專利名稱：免疫紙層析條及用其快速檢測食品中致病菌和毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品常見致病菌或毒素的快速檢測，更具體地說，是涉及一種利用膠體金及免疫層析技術(shù)快速檢測食品中常見致病菌或毒素的免疫紙層析條極其檢測方法。
背景技術(shù)：
“民以食為天”人類要生存就離不開食物。在任何社會(huì)的經(jīng)濟(jì)中食品都是最重要的商品之一。因此，食品安全的問題為千千萬萬人所關(guān)注。但目前的食品安全問題卻不容樂觀。當(dāng)今世界，由于污染的食物引起疾病是生活水平下降、健康水平下降和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力下降的重要原因。食物中毒已是一種最普遍的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在1980年，除中國以外的發(fā)展中國家，有10億5歲以下的兒童患急性腹瀉病，其中有500萬患兒死亡，也就是說，當(dāng)年平均每分鐘就有10個(gè)腹瀉患兒死亡，其中大部分急性腹瀉病例是由微生物污染食物引起的。近年來，在美、日大腸桿菌O157H7食物中毒的爆發(fā)流行、比利時(shí)的“二惡英事件”、英國的“瘋牛病”都充分說明，食品面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
食物污染是引起人類疾病與死亡的重要原因，人類疾病的60％以上是由于在食物污染所致，隨著世界環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，食品中有害因素來源更加廣泛，種類也日益復(fù)雜。這些污染物一方面直接威脅人類健康，同時(shí)也污染作為食品的動(dòng)、植物，并通過食入進(jìn)而影響人體健康和生命安全。食品中可能出現(xiàn)的有害因素可分為三大類1.生物性污染。微生物、寄生蟲及蟲卵、昆蟲都可造成生物性污染。其中微生物污染主要是細(xì)菌與細(xì)菌毒素、霉菌與霉菌毒素所造成的污染，這是造成食品污染最常見的因素。2.化學(xué)性污染。包括各種有害金屬、非金屬有機(jī)化合物和無機(jī)化合物等，農(nóng)藥的污染在這類污染中占很大的比例。3.放射性污染。主要來自于放射性物質(zhì)的開采，冶煉以及生產(chǎn)和生產(chǎn)中的排放。在上述三大類中，生物性污染又是食物污染的主要原因。生物污染中，微生物污染又是生物污染的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國，1987年一1999年十年間有關(guān)食物中毒的報(bào)道中，細(xì)菌性食物中毒占食物中毒的42.86％，另據(jù)《1999年全國監(jiān)督統(tǒng)計(jì)報(bào)告》，在中毒人數(shù)上，細(xì)菌中毒人數(shù)為8505人，高于農(nóng)藥及化學(xué)物質(zhì)引起的中毒人數(shù)(5105人)，和動(dòng)、植物所引起的人數(shù)(2719人)。在國外，美國1993年-1997年的檢測結(jié)果，在病因明確的食物性疾病中，細(xì)菌性因素占總次數(shù)的75％，病例數(shù)的86％及死亡數(shù)的100％。食品細(xì)菌污染主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒桿菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特菌、霍亂弧菌、糞鏈球菌、大腸桿菌O157H7，等；毒素為葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素、黃曲霉毒素，等。
上述食品中常見致病菌或毒素廣泛存在于自然界中，在人和動(dòng)物中有廣泛的宿主，食物受到污染的機(jī)會(huì)很多，易受污染的食物種類也很多。食物中毒由于起病急，患者集中，因而快速的病原學(xué)診斷對(duì)疫情的控制尤為重要。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法主要是培養(yǎng)法，一般要經(jīng)過前增菌、選擇性增菌及生化血清學(xué)反應(yīng)的鑒定等步驟，常需5-7天，且很繁鎖，并且，因抗菌素的廣泛應(yīng)用的干擾素物質(zhì)的存在，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，有時(shí)致病菌根本培養(yǎng)不出來。
致病菌污染食物并在其中大量生長繁殖產(chǎn)生毒素是細(xì)菌性食物中毒發(fā)生的最主要原因，只有當(dāng)人體攝入大量的致病菌時(shí)才可能引起食物中毒。當(dāng)105-109個(gè)活菌進(jìn)入人體時(shí)才出現(xiàn)臨床癥狀，所以，亟需要建立一種速、敏感、特異、簡便的檢測食物中毒的方法。膠體金用于免疫學(xué)檢測研究是本世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，也是一項(xiàng)新的納米技術(shù)。1980年，Muller等人應(yīng)用該技術(shù)對(duì)牛痘進(jìn)行了免疫電鏡研究，同年，Geoghegan和Leuvering應(yīng)用膠體金進(jìn)行被動(dòng)凝集試驗(yàn)，1983年Leuvering利用膠體金做了人妊娠診斷研究，顯示了膠體金技術(shù)在診斷學(xué)應(yīng)用的廣闊前景。在隨后的研究中，有人將膠體金檢測技術(shù)與免疫層析技術(shù)結(jié)合，使細(xì)菌的快速檢測成為現(xiàn)實(shí)。免疫層析技術(shù)是八十年代初發(fā)展的快速免疫分析技術(shù)。它借助毛細(xì)作用，使樣品在條狀纖維制成的膜上泳動(dòng)，其中的待測物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過酶促反應(yīng)直接使用著色使用著色標(biāo)記，短時(shí)間便可得到直觀的結(jié)果。它不須進(jìn)行結(jié)合物與自由標(biāo)記物的分離，省去了煩瑣的加樣、洗滌步驟，因而操作簡便，快速，人員不用培訓(xùn)，不需儀器，很適合于現(xiàn)場使用。
但到目前為止，尚未見有國產(chǎn)免疫層析條檢測細(xì)菌的報(bào)道。國外有檢測霍亂弧菌、結(jié)核桿菌的報(bào)道，檢測限在105-106cfu/ml。國外檢測細(xì)菌的層析條采用單克隆抗體，對(duì)目樣品檢測前要進(jìn)行預(yù)處理(裂解)，較為繁鎖。單克隆抗體技術(shù)雖然特異性強(qiáng)，但由于結(jié)合位點(diǎn)單一，需采用針對(duì)抗原不同表位的兩種抗體；另外，細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間位阻使標(biāo)記有膠體金的單抗不易與細(xì)菌結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種敏感、特異、快速檢測食物中的常見致病菌或毒素的免疫紙層析條及敏感、特異、快速的檢測方法。
本發(fā)明膠體金標(biāo)記的免疫紙層析條，在載體表面設(shè)置有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜兩端分別設(shè)置有食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊和吸水板墊，所述兩墊之間依次固定有對(duì)照線、細(xì)菌抗體檢測線，所述食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊設(shè)置有吸收板墊。
所述的食品中常見致病菌為沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒桿菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特菌、霍亂弧菌、糞鏈球菌、大腸桿菌O157H7，等；毒素為葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素、黃曲霉毒素等。
本發(fā)明使用膠體金標(biāo)記的免疫紙層析條檢測食品中致病菌的方法，包括下述步驟(1)準(zhǔn)備待檢樣品液；(2)將權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條放置于待檢樣品液內(nèi)，樣品液高度不可超過膠體金結(jié)合物墊，(3)待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出免疫層析試紙，放置5～20分鐘觀察結(jié)果；(4)若檢測結(jié)果為細(xì)菌或毒素抗體檢測線顯色，則說明待檢驗(yàn)樣品含有目的細(xì)菌或毒素。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果是1.檢測操作簡便，對(duì)樣品不需進(jìn)行預(yù)處理、不需洗滌；2.檢測快速，不須任何儀器；3.不須人員培訓(xùn)，沒有受過任何專業(yè)培訓(xùn)的人員按說明書也可進(jìn)行樣品檢驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
本發(fā)明膠體金標(biāo)記的免疫紙層析條，在載體表面設(shè)置有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜兩端分別設(shè)置有食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊和吸水板墊，兩墊之間依次固定有對(duì)照線、細(xì)菌抗體檢測線，食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊設(shè)置有吸收板墊。
本發(fā)明膠體金標(biāo)記的免疫紙層析條的制備，首先收集食品中常見致病菌或毒素，即沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒桿菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特菌、霍亂弧菌、糞鏈球菌、大腸桿菌O157H7，葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素、黃曲霉毒素等，用于制備抗原，利用上述抗原免疫白兔，用于制備抗體，然后將抗體純化，用于制備免疫膠體金，將免疫膠體金與探針結(jié)合物墊結(jié)合，食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊置于硝酸纖維素膜的一端，另一端設(shè)置吸水板墊，兩墊之間依次固定有對(duì)照線、細(xì)菌或毒素抗體檢測線，食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊設(shè)置有吸收板墊。
結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明使用膠體金標(biāo)記的免疫紙層析條檢測食品中致病菌或毒素的方法做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1人工染沙門氏菌食品的檢測將米飯、切成片狀的饅頭以及市場上購賣的醬豬肝，火腿腸、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉生熟各50g，切成小片，放入潔凈錐形瓶中，加103/ml鼠傷寒沙門氏菌(菌種號(hào)為50020購自于衛(wèi)生部國家菌種保存中心)10ml，一定時(shí)間培養(yǎng)。固體樣品取10g放入另一錐形瓶中，加生理鹽水90ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液用于檢測；牛奶取1ml用9ml生理鹽水稀釋后直接用于檢測，各稀釋樣品液用瓊脂計(jì)數(shù)法計(jì)細(xì)菌總數(shù)。檢測方法為將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，(放置的高度不可超過檢測試紙條中的膠體金結(jié)合物墊)，待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出沙門氏菌免疫層析試紙，放置5分鐘觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，經(jīng)染菌的食品樣品液，細(xì)菌計(jì)數(shù)范圍在2.1×106～8.0×108cfu/ml層析條檢測都為陽性結(jié)果。
實(shí)施例2不同食品樣品制備方法的檢測將米飯、饅頭、醬豬肉100g切成小片，放入潔凈的錐形瓶中，加103cfu/ml甲型沙門氏菌(菌種號(hào)為50004購自于衛(wèi)生部國家菌種保存中心)10ml，一定時(shí)間培養(yǎng)。每份樣品各取10g分加放入含90ml生理鹽水、0.01mol/1 pH7.4磷酸鹽緩沖液、自來水、蒸餾水的錐形瓶中，劇烈振蕩，稍靜置，取上清液用于檢測，各稀釋樣品液用瓊脂計(jì)數(shù)法計(jì)細(xì)菌總數(shù)。檢測方法為將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，(放置的高度不可超過檢測試紙條中的膠體金結(jié)合物墊)，待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出沙門氏菌免疫層析試紙，放置10分鐘觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，經(jīng)染菌的食品樣品液，細(xì)菌計(jì)數(shù)范圍在2.2×106～7.8.0×108cfu/ml層析條檢測都為陽性結(jié)果實(shí)施例3人工染志賀氏菌食品的檢測米飯、切成片狀的饅頭以及市場上購賣的醬豬肝、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉生熟各50g，切成小片，放入潔凈錐形瓶中，加103/ml志賀氏菌(菌種號(hào)為51335購自于衛(wèi)生部國家菌種保存中心)10ml，一定時(shí)間培養(yǎng)。固體樣品取10g放入另一錐形瓶中，加生理鹽水90ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液用于檢測；牛奶取1ml用9ml生理鹽水稀釋后直接用于檢測，各稀釋樣品液用瓊脂計(jì)數(shù)法計(jì)細(xì)菌總數(shù)。檢測方法為將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，(放置的高度不可超過檢測試紙條中的膠體金結(jié)合物墊)，待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出沙門氏菌免疫層析試紙，放置15分鐘觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，經(jīng)染菌的食品樣品液，細(xì)菌計(jì)數(shù)范圍在1.7×106～6.6×108cfu/ml層析條檢測都為陽性結(jié)果。
實(shí)施例4人工染葡萄球菌食品的檢測米飯、切成片狀的饅頭以及市場上購賣的醬豬肝、豬肉、牛肉、餅干、雞肉、鴨肉生熟各50g，切成小片，放入潔凈錐形瓶中，加103/ml志賀氏菌(菌種號(hào)為26073購自于衛(wèi)生部國家菌種保存中心)10ml，一定時(shí)間培養(yǎng)。固體樣品取10g放入另一錐形瓶中，加生理鹽水90ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液用于檢測；牛奶取1ml用9ml生理鹽水稀釋后直接用于檢測，各稀釋樣品液用瓊脂計(jì)數(shù)法計(jì)細(xì)菌總數(shù)。檢測方法為將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，(放置的高度不可超過檢測試紙條中的膠體金結(jié)合物墊)，待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出沙門氏菌免疫層析試紙，放置20分鐘觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，經(jīng)染菌的食品樣品液，細(xì)菌計(jì)數(shù)范圍在1.4×106～7.6×108cfu/ml層析條檢測都為陽性結(jié)果。
本發(fā)明是對(duì)食品中常見致病菌或毒素和食物中毒快速檢測的新技術(shù)及應(yīng)用。目前，國內(nèi)外有許多關(guān)于應(yīng)用膠體金免疫層析試紙檢測可溶性抗原的報(bào)道，作為顆粒性抗原的細(xì)菌，國外用萃取或其它方法處理后再檢測。本發(fā)明選用特點(diǎn)的專用層析膜，優(yōu)化其它條件，使免疫層析條能直接用于檢測細(xì)菌。各種人工污染的食品，經(jīng)簡單處理即可用于檢測，檢測靈敏度與純培養(yǎng)的菌懸液相同。人工染菌的米飯、豬肉樣品，用生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、自來水處理，檢測結(jié)果未見差別。這極大地方便了現(xiàn)場樣品的處理和檢測，預(yù)示該免疫層析試紙條所具有的廣闊的應(yīng)用前景。其推廣必為人類防疫治病做出創(chuàng)造性的貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種免疫紙層析條，在載體表面設(shè)置有硝酸纖維素膜，其特征是，所述硝酸纖維素膜兩端分別設(shè)置有食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊和吸水板墊，所述兩墊之間依次固定有對(duì)照線、細(xì)菌抗體檢測線，所述食品中常見致病菌或毒素膠體金探針結(jié)合物墊設(shè)置有吸收板墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫紙層析條，其特征是，所述的食品中常見致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒桿菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特菌、霍亂弧菌、糞鏈球菌、大腸桿菌O157H7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫紙層析條，其特征是，所述的食品中毒素包括葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素、黃曲霉毒素。
4.一種使用權(quán)利要求1所述的免疫紙層析條快速檢測食品中致病菌和毒素的方法，其特征是，包括下述步驟(1)準(zhǔn)備待檢樣品液；(2)將權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條放置于待檢樣品液內(nèi)，樣品液高度不可超過膠體金結(jié)合物墊，(3)待樣品液泳動(dòng)到吸收板墊時(shí)，取出免疫層析試紙，放置5～20分鐘觀察結(jié)果；(4)若檢測結(jié)果為細(xì)菌或毒素抗體檢測線顯色，則說明待檢驗(yàn)樣品含有目的細(xì)菌或毒素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種敏感、特異、快速檢測食物中的常見致病菌或毒素的免疫紙層析條及敏感、特異、快速的檢測方法。本發(fā)明免疫紙層析條及用其快速檢測食品中致病菌和毒素的方法是對(duì)食品中常見致病菌或毒素和食物中毒快速檢測的新技術(shù)及應(yīng)用。目前，國內(nèi)外有許多關(guān)于應(yīng)用膠體金免疫層析試紙檢測可溶性抗原的報(bào)道，作為顆粒性抗原的細(xì)菌，國外用萃取或其它方法處理后再檢測。本發(fā)明選用特點(diǎn)的專用層析膜，優(yōu)化其它條件，使免疫層析條能直接用于檢測細(xì)菌。既可用于食品中常見致病菌的快速檢測，也可用于食物中毒的快速診斷。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1458527SQ0314265
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者李君文, 宋農(nóng), 王新為, 鄭金來, 古長慶, 金敏, 晁福寰 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所