；且Rs為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>b)R為被對甲基苯基取代的甲基，R2為被ll^取代的乙基；且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>c)R為被對曱基苯基取代的甲基，R2為被對氨基甲基-苯基取代的曱基，且R3為如b)中定義的化合物；d)Ri為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為凈皮羥基取代的乙基，且R3為下式的化合物e)Rt為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為^J^取代的甲基，且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>f)A為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被1H-吲哚-3-基取代的甲基，且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>12.g)R為被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2為被對甲基苯基取代的甲基，且R3為如f)中定義的化合物。13.權(quán)利要求9至12中任一項的化合物，為鹽的形式。14.權(quán)利要求9至13中任一項的化合物作為抑制劑的用途，所述抑制劑抑制含ARE的mRNA與靶蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物形成。15.權(quán)利要求14所述的用途，其中靶蛋白質(zhì)為HuR。16.權(quán)利要求9至13中任一項的化合物作為藥物的用途。17.權(quán)利要求9至13中任一項的化合物在制備治療病癥的藥物中的用途，所述病癥具有與選自下列的物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)的病因細(xì)胞因子、生長因子、原癌基因或病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c-fos和c-myc。18.藥物組合物，包括權(quán)利要求9至13中任一項的化合物與至少一種藥物賦形劑，19.權(quán)利要求18的藥物組合物，還包括其他藥物活性物質(zhì)。20.治療病癥的方法，所述病癥具有與選自下列的物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)的病因細(xì)胞因子、生長因子、原癌基因或病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL誦8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c畫fos和c-myc，所述治療方法包括對有這類需要的受試者施用有效量的權(quán)利要求9至13中任一項的化合物。21.權(quán)利要求20的方法，其中同時或序慣地聯(lián)合施用權(quán)利要求9至13中任一項的化合物與另一種藥物活性物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)mRNA與靶蛋白質(zhì)如HuR之間相互作用的物質(zhì)的測定法，以及式I的有機(jī)化合物，其中R₁、R₂和R₃如文中所定義；并且本發(fā)明涉及這些化合物的用途，例如作為針對含ARE的mRNA與靶蛋白質(zhì)之間復(fù)合物形成的抑制劑。文檔編號G01N33/536GK101133325SQ200680006844公開日2008年2月27日申請日期2006年3月1日優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日發(fā)明者H·格斯塔奇,M·奧爾,M·欣特施泰納,N-C·梅斯納,T·申德勒申請人:諾瓦提斯公司