專利名稱：帶魚抗氧化肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種以帶魚為原料，通過復(fù)合酶水解帶魚蛋白質(zhì)，酶解一膜分離耦合制備抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
帶魚又名刀魚、牙帶魚，是魚綱鱸形目帶魚科動(dòng)物，是我國沿海產(chǎn)量較高的一種經(jīng)濟(jì)魚類，味道鮮美，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。帶魚具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，對(duì)病后體虛、產(chǎn)后乳汁不足和外傷出血等癥具有一定食療作用。中醫(yī)認(rèn)為它具有和中開胃、暖胃補(bǔ)虛、潤澤肌膚及美容等功效。帶魚體內(nèi)蛋白質(zhì)含量高，并且?guī)~蛋白質(zhì)是一種全價(jià)蛋白質(zhì)，含有人體必需的八種氨基酸；還含有鈣、磷、鐵等微量元素，營養(yǎng)豐富。然而，隨著捕撈強(qiáng)度的增大，海洋 捕撈的小帶魚產(chǎn)量呈逐年上升趨勢；小帶魚由于體型小，直接食用的價(jià)值較低；現(xiàn)在主要用來生產(chǎn)魚粉等低值產(chǎn)品，更有作為廢棄物直接丟棄，導(dǎo)致資源未得到充分利用，經(jīng)濟(jì)效益低下，甚至污染環(huán)境。自從Harman提出自由基理論以來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)?？寡趸瘎┩ㄟ^清除自由基，調(diào)整和改善人體生理功能，從而達(dá)到預(yù)防和治療慢性疾病的目的。由于化學(xué)合成抗氧化劑的不安全性，高效、無毒的天然抗氧化劑成為開發(fā)研究的重點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化肽具有活性強(qiáng)、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)。天然蛋白質(zhì)特別是海洋蛋白質(zhì)，基于生長環(huán)境的特異性，其多肽鏈中存在功能、結(jié)構(gòu)新穎的活性片段；采用酶工程的技術(shù)手段水解蛋白質(zhì)，釋放有生物活性的抗氧化肽，已成為制備抗氧化肽的一種重要方法。抗氧化肽的活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而結(jié)構(gòu)取決于氨基酸序列和分子量大小。一般來說，分子量低于3000Da的肽類具有更高的抗氧化活性。低分子量抗氧化肽以其抗氧化能力強(qiáng)、較氨基酸更易為人體所吸收等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品等行業(yè)。酶解一膜分離耦合技術(shù)可在酶解的同時(shí)利用膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，目標(biāo)肽被分離出來，酶、大分子多肽和蛋白則返回到反應(yīng)體系中繼續(xù)酶解。這種技術(shù)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)通過產(chǎn)物的在線分離，減少產(chǎn)物抑制效應(yīng)和過度降解，提高產(chǎn)物活性；通過酶的循環(huán)使用，提聞酶的利用率。目前，國內(nèi)已有人采用酶法水解制備抗氧化肽報(bào)道,但現(xiàn)有技術(shù)多使用一種酶水解。其美中不足是，由于僅采用一種酶水解蛋白質(zhì)，并且在制備抗氧化肽的過程中，采用的超濾膜的截留分子量為5000Da IOOOODa ;導(dǎo)致得到的抗氧化肽的抗氧化能力較低，超氧陰離子自由基清除率僅為24. 8 28. 2% ；DPPH自由基清除率也只有40. 2 47. 1%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能充分利用原材料、獲得具有較高抗氧化能力的帶魚抗氧化肽的制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種帶魚抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟(I)將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈稱重，加入I 3倍帶魚質(zhì)量的水，絞碎成均勻的魚肉漿；(2)將步驟(I)制備的魚肉漿放入酶解罐中，添加帶魚質(zhì)量0. 2% 0. 9%的內(nèi)切蛋白酶，調(diào)溫至45 70°C，調(diào)pH至5. 5 8. 5，攪拌水解8 14h，得水解液；(3)將步驟(2)所得水解液離心410(T4500rpm、2 6°C、12 14分鐘，取上清液；(4)將步驟(3)的上清液經(jīng)過0. 45um (微米)的微孔濾膜進(jìn)行微濾后放入酶解罐，然后添加帶魚質(zhì)量0. 1% 0. 9%的外切蛋白酶，調(diào)溫至40 55°C，調(diào)pH至5. 0 8. 0，攪拌水解7 IOh ;在上述水解過程中將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0. I 0. 5L/min的流量循環(huán)；調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0. 07 0. 09Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da，進(jìn)行酶解一膜分離耦合反應(yīng)；小于膜截留分子量的分子透過膜，未透過部分則返回酶解罐繼續(xù)酶解，反應(yīng)過程中每隔1(T15分鐘向酶解罐中補(bǔ)加水，以保持反應(yīng)體系體積恒定，收集超濾膜透過液；(5)反應(yīng)結(jié)束后，將收集的超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積的1/10 1/5，-18 -20°C預(yù)凍過夜，-6(T-65°C、0. 005 0. 0054mbar (毫巴)冷凍干燥22 24h，即得到
帶魚抗氧化肽。步驟(2)所述的內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶或Alcalase堿性蛋白酶；酶解過程中保持溫度和PH的恒定。步驟(4)所述外切蛋白酶為Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶、氨肽酶或羧肽酶；酶解過程中保持溫度和PH的恒定。本發(fā)明上述帶魚質(zhì)量指的是步驟(I)將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈稱重后的帶魚質(zhì)量。本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果(I)本發(fā)明先使用內(nèi)切蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為分子量較大、肽鏈較長的多肽，并通過離心(離心過程采用在4°C條件下操作，仍能保持酶的活性，在后面的循環(huán)步驟中使得內(nèi)、外切酶始終處于活性狀態(tài)，從而更有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)水解)、微濾等手段將可溶性多肽與不溶性組分分離；再使用外切蛋白酶進(jìn)一步水解。由于內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，使得蛋白質(zhì)水解更有效，更加有利于低分子量的抗氧化肽的釋放，避免現(xiàn)有技術(shù)的單--種酶帶來的缺陷；(2)本發(fā)明超濾膜分離器采用的膜截留分子量為3000Da，進(jìn)一步保證了低分子量的抗氧化肽的制備、制得的抗氧化肽具有較高抗氧化活性。(3)與傳統(tǒng)先酶解、再分離制備抗氧化肽的工藝相比，本發(fā)明采用酶解一膜分離耦合反應(yīng)制備帶魚抗氧化肽，使得反應(yīng)和分離同時(shí)進(jìn)行，能及時(shí)將抗氧化肽從體系中分離出來，避免活性抗氧化肽受到酶的進(jìn)一步分解而失去功能；同時(shí)也把大分子留在反應(yīng)體系中繼續(xù)酶解，提高了酶的使用效率和抗氧化肽產(chǎn)物的得率。(4)本發(fā)明的帶魚抗氧化肽的制備方法，具有工藝簡便，如帶魚原料僅僅通過簡單的處理即可使用、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短的優(yōu)點(diǎn)。帶魚抗氧化肽可廣泛用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng)域，為低值小帶魚的深加工生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了一條有效途徑。
具體實(shí)施例方式下面給出3個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，但本發(fā)明不僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例I :將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈并稱取I. Okg帶魚，加入3. Okg水，絞碎成均勻的魚肉漿；將魚肉漿放入酶解罐中，調(diào)溫至60°C，調(diào)pH至7. 5，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加帶魚質(zhì)量0. 9%的Alcalase堿性蛋白酶，攪拌水解12h ;將水解液離心4500rpm，4°C、12分鐘，取上清液。將上清液經(jīng)過0. 45um(微米)的微孔濾膜進(jìn)行微濾后放入酶解罐，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加0. 9%的Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶,調(diào)溫至50°C,調(diào)pH至6. 5,攪拌水解IOh ;在上述水解過程中將酶解液(也可稱水解液)從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0. lL/min的流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0. 09Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da小于超濾膜截留分子量的分子透過膜即得到透過液，未透過部分則返回酶解罐 繼續(xù)酶解，反應(yīng)過程中每隔10分鐘向酶解罐中補(bǔ)加水，以保持反應(yīng)體系體積恒定，收集超濾膜透過液；反應(yīng)結(jié)束后，將收集的超濾膜透過液減壓濃縮至原體積的1/10，-20°c預(yù)凍過夜，_65°C、0. 0054mbar冷凍干燥24h,得到帶魚抗氧化肽。采用重量法測定帶魚抗氧化肽的收率為18. 5%(收率定義為IOOg濕重帶魚獲得的抗氧化肽的質(zhì)量g)。采用SphadexG-75凝膠過濾層析，測定帶魚抗氧化肽的相對(duì)分子質(zhì)量，帶魚抗氧化肽的平均分子量為898Da。采用鄰二氮菲法測定帶魚抗氧化肽的羥基自由基清除率；鄰苯三酚自氧化法測定帶魚抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除率；DPPH法測定帶魚抗氧化肽的DPPH自由基清除率。結(jié)果表明羥基自由基清除率為82. 0%，超氧陰離子自由基清除率為85. 2%，DPPH自由基清除率為 61. 5%。實(shí)施例2 將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈并稱取2. Okg帶魚，加入5. Okg水，絞碎成均勻的魚肉漿；將魚肉漿放入酶解罐中，調(diào)溫至50°C，調(diào)pH至7. 0，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加0. 8%的Neutrase中性蛋白酶，攪拌水解IOh ;將水解液離心，4500rpm，4°C、14分鐘，取上清液。將上清液經(jīng)過0. 45um的微孔濾膜進(jìn)行微濾后放入酶解罐，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加0. 5%的羧肽酶，調(diào)溫至40°C，調(diào)pH至5. 5，攪拌水解9h ;在上述水解過程中將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0. 25L/min的流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0. 09Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da ;反應(yīng)結(jié)束后，將收集的超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積的1/8，-20°C預(yù)凍過夜，_65°C，0. 0054mbar，冷凍干燥24h，得到帶魚抗氧化肽。采用重量法測定帶魚抗氧化肽的收率為17.8% (收率定義為IOOg濕重帶魚獲得的抗氧化肽的質(zhì)量g)。采用SphadexG-75凝膠過濾層析,測定帶魚抗氧化肽的相對(duì)分子質(zhì)量，帶魚抗氧化肽的平均分子量為1202Da。采用鄰二氮菲法測定帶魚抗氧化肽的羥基自由基清除率；鄰苯三酚自氧化法測定帶魚抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除率；DPPH法測定帶魚抗氧化肽的DPPH自由基清除率。結(jié)果表明羥基自由基清除率為78.0%，超氧陰離子自由基清除率為82.6%，DPPH自由基清除率為57.8%。實(shí)施例3 將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈并稱取2. 5kg帶魚，加入5. Okg 7jC，絞碎成均勻的魚肉漿；將魚肉漿放入酶解罐中，調(diào)溫至50°C，調(diào)pH至6. 5，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加0. 5%的木瓜蛋白酶，攪拌水解14h ;將水解液離心，4500rpm，4°C、13分鐘，取上清液。將上清液經(jīng)過0. 45um的微孔濾膜進(jìn)行微濾后放入酶解罐，以帶魚質(zhì)量計(jì)，添加0. 8%的氨肽酶，調(diào)溫至45°C，調(diào)pH至7. 5，攪拌水解8h ;在上述酶解過程中將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0. 4L/min的流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0. 08Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da ；反應(yīng)結(jié)束后，將收集的超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積的1/5，-20°C預(yù)凍過夜，-65°C,0. 0054mbar，冷凍干燥24h，得到帶魚抗氧化肽。采用重量法測定帶魚抗氧化肽的收率為16.7% (收率定義為IOOg濕重帶魚獲得的抗氧化肽的質(zhì)量g)。采用SphadexG-75凝膠過濾層析，測定帶魚抗氧化肽的相對(duì)分子質(zhì)量，帶魚抗氧化肽的平均分子量為1528Da。采用鄰二氮菲法測定帶魚抗氧化肽的羥基自由基清除率；鄰苯三酚自氧化法測定帶魚抗氧化肽 的超氧陰離子自由基清除率；DPPH法測定帶魚抗氧化肽的DPPH自由基清除率。結(jié)果表明羥基自由基清除率為74.6%，超氧陰離子自由基清除率為78.2%，DPPH自由基清除率為56. 5%。
權(quán)利要求
1.一種帶魚抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將帶魚去頭、尾和內(nèi)臟，洗凈稱重，加入I 3倍帶魚質(zhì)量的水，絞碎成均勻的魚肉漿； (2)將步驟(I)制備的魚肉漿放入酶解罐中，添加帶魚質(zhì)量0.2% 0. 9%的內(nèi)切蛋白酶，調(diào)溫至45 70°C，調(diào)pH至5. 5 8. 5，攪拌水解8 14h，得水解液； (3)將步驟(2)所得水解液離心410(T4500rpm、2 6°C、12 14分鐘，取上清液； (4)將步驟(3)的上清液經(jīng)過0.45微米的微孔濾膜進(jìn)行微濾后放入酶解罐，然后添加帶魚質(zhì)量0. 1% 0. 9%的外切蛋白酶，調(diào)溫至40 55°C，調(diào)pH至5. 0 8. 0，攪拌水解7 IOh ； 在上述水解過程中將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0. I 0. 5L/min的流量循環(huán)；調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0. 07 0. 09Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da，進(jìn)行酶解一膜分離耦合反應(yīng)；小于膜截留分子量的分子透過膜，未透過部分則返回酶解罐繼續(xù)酶解，反應(yīng)過程中每隔1(T15分鐘向酶解罐中補(bǔ)加水，以保持反應(yīng)體系體積恒定，收集超濾膜透過液； (5)反應(yīng)結(jié)束后，將收集的超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積的1/10 l/5，-18'20°C預(yù)凍過夜，-60^-650C >0. 005 0. 0054mbar冷凍干燥22 24h，即得到帶魚抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的帶魚抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶或Alcalase堿性蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的帶魚抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的外切蛋白酶為Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶、氨肽酶或羧肽酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種帶魚抗氧化肽的制備方法，包括加水將帶魚絞成魚肉漿；將魚肉漿入酶解罐，添加帶魚質(zhì)量0.2～0.9%內(nèi)切蛋白酶、水解；將水解液離心取上清液；將上清液微濾后入酶解罐，添加帶魚質(zhì)量0.1～0.9%外切蛋白酶、水解；水解過程將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0.1～0.5L/min的流量循環(huán)；收集超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積1/10～1/5，-18~-20℃過夜，-60~-65℃、0.005~0.0054mbar冷凍干燥，得目標(biāo)產(chǎn)品。本發(fā)明的帶魚抗氧化肽抗氧化活性較強(qiáng)，羥基自由基清除率達(dá)82.0％，超氧陰離子自由基清除率達(dá)85.2％，DPPH自由基清除率達(dá)61.5％。
文檔編號(hào)B01D61/14GK102747125SQ20121021598
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者吳惠岳, 周斌, 武玉學(xué), 靳挺 申請人:寧波武盛化學(xué)有限公司