專利名稱：一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肺炎球菌的檢測試紙及其制備方法，別是涉及一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)，也稱肺炎球菌(pneumococcus)，廣泛分布于自然界，常寄居于正常人的鼻咽腔中，兒童鼻咽部帶菌率可達(dá)24-32％。肺炎球菌有90個血清型，近30個血清型對人有致病性為細(xì)菌性肺炎的主要病原體。臨床上，通常將肺炎分為社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia，CAP)和醫(yī)院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)。
CAP是世界范圍內(nèi)引起死亡的重要原因之一，在美國CAP居死因第六位，又是感染性疾病的首要病因，在日本CAP居死因第四位，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年約有250萬例CAP患者，死亡約12.5萬。近年來，各國對CAP病原體的研究結(jié)果表明20世紀(jì)80-90年代，CAP的病原體以肺炎球菌居第一位。多年來，國內(nèi)研究人員一直認(rèn)為肺炎球菌對青霉素高度敏感，并將青霉素用作治療肺炎球菌感染的首選藥物，但隨著抗生素的廣泛使用，肺炎球菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，且呈多重耐藥。當(dāng)肺炎球菌從感染的原發(fā)部位播散到循環(huán)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或其它正常情況下的無菌部位時，會引起腦膜炎、菌血癥等侵襲性疾病。因此，快速、準(zhǔn)確的確定病原菌是控制肺炎的關(guān)鍵。
目前，我國尚未有肺炎球菌的血清檢測診斷試劑盒。因此，研究肺炎球菌敏感、特異、快速、簡便的檢測方法和試劑非常必要。經(jīng)典的肺炎球菌檢測方法是通過接種培養(yǎng)試驗等，但由于其操作較煩瑣、耗時較長，不適合在臨床使用。
肺炎球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesion A，PsaA)為肺炎球菌表面結(jié)合脂蛋白，在肺炎球菌粘附呼吸道粘膜過程中起關(guān)鍵作用。PsaA是各型肺炎球菌共有的一種遺傳保守的、種特異性的表面蛋白抗原，具有較好的免疫原性，且與毒力有關(guān)(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Purification and characterizationof Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin Aexpressed in Escherichia coli[J].Vaccine 2000，181811-1821.)。PsaA基因的開放閱讀框的長度為930bp，編碼37kD的蛋白。
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙(Immuno-ChromatographicAssay，ICA)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上設(shè)有相互分離的一條檢測線和一條質(zhì)控線；所述檢測線含有肺炎球菌表面粘附素A，所述質(zhì)控線含有能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體。
所述肺炎球菌表面粘附素A可為野生型肺炎球菌表面粘附素A或經(jīng)發(fā)酵表達(dá)的重組肺炎球菌表面粘附素A。所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異性抗體可購自pharmacia等生物試劑公司。所述檢測線含有的肺炎球菌表面粘附素A的濃度可為2.0-4.0mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體的濃度可為2.0-4.0mg/mL。
所述吸水墊和樣品墊均由吸水材料制備。
檢測樣品時可將上述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的樣品墊直接浸于樣品中；為使使用更加方便，所述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的背面還緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)將肺炎球菌表面粘附素A溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將能與金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線，然后將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離所述檢測線的一端；2)制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；3)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上遠(yuǎn)離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測肺炎球菌的免疫層析試紙。
上述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的制備方法中，步驟1)中肺炎球菌表面粘附素A可為野生型肺炎球菌表面粘附素A或經(jīng)發(fā)酵表達(dá)的重組肺炎球菌表面粘附素A；所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異性抗體可購自pharmacia等生物試劑公司；所述檢測線含有的肺炎球菌表面粘附素A的濃度可為2.0-4.0mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體的濃度可為2.0-4.0mg/mL。此外，可將步驟1)中噴有肺炎球菌表面粘附素A溶液和金黃色葡萄球菌蛋白A特異性抗體溶液的纖維素膜先在37℃下干燥2-4小時，再粘貼吸水墊。
為使金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結(jié)合，可向步驟2)中的金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；為使金標(biāo)墊更易與纖維素膜粘貼，可將金標(biāo)墊在-20℃至-50℃冷凍5-8小時，并將其冷凍抽干后，再與纖維素膜粘貼。
為了使用更加方便，所述檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的背面還可再緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
所述重組肺炎球菌表面粘附素A的表達(dá)方法可為構(gòu)建5’端融合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因，再將該基因?qū)胨拗骷?xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使重組肺炎球菌表面粘附素A基因表達(dá)。
所述5’端融合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因可通過含有該融合基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等，優(yōu)選為pET-32a。
以pET-32a為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有肺炎球菌表面粘附素A基因的重組表達(dá)載體為pET32a-psaA。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、E.coli BLR(DE3)或E.coli B834等。
上述重組表達(dá)載體和重組菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有5’端融合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時需加入誘導(dǎo)劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0.1-5mmol/L，優(yōu)選為1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為33-40℃，優(yōu)選為37℃，誘導(dǎo)時間為3-7小時，優(yōu)選為5小時。
所述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液的制備方法，可包括以下步驟1)將質(zhì)量百分濃度為0.01％的氯化金(HAuCl4)水溶液加熱煮沸，并將每100mL0.01％HAuCl4溶液進(jìn)行如下操作攪動下加入1.6-1.8mL質(zhì)量百分濃度為1％的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，繼續(xù)煮沸，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調(diào)至6-6.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為8-12μg/mL的金黃色葡萄球菌蛋白A，攪拌20-30分鐘，然后加入1-3mL10％PEG20000，繼續(xù)攪拌20-30分鐘，在9000-13000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，沉淀即為金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針；3)將金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針保存于質(zhì)量百分濃度0.25-0.4％的四硼酸鈉溶液中，得到金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液。
在上述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針的制備方法中，步驟1)中加入1％的檸檬酸三鈉水溶液后再繼續(xù)煮沸10-15分鐘即得到膠體金溶液；為彌補因加熱蒸發(fā)損失的水分，可用水將膠體金溶液恢復(fù)至原體積。步驟2)中可用濃度為0.1-0.3M(優(yōu)選為0.2M)的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值；向膠體金溶液中添加的金黃色葡萄球菌蛋白A的終濃度優(yōu)選為10μg/mL，10％PEG20000的添加量優(yōu)選為2mL。步驟3)中金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液中金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針的終濃度優(yōu)選為10％。
在實際應(yīng)用中，所述纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜，厚度控制在2-3mm為宜；所述吸水墊可為吸水紙，厚度可為1.5-3mm；所述金標(biāo)墊的厚度可為30-70mm；所述樣品墊可為玻璃纖維膜，厚度可為0.1-0.2mm。
本發(fā)明提供了一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙及其制備方法。該試紙利用了免疫膠體金技術(shù)及雙抗體夾心檢測法，用其檢測肺炎球菌或肺炎球菌抗原的基本原理是將肺炎球菌PsaA蛋白包被纖維素膜，用于捕捉血清中肺炎球菌抗體，然后用標(biāo)記了SPA的免疫膠體金探針檢測；陽性血清樣品的肺炎球菌抗體(IgG和IgM)的Fc端與膠體金顆粒上的SPA結(jié)合，F(xiàn)ab端與纖維素膜上的肺炎球菌PsaA蛋白結(jié)合，層析2分鐘后可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線。本發(fā)明的免疫層析試紙具有以下優(yōu)點1)敏感性及特異性高；2)檢測方法簡單、快速檢測過程中標(biāo)本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，標(biāo)本中的肺炎球菌或肺炎球菌經(jīng)過2分鐘左右的紙層析后，即可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，從而為肺炎球菌病的治療爭取了時間，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用；3)制備方法簡單，成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在肺炎球菌的檢測及其相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的正面和縱截面結(jié)構(gòu)示意2為PCR擴增的嵌合基因psaA的1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為攜帶有psaA基因的原核表達(dá)載體pET32a-psaA及pET32a空載體的BamH I和Hind III雙酶切鑒定結(jié)果圖4為用E.coli BL21/psaA小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)的rPsaA的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖5為rPsaA抗原活性的Western blot鑒定結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法；所述百分含量如無特別說明均為質(zhì)量/體積百分含量或體積/體積百分含量。所用引物由上海生工生物工程公司合成，所述測序工作由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。
實施例1、檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的制備本發(fā)明檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的制備方法，可包括以下步驟一、重組肺炎球菌表面粘附素A的制備1、5’端嵌合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因的克隆根據(jù)文獻(xiàn)(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Purification andcharacterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcalsurface adhesin A expressed in Escherichia coli[J].Vaccine 2000，181811-1821.)中報道的肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)基因序列設(shè)計擴增5’端嵌合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列(51bp)的重組肺炎球菌表面粘附素A嵌合基因的引物，在上游引物P1中引入限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點和OspA信號肽編碼序列，在下游引物P2中引入限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點)，以將PsaA基因的先導(dǎo)序列(PsaA的信號肽為PsaA氨基酸殘基序列中的前20個氨基酸殘基)替換為伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列，引物序列如下P1(上游引物)5’-GGGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGGTCTAATATTAGCCTTAATAGCATGCGCTAGCGGAAAAAAAGAT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點，黑體部分堿基為伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列)P2(下游引物)5’-GGGAAGCTTATTTTGCCAATCCTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點)。
用加入5％脫纖維羊血(購自北京京順動物養(yǎng)殖中心)的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(購自bioMerieux公司)培養(yǎng)肺炎球菌010075株(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物菌種保藏中心)，用無菌生理鹽水從培養(yǎng)斜面上洗下菌苔，收集菌液，離心集菌后，用細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANGEN公司)提取該株肺炎球菌的基因組DNA，于-20℃保存。以所提取的肺炎球菌010075株的基因組DNA為模板，以無菌水為陰性對照，在上、下游引物P1和P2的引導(dǎo)下PCR擴增嵌合基因psaA，PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性2min；然后94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 90s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道1為以肺炎球菌010075株的基因組DNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物，泳道2為陰性對照的PCR擴增產(chǎn)物，泳道3為DL2000 DNA marker)，以肺炎球菌010075株的基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增的DNA片段的長度約為921bp，與預(yù)期結(jié)果相符。用購自寶生物(大連)工程公司的DNA凝膠回收試劑盒回收并純化該目的片段，將其連接入到pMD18-T載體(Takara公司)中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的5’端嵌合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A嵌合基因psaA。
2、psaA基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟1克隆的psaA基因用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET32a(QIAGEN公司)用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示(泳道1為嵌合基因psaA擴增產(chǎn)物的BamH I和Hind III雙酶切產(chǎn)物，泳道2為DL2000 DNA marker，泳道3為pET32a的BamH I和Hind III雙酶切產(chǎn)物，泳道4為Surpercoiled DNA laddermarker(寶生物(大連)工程公司))，嵌合基因psaA為921bp，質(zhì)粒pET32a為5.9kb，嵌合基因psaA的BamH I和Hind III雙酶切產(chǎn)物的分子量約為900bp，經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后的pET32a呈開環(huán)狀態(tài)，因此泳動速度較慢，位于分子量Marker的8023bp處，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。再用測序的方法對陽性克隆質(zhì)粒做進(jìn)一步鑒定，測序結(jié)果表明獲得了插入序列及位置均正確的含有嵌合基因psaA的原核表達(dá)載體，命名為pET32a-psaA，將轉(zhuǎn)化有pET32a-psaA的重組大腸桿菌命名為E.coli BL21/psaA。
3、rPsaA的小規(guī)模發(fā)酵表達(dá)及SDS-PAGE檢測將步驟2構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有pET32a-psaA的重組大腸桿菌E.coli BL21/psaA接種于含100μg/mL氨芐青霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm下培養(yǎng)至菌液OD600為0.7-0.9時，添加IPTG至終濃度為1mM，然后在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5h，離心集菌，將菌體沉淀用TE裂解液(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)懸浮，加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL，室溫作用30min，超聲破碎菌體，12000rpm離心20min，取沉淀、上清各1mL，12000rpm離心，用50μl純水懸浮沉淀，加50μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L Tris·HCl，200mmol/L DTT，4％ SDS，0.2％溴分藍(lán)，20％甘油，pH6.8)，煮沸5min，離心后各取5μl進(jìn)行SDS-PAGE檢測。檢測結(jié)果如圖4所示(泳道1為蛋白分子量Marker，泳道2為超聲破碎菌體沉淀，泳道3為上清液)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分子量約為52kD的重組PsaA(rPsaA)獲得高效表達(dá)，且沉淀、上清中均有rPsaA，而rPsaA以存在于上清中的可溶性表達(dá)為主，包涵體形式表達(dá)較少，用Bandscan5.0軟件分析表達(dá)量約為60％。天然PsaA的信號肽對于PsaA在大腸桿菌中的大量表達(dá)是低效的，用相同方法構(gòu)建的含有930bp全長psaA基因的重組大腸桿菌的PsaA表達(dá)量僅為40％(Sampson JS，O’Connor SP，Stinson AP，et al.Cloning andnucleotide sequence analysis of psaA，the Streptococcus pneumoniae geneencoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reportedStreptocuccus sp.adhesins[J].Infect Immun 1994，62319-324.)。用OspA的信號肽基因序列替換PsaA的信號肽編碼序列進(jìn)行表達(dá)后，rPsaA的表達(dá)量明顯提高，表明OspA的信號肽對PsaA的大量表達(dá)是非常有效的，分析原因可能是PsaA的信號肽多了3個疏水氨基酸殘基，因而疏水性較強，使其在翻譯后蛋白轉(zhuǎn)運中不能有效的發(fā)揮作用(De BK，Sampsom JS，Ade EW，et al.Baculovirus expression，purification and evaluation of recombinant pneumococcal surface adhesion Aof Streptococcus pneumoniae[J].Pathobiology 1999，67115-122.)。用PIERCE公司的鎳螯合瓊脂糖凝膠純化試劑盒并按照試劑盒說明書對表達(dá)的rPsaA進(jìn)行純化。
4、rPsaA抗原活性的Western blot鑒定1)甲醛滅活肺炎球菌免疫兔血清的制備制備甲醛滅活肺炎球菌免疫兔血清，方法為以0.5％甲醛滅活肺炎球菌010075株，配制成菌濃度為3×108個菌/mL的菌液備用。選用體重約1.5kg健康雌性大耳白兔(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，首次用福氏完全佐劑與菌液混合乳化后皮下少量多點注射，1mL/只，然后分別于初次免疫后第20日、第30日、第40日、第50天用不完全佐劑免疫追加免疫1針，追加劑量和途徑與初次免疫相同，末次免疫后7天耳緣靜脈采血進(jìn)行凝集試驗，結(jié)果2只大耳白兔的效價分別為1∶64、1∶128，頸動脈采血，離心收集抗血清，所得兔血清-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2)rPsaA的Western blot檢測以步驟1)制備的甲醛滅活肺炎球菌免疫兔血清為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)為二抗對步驟3經(jīng)純化的rPsaA進(jìn)行Western blot檢測，同時以野生型大腸桿菌BL21破碎菌體和轉(zhuǎn)化有pET32a空載體的重組大腸桿菌破碎菌體為對照，最后用DAB底物液(TIANGEN公司)顯色并拍照。檢測結(jié)果如圖5所示(泳道1為野生型大腸桿菌BL21破碎菌體，泳道2為轉(zhuǎn)化有pET32a空載體的重組大腸桿菌破碎菌體，泳道3為表達(dá)后未純化的rPsaA，泳道4為純化的rPsaA，泳道5為蛋白分子量Marker(Fermentas公司))，重組表達(dá)的rPsaA可特異地和甲醛滅活肺炎球菌免疫兔血清發(fā)生反應(yīng)，表明所表達(dá)的rPsaA具有較好的抗原性，可和肺炎球菌抗體特異性結(jié)合。用上述方法構(gòu)建的重組菌E.coli BL21/psaA可購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物菌種保藏中心(保藏號BL21/psaA)。
5、rPsaA的大量制備可按下述方法大量制備肺炎球菌rPsaA抗原1)發(fā)酵將含有rPsaA基因的工程菌(E.coli BL21/rPsaA)菌種接種在含95μg/mL(90-100μg/mL均可)氨芐青霉素的LB抗性平板上，在37℃普通孵箱中培養(yǎng)20-24小時，挑取平板上長出的單個典型菌落接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250-300rpm下振蕩培養(yǎng)10-12小時，然后按1∶10的比例進(jìn)行擴大培養(yǎng)(如將10mL菌液接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中)，直至進(jìn)入發(fā)酵反應(yīng)器。發(fā)酵培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基中(每升含Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，pH7.0)，發(fā)酵時按1∶50比例進(jìn)行接種，發(fā)酵中控制溫度為(37±1)℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)350-500rpm，通氣量1L培養(yǎng)基1L/min空氣，發(fā)酵反應(yīng)器用1M NaOH和30％(V/V)NaH2PO4溶液自動調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值約為7.0，同時記錄發(fā)酵液550nm處的吸光度(A值)，當(dāng)發(fā)酵液A值約為0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mmol/L，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量不變，誘導(dǎo)3-4小時后，發(fā)酵結(jié)束。
2)肺炎球菌rPsaA抗原的粗提將步驟1)獲得的發(fā)酵液以8000-9000rpm離心10-15分鐘收集菌體沉淀，按每g濕重菌體加1mL純化水的比例放入勻漿機中，使菌體在低滲環(huán)境下勻漿(12±1kpa/cm2)破碎，收集勻漿液，即為粗制rPsaA抗原。取粗制rPsaA抗原100μl按常規(guī)法進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果在52Kd處有一條明顯的蛋白帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明經(jīng)表達(dá)獲得了rPsaA，且rPsaA蛋白含量約占總蛋白量60％以上。
3)肺炎球菌rPsaA抗原的純化取步驟2)獲得的粗制rPsaA抗原，在4℃、8000-9000rpm下離心10-15分鐘，棄沉淀，收集上清，再將上清于4℃、10000-12000rpm離心10-15分鐘，棄沉淀包涵體，收集上清，對上清用固態(tài)硫酸銨法分級分離，方法為根據(jù)硫酸銨濃度表計算加入固態(tài)硫酸銨的量，先向上清中加入固態(tài)硫酸銨至濃度為45％(m/V)，于4℃靜置4-5小時后8000rpm離心15分鐘，去除沉淀中的雜蛋白，再加固態(tài)硫酸銨至濃度65％(m/V)，于4℃靜置4-5小時，8000rpm離心15分鐘，使目的蛋白沉淀，棄上清，收集沉淀，將rPsaA置于透析袋中，用PBS(0.01M，pH7.0)透析液1000mL透析，間隔6小時更換透析液，直至達(dá)到平衡，最后4℃、10000-12000rpm離心10-15分鐘，收集沉淀，沉淀即為純化后的rPsaA抗原。
二、制備免疫膠體金探針及金標(biāo)墊1、制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針用下述方法制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針1)制備膠體金溶液采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4(購自Sigma公司，1g/瓶包裝)配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準(zhǔn)確加入1.7mL(1.6-1.8mL均可)的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸10-15分鐘，待液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液。為彌補因加熱蒸發(fā)損失的水分，可用水將膠體金溶液恢復(fù)至原體積。取制作好的膠體金溶液1滴，附在有Formvar膜的銅網(wǎng)上，隨后用濾紙吸走多余的液體，空氣中自然干燥，于透射電鏡下觀察，膠體金顆粒呈圓形或橢圓形，大小均勻一致，計數(shù)100個金顆粒，顆粒直徑約為25nm，符合實驗設(shè)計要求。
2)確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度用0.2M K2CO3調(diào)節(jié)步驟1)制備的膠體金溶液的pH值至6.0-6.5，準(zhǔn)備5支潔凈試管，分別加入1mL膠體金溶液。將金黃色葡萄球菌蛋白A稀釋為1mg/mL，分別向4支試管中加入5μl、10μl、15μl、25μl，另一支為空白對照，混勻后于室溫下放置5分鐘，加入10％NaCl水溶液，混勻，靜置5-10分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量即為穩(wěn)定1mL膠體金溶液所需抗體的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20％抗體量即為膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度。結(jié)果維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為8-12μl，即8-12μg/mL，故選擇偶聯(lián)抗體濃度為8-12μg/mL。
3)制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針取50mL膠體金溶液，用0.2M K2CO3調(diào)pH值為6.0-6.5，按10μg/mL加入金黃色葡萄球菌蛋白A，得到50mL含有濃度為10μg/mL(8-12μg/mL均可)金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液，攪拌20-30分鐘，然后加入2mL(1-3mL均可)10％PEG20000，繼續(xù)攪拌20-30分鐘，在9000-13000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，沉淀即為金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針。用0.25-0.4％的四硼酸鈉溶液洗滌沉淀，并將其保存于0.25-0.4％的四硼酸鈉溶液中，得到終濃度為10％的金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液。
2、制備金標(biāo)墊取金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液5mL，加入0.5g(0.25-0.5g均可)蔗糖，充分溶解后均勻加在玻璃纖維膜上，-40℃(-20℃至-50℃均可)冷凍7小時(5-8小時均可)，凍干機抽干，得到金標(biāo)墊。
三、檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的制備如圖1所示(圖中a為檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的正面結(jié)構(gòu)圖，圖中b為檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的縱截面結(jié)構(gòu)圖)，檢測肺炎球菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上設(shè)有檢測線5和質(zhì)控線6，該試紙的制備方法包括以下步驟1)NC膜3的包被肺炎球菌rPsaA抗原和質(zhì)控金黃色葡萄球菌蛋白A抗體的包被用0.01M pH7.2 PB稀釋肺炎球菌rPsaA抗原至終濃度為2mg/mL(2.0-4.0mg/mL均可)，用于包被檢測線。用0.01M pH7.2的PBS稀釋金黃色葡萄球菌蛋白A抗體至終濃度為4mg/mL(2.0-4.0mg/mL均可)，用于包被質(zhì)控線。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機將分別噴于300mm長、25mm寬的硝酸纖維素膜3上，形成相互分離的檢測線5和質(zhì)控線6，37℃干燥2.5小時(2-4小時均可)。
2)檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的制備將用吸水濾紙(購自Millipore公司)制的吸水墊4用雙面膠粘貼于步驟1)得到的設(shè)有有檢測線5和質(zhì)控線6的NC膜3靠近質(zhì)控線6的一端；將在步驟2中制備的金標(biāo)墊2用雙面膠粘貼于NC膜3靠近檢測線5的一端；再在金標(biāo)墊2的上用雙面膠粘貼玻璃纖維膜樣品墊(購自Millipore公司)1，得到檢測肺炎球菌的免疫層析試紙，可按所需大小進(jìn)行切割，加干燥劑后密封保存。
4、檢測肺炎球菌的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的下面再緊密連接一塑料背板，再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，加干燥劑后密封保存。該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
5、檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的使用方法和原理測定時將試紙條樣品墊1浸入液體標(biāo)本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動，流經(jīng)金標(biāo)墊2時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向硝酸纖維膜3滲移。若標(biāo)本中有待測特異抗原，其可與免疫金復(fù)合物的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至檢測線5即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至質(zhì)控線6與固相二抗結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
權(quán)利要求
1.一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上設(shè)有相互分離的一條檢測線和一條質(zhì)控線；所述檢測線含有肺炎球菌表面粘附素A，所述質(zhì)控線含有能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肺炎球菌的免疫層析試紙，其特征在于所述肺炎球菌表面粘附素A為野生型肺炎球菌表面粘附素A或經(jīng)發(fā)酵表達(dá)的重組肺炎球菌表面粘附素A；所述檢測線含有的肺炎球菌表面粘附素A的濃度為2.0-4.0mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體的濃度為2.0-4.0mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測肺炎球菌的免疫層析試紙，其特征在于所述免疫層析試紙緊密連接有背板。
4.一種制備權(quán)利要求1或2或3所述的檢測肺炎球菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)將肺炎球菌表面粘附素A溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將能與金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線，然后將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離所述檢測線的一端；2)制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；3)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上遠(yuǎn)離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測肺炎球菌的免疫層析試紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中肺炎球菌表面粘附素A為野生型肺炎球菌表面粘附素A或經(jīng)發(fā)酵表達(dá)的重組肺炎球菌表面粘附素A；所述檢測線含有的肺炎球菌表面粘附素A的濃度為2.0-4.0mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體的濃度為2.0-4.0mg/mL；將噴有肺炎球菌表面粘附素A溶液和金黃色葡萄球菌蛋白A特異性抗體溶液的纖維素膜先在37℃下干燥2-4小時，再粘貼吸水墊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述重組肺炎球菌表面粘附素A的表達(dá)方法為構(gòu)建5’端融合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因，再將該基因?qū)胨拗骷?xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使重組肺炎球菌表面粘附素A基因表達(dá)；所述5’端融合伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA信號肽編碼序列的重組肺炎球菌表面粘附素A基因通過含有該融合基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a；以pET-32a為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有HR2抗病毒抑制子模擬蛋白基因的重組表達(dá)載體為pET32a-psaA；所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌；所述大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)plys、E.coli BLR(DE3)或E.coli B834；培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0.1-5mmol/L，優(yōu)選為1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為33-40℃，優(yōu)選為37℃，誘導(dǎo)時間為3-7小時，優(yōu)選為5小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于向所述步驟2)中的金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；將金標(biāo)墊在-20℃至-50℃冷凍5-8小時，并將其冷凍抽干后，再與纖維素膜粘貼。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液的制備方法，包括以下步驟1)將質(zhì)量百分濃度為0.01％的氯化金水溶液加熱煮沸，并將每100mL 0.01％HAuCl4溶液進(jìn)行如下操作攪動下加入1.6-1.8mL質(zhì)量百分濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調(diào)至6-6.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為8-12μg/mL的金黃色葡萄球菌蛋白A，攪拌20-30分鐘，然后加入1-3mL 10％PEG20000，繼續(xù)攪拌20-30分鐘，在9000-13000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，沉淀即為金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針；3)將金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針保存于質(zhì)量百分濃度0.25-0.4％的四硼酸鈉溶液中，得到金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針的制備方法的步驟1)中加入1％的檸檬酸三鈉水溶液后再繼續(xù)煮沸10-15分鐘即得到膠體金溶液；步驟2)中用濃度為0.1-0.3M的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值；向膠體金溶液中添加的金黃色葡萄球菌蛋白A的終濃度為10μg/mL，10％PEG20000的添加量為2mL；步驟3)中金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針溶液中金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記的膠體金探針的終濃度為10％。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一項所述的制備方法，其特征在于將所述步驟3)獲得得的檢測肺炎球菌的免疫層析試紙背面粘貼一背板；所述纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述吸水墊為吸水紙；所述樣品墊為玻璃纖維膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肺炎球菌的免疫層析試紙及其制備方法。該試紙包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上設(shè)有相互分離的一條檢測線和一條質(zhì)控線；所述檢測線含有肺炎球菌表面粘附素A，所述質(zhì)控線含有能與所述金黃色葡萄球菌蛋白A特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明的免疫層析試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點，適于臨床和現(xiàn)場使用。
文檔編號G01N33/544GK1979168SQ200610165370
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者端青, 何斌, 朱虹, 檀華, 宋立華, 何君 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所