本發(fā)明屬于模擬酶技術領域，具體涉及一種由金屬銅配合物制備的模擬酶及其制備方法。

背景技術：

自然界的酶作為一種高效的生物催化劑，能夠有效地參與絕大多數(shù)反應，因其具有高效性，高度的專屬性，溫和的反應條件等特點，酶催化反應應用極其廣泛，例如：臨床診斷、生物技術、化學、環(huán)境科學等。然而，由于酶自身的不穩(wěn)定性，貯存和使用不方便，成本高以及提純困難等因素，限制了酶在一些領域的應用。近幾年來，研究人員開始越來越多的關注和研究模擬酶，使其具有和自然酶相似的功能。并試圖弄清關于酶活性部位作用機制的基本原理。設計和構造模擬酶已經(jīng)成為眾多科研領域科學家們共同挑戰(zhàn)的難題。到目前為止科學家們已研究出眾多模擬酶，例如：模擬絲氨酸蛋白酶、模擬磷酸二酯酶、模擬連接酶以及模擬核酸酶等。并且目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如co3o4、v2o5等過渡金屬氧化物納米粒子、pt單金屬納米粒子等均具有模擬酶的特性。鑒于自然界酶的不穩(wěn)定性，貯存和使用不方便，成本高以及提純困難等諸多缺陷，研發(fā)利用各種高效模擬酶就顯得十分必要。

本發(fā)明解決其技術問題而采用的技術方案如下：

一種由金屬銅配合物制備的模擬酶，它的分子表達式為cuo@sio2-nh2-fa。

一種由金屬銅配合物制備模擬酶的方法，包括步驟如下：

(1)配合物①--[cu(l)(ch3cooh)]n的合成，

稱取0.25mmolcuo,0.25mmol5-(3-甲基-5-苯基-4h-1,2,4-三唑-4-基)苯甲酸配體(hl)，0.25mmolnh4cl，2mlch3cooh和12ml水，100瓦超聲20分鐘，轉移到25ml聚四氟乙烯的反應釜中，2小時內升溫至140℃，恒溫96小時，然后72小時內降到25℃，有褐色塊狀晶體析出，用蒸餾水洗滌三次得配合物①；

(2)配合物①煅燒產(chǎn)物的制備

將配合物①進行高溫煅燒得配合物①煅燒產(chǎn)物，即產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物；

(3)上述氧化產(chǎn)物的修飾及表征

①cuo@sio2的制備：稱取10mg樣品，分別稱取5份，放入5ml塑料離心管，之后對樣品進行處理，將0.1mol/l的稀鹽酸加入放了樣品的塑料離心管中，超聲20分鐘，離心5分鐘，棄去稀鹽酸，然后水洗，分散到20ml乙醇，5ml水，0.25ml氨水中，超聲使其充分混合之后，加入0.03gteos，將其放入搖床，轉速140rpm，室溫震蕩6小時，之后進行粒子分離，再用乙醇洗，重懸，得到cuo@sio2，留樣用于(ir)表征；

②cuo@sio2-nh2的制備：將上述cuo@sio2分散在4ml乙醇中，然后加入50μlaptms，超聲使其充分混合，然后放入搖床，轉速140rpm，室溫震蕩24小時，得到cuo@sio2-nh2，留樣用于(ir)表征；

③葉酸活化；

④cuo@sio2-nh2-fa的制備：將上述所得cuo@sio2-nh2重懸于2.5ml60％乙醇中，超聲使其充分混合之后加入上述活化后的葉酸2.5ml，室溫反應24小時，離心5分鐘，反復用乙醇洗滌，最后真空干燥，得到最終由金屬銅配合物制備的模擬酶cuo@sio2-nh2-fa。

而且，所述步驟(2)中的高溫煅燒具體步驟為馬弗爐900℃煅燒5小時，得到黑灰色固體。

而且，所述步驟(3)中③葉酸活化的具體步驟為：取葉酸40mg，加入edc20mg，nhs12mg，dmso12.5ml，活化24小時。

本發(fā)明的優(yōu)點及效果：

1、本發(fā)明中的模擬酶是通過配合物的煅燒產(chǎn)物經(jīng)修飾得到的，而化學方法制備的模擬酶穩(wěn)定性高，貯存方便，成本較低。

2、本發(fā)明通過對配合物的表征，煅燒產(chǎn)物的修飾與表征等方面的研究，進一步將其應用于酶催化研究中，并最終通過實驗研究證明所得到的修飾產(chǎn)物具有過氧化氫模擬酶性質。

附圖說明

圖1配合物①沿ab面的二維結構圖；

圖2是cuo粒子的xrd圖：白色線是樣品的xrd，綠色線是標準庫中cuo的xrd；

圖3煅燒產(chǎn)物修飾后的紅外圖譜；

圖4a不同h2o2濃度時材料cuo@sio2-nh2的模擬酶的紫外曲線；圖4b不同h2o2濃度時材料cuo@sio2-nh2-fa的模擬酶的紫外曲線；

圖5a材料cuo@sio2-nh2的不同ph下模擬酶的紫外曲線；圖5b材料cuo@sio2-nh2-fa的不同ph下模擬酶的紫外曲線；

圖6a不同濃度的材料cuo@sio2-nh2的模擬酶的紫外曲線；圖6b不同濃度的材料cuo@sio2-nh2-fa的模擬酶的紫外曲線。

圖7a不同溫度下材料cuo@sio2-nh2-fa的模擬酶的紫外曲線；圖7b不同溫度下材料cuo@sio2-nh2-fa的模擬酶的紫外曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施方案對本發(fā)明進一步說明，其具體實施方案應該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護范圍。

一種由金屬銅配合物制備的模擬酶，它的分子表達式為cuo@sio2-nh2-fa。

一種由金屬銅配合物制備模擬酶的方法，包括步驟如下：

(1)配合物①--[cu(l)(ch3cooh)]n的合成，

稱取0.25mmolcuo,0.25mmol5-(3-甲基-5-苯基-4h-1,2,4-三唑-4-基)苯甲酸配體(hl)，0.25mmolnh4cl，2mlch3cooh和12ml水，100瓦超聲20分鐘，轉移到25ml聚四氟乙烯的反應釜中，2小時內升溫至140℃，恒溫96小時，然后72小時內降到25℃，有褐色塊狀晶體析出，用蒸餾水洗滌三次得配合物①；

產(chǎn)率以cuo為基準，約75％，元素分析(％):c13h8n6cu2計算值:c,53.75；h,3.98；n,10.45.測定值:c,53.07；h,3.57；n,10.13。

(2)配合物①煅燒產(chǎn)物的制備

將配合物①進行高溫煅燒得配合物①煅燒產(chǎn)物，即產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物；

在本發(fā)明的具體實施中，所述高溫煅燒具體步驟為馬弗爐900℃煅燒5小時，得到黑灰色固體，所得產(chǎn)物的xrd見圖2。

(3)上述氧化產(chǎn)物的修飾及表征

①cuo@sio2的制備：稱取10mg樣品，分別稱取5份，放入5ml塑料離心管，之后對樣品進行處理，將0.1mol/l的稀鹽酸加入放了樣品的塑料離心管中，超聲20分鐘，離心5分鐘，棄去稀鹽酸，然后水洗，分散到20ml乙醇，5ml水，0.25ml氨水中，超聲使其充分混合之后，加入0.03gteos，將其放入搖床，轉速140rpm，室溫震蕩6小時，之后進行粒子分離，再用乙醇洗，重懸，得到cuo@sio2，留樣用于(ir)表征，見圖3；

②cuo@sio2-nh2的制備：將上述cuo@sio2分散在4ml乙醇中，然后加入50μlaptms，超聲使其充分混合，然后放入搖床，轉速140rpm，室溫震蕩24小時，得到cuo@sio2-nh2，留樣用于(ir)表征，見圖3；

③葉酸活化：

在本發(fā)明的具體實施中，所述葉酸活化的具體步驟為：取葉酸40mg，加入edc20mg，nhs12mg，dmso12.5ml，活化24小時。

④cuo@sio2-nh2-fa的制備：將上述所得cuo@sio2-nh2重懸于2.5ml60％乙醇中，超聲使其充分混合之后加入上述活化后的葉酸2.5ml，室溫反應24小時，離心5分鐘，反復用乙醇洗滌，最后真空干燥，得到最終由金屬銅配合物制備的模擬酶cuo@sio2-nh2-fa，留樣用于(ir)表征，見圖3。

實驗及驗證

本實驗所使用部分試劑的縮寫為3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)、葉酸(fa)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)。5-(3-甲基-5-苯基-4h-1,2,4-三唑-4-基)苯甲酸配體(hl)根據(jù)現(xiàn)有公開文獻報道方法合成。本實驗所使用的設備包括x-射線單晶衍射儀、x射線衍射分析儀(xrpd)、tensor27型傅立葉變換紅外光譜儀(ir)、jasco-uv-570型紫外可見分光光度計。實驗的內容如下：

(1)相關表征與分析

采用x-射線單晶衍射儀測定配合物①的單晶結構，采用x射線衍射分析儀(xrpd)測定煅燒產(chǎn)物的衍射數(shù)據(jù)，采用tensor27型傅立葉變換紅外光譜儀(ir)對修飾產(chǎn)物進行結構分析。

(2)模擬酶性質實驗

①h2o2濃度對材料模擬酶活性的影響

在5ml離心管中加入2.7ml，ph為3.6的緩沖溶液，然后加入120μl，0.2mmol·l^-1的tmb，再加入60μl濃度梯度0.004，0.006，0.008，0.01，0.02mol·l^-1的h2o2溶液，再加入120μl，300μg·ml^-1的材料，使總體積為3ml。通過紫外光譜，觀察溶液在652nm波長下的吸光度，從而確定最適h2o2濃度。結果見圖4a和圖4b。

②ph對材料模擬酶活性的影響

在5ml離心管中加入2.7ml、ph分別為3.6、4.0、4.6、5.0、5.6的緩沖溶液，然后加入120μl，0.2mmol·l^-1的tmb，再加入60μl的h2o2溶液，再加入120μl，300μg·ml^-1的材料，使總體積為3ml。通過紫外光譜，觀察溶液在652nm波長下的吸光度，從而確定最適ph。結果見圖5a和圖5b。

③材料濃度對材料模擬酶活性的影響

在5ml離心管中加入2.7ml，ph為3.6的緩沖溶液，然后加入120μl，0.2mmol·l^-1的tmb，再加入60μl，0.06mol·l^-1的h2o2溶液，再加入120μl，300μg·ml^-1的材料，使總體積為3ml。通過紫外光譜，觀察溶液在652nm波長下的吸光度，從而確定最適的材料濃度。結果見圖6a和圖6b。

④溫度對材料模擬酶活性的影響

在5ml離心管中加入2.7ml，ph為3.6的緩沖溶液，然后加入120μl，0.2mmol·l^-1的tmb，再加入60μl，0.06mol·l^-1的h2o2溶液，再加入120μl，300μg·ml^-1的材料，使總體積為3ml。加完后分別在40，50，60，70，80℃水浴20min。然后在652nm波長下測定吸光度，從而確定最適溫度。結果見圖7a和圖7b。

結果與討論

(1)配合物的晶體結構

配合物①的晶體學參數(shù)見表1，在配合物①[cu(l)(ch3cooh)]n中，配體l^-只有一種配位模式(配體l^-為μ3配位模式)。單晶衍射分析表明配合物①屬于單斜晶系，p21/c空間群。如圖1a所示，配合物①的最小不對稱單元包括一個獨立的cu(i)離子,一個l^-配體,一個游離ch3cooh。金屬中心位于三配位的平面三角形構型，配位原子來自于三個不同l^-配體的氮原子(cu1-n1，cu1-n2b，cu1-o1a，)。兩個不同l^-配體的氮原子螯合兩個cu(i)離子，形成六元環(huán)(cu1-n1-n2-cu1b-n1b-n2b)。六元環(huán)之間通過配體的三氮唑連接到一起，產(chǎn)生二維結構，如圖1所示。cu-o鍵鍵長為cu-n鍵鍵長從到

表1配合物①的晶體學參數(shù)

表2配合物的部分鍵長和鍵角(°)

對稱操作碼:#1-x,y-1/2,-z+3/2；#2-x+1,-y+1,-z+1；#3-x。