包括進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光分析，其中電化 學(xué)發(fā)光分析是電化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光DNA測(cè)定。
[0111] 在電化學(xué)發(fā)光分析中，電中性的金屬配合物受促發(fā)光。在一確定時(shí)間段內(nèi)。所發(fā)出 的光的強(qiáng)度或者光子數(shù)與被測(cè)物的濃度相關(guān)。 實(shí)施例
[0112] 配體合成
[0113] 1.具有生物偶聯(lián)基團(tuán)的2,2'_聯(lián)吡啶配體合成:4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)正丁酸(化 合物3) ^Λ? ? >1 ?
[0115] 將35〇111以0.56111〇1)1.61的正丁基鋰的己烷溶液加入-78°〇的含二異丙基胺 (82.8mL，0.59mol)的1.5L無水四氫呋喃(THF)中，在-78°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下攪拌該混合物1 個(gè)小時(shí)。86.6g(0.50mol )2_溴-4-甲基吡啶溶于200mLTHF中，然后將該溶液加入到二異丙基 氨基鋰(LDA)溶液中。反應(yīng)4小時(shí)后，將3-溴丙腈(75g，0.56mo 1)溶于1 OOmL無水THF的溶液滴 加到混合物中，反應(yīng)溫度提升到〇°C，在此溫度下繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物倒入 500mL水中，并用1M的鹽酸中和該溶液。產(chǎn)物用乙酸乙酯萃出。合并的乙酸乙酯溶液經(jīng)鹽水 洗滌后，用無水硫酸鎂干燥，隨后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。粗產(chǎn)品經(jīng)過柱色譜分離后，得到51.5g化合物1 (收率為46%)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8·30(1Η)，7·35(1Η)，7·11(1Η)，2·78(2Η)，2·40 (2Η)，2·01(2Η) 〇
[0116] 將 18.38(81.3111〇1)化合物1和3(^(81.5111〇1)2-(三正丁基錫）吡啶在40011^甲苯中 用氮?dú)夤呐?0分鐘，隨后加入5.0g四（三苯基膦）。該混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流60個(gè)小時(shí)后 冷卻至室溫。將混合物中的黑色固體濾除，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再重新用二氯甲烷溶解。該溶 液通過一個(gè)經(jīng)過三乙胺處理過的硅膠色譜柱，用乙醚/乙酸乙酯（1:1)洗脫。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得 至丨Jl5g化合物2(收率為81.5%) </H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8.67( 1H)，8.59( 1H)，8.40( 1H)， 8·26(1Η)，7·81(1Η)，7·31(1Η)，7·14(1Η)，2·85(2Η)，2·37(2Η)，2·05(2Η)。
[0117] 將1 OOmL濃鹽酸（12mo 1L-1)加入15g (67 · 2mmo 1)化合物2中并回流19個(gè)小時(shí)。往室溫 下的酸混合物中加入氨水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH至5。產(chǎn)物用乙酸乙酯萃出，旋蒸得到灰色粉末， 再重新用甲醇溶解后滴入水中。經(jīng)過濾和真空干燥后收集到白色沉淀物3。得到10.5g(收率 64.5%)。咕 NMR(CD30D，400M Hz，見圖2)δ8 ·65( 1Η)，8·53( 1Η)，8 ·27( 1Η)，8 ·17( 1Η)，7·93 (1Η)，7·43(1Η)，7·32(1Η)，2·79(2Η)，2·37(2Η)，2·01(2Η)。
[0118] 2.具有生物偶聯(lián)基團(tuán)的1，10-菲咯啉配體的合成:5-((菲咯啉-5-)氨基)-5-戊酮 酸(化合物4)。
[0119]
[0120] 將158(76.8111111〇1)1，10-菲咯啉-5-胺和9.28(80111111〇1)戊二酐在15011^01^中混合。 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱反應(yīng)混合物至50°C持續(xù)7小時(shí)。反應(yīng)完成后，將溶劑DMF旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用乙 醇洗滌殘余物并過濾。將得到的固體研磨后，再用乙醇洗滌，隨后真空干燥，得到llg白色粉 末4(收率46%)</H NMR(CD30D，400M Ηζ)δ12· 13(s，lH)，10.12(s，lH)，9.10-9.00(d，J = 36Hz，2H)，8.58(d，lH)，8.44-8.42(d，J=8Hz，lH)，8.16(s，lH)，7.82-7.79(m，lH)，7.73-7·70(m，1H)，2·56(m，2H)，2·33(m，2H)，1·94-1·86(m，2H)。
[0121] 3. -價(jià)陰離子配體(鹽形式)合成：（4'_甲基_2,2'_聯(lián)吡啶-4-基）甲磺酸鈉(化合 物6)
[0122]
[0123] 將20g(108.5mmo 1)4，4 ' -二甲基-2，2 ' -聯(lián)吡啶溶解于400mL無水四氯甲烷中，再加 入19g(106.8mmol )N-溴代琥珀酰亞胺和2.6g過氧化苯甲酰。將混合物回流過夜并冷卻至室 溫。濾除混合物中的固體，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。將濃縮液通過經(jīng)過三乙胺處理的硅膠色 譜柱，得到68的4-(溴甲基)-4'-甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(化合物5)，將其與4.98(38.9_31)亞硫 酸鈉和100mL水混合，所得渾濁液回流6小時(shí)。趁熱將上清液濃縮到30mL并冷卻到室溫。將析 出的黃色沉淀過濾收集，并用二氯甲烷洗滌，最終得到3.6g(4'_甲基_2,2'_聯(lián)吡啶-4-基） 甲磺酸鈉（化合物6)</H MMR(D2〇,400M Hz，見圖3)δ8·81(1Η)，8·67(1Η)，8·44(1Η)，8.30 (1Η)，7·88(1Η)，7·76(1Η)，4·42(2Η)，2·73(3Η)。
[0124] 4.另一個(gè)一價(jià)陰離子配體(鹽形式）的合成：（4'_羥甲基_2,2'_聯(lián)吡啶-4-基）甲磺 酸鈉(化合物8)
[0125]
[0126] 將 3g(23 · 8mmol )Na2S03和 3 · 9g( 13 · 97mmol)化合物 7 混合于 35mL 水中，化合物7 是由 [2,2'_聯(lián)吡啶]_4,4'_二甲醇制備4,4'_二(溴甲基)-2,2'_聯(lián)吡啶的副產(chǎn)物。將混合物在氮 氣保護(hù)下回流5小時(shí)。將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并將溶解在含有10%甲醇的水溶液中。經(jīng)硅膠色 譜柱后，得到4.1g淡粉色產(chǎn)物。產(chǎn)率97%</Η NMR(D20,400M Ηζ)δ8·53(1Η)，8·48(1Η)，7·92 (1Η)，7·84(1Η)，7·49(1Η)，7·38(1Η)，4·69(2Η)，4·24(2Η)。
[0127] (對(duì)異丙基甲苯）（L'）RuC12的合成
[0128] 我們證明，選自表1中1^兒2兒3兒4兒5的任何一個(gè)配體1/能用作初始材料與二氯(對(duì) 異丙基甲苯)舒（II)二聚體，即[(p-cymeme)RuCl2]2,反應(yīng)生成一個(gè)中間體(對(duì)異丙基甲苯） (L，）RuC12〇
[0129] 5.(對(duì)異丙基甲苯）（2,2'_聯(lián)吡啶)RuC12(化合物9)的合成
[0130]
[0131] 將2.(^(3.27臟〇1)[(對(duì)異丙基甲苯)1?11(：12]2和1.038(6.59臟〇1)2,2'-聯(lián)吡啶溶解 于400mL甲醇中，將該溶液回流8小時(shí)。在反應(yīng)過程中，溶液的顏色從紅色變?yōu)辄S色。旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)最終反應(yīng)液后，所得固體經(jīng)硅膠色譜柱提純，甲醇/水洗脫劑洗脫得到1.64g黃色粉末(化 合物9)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ9·76(2Η)，8·40(2Η)，8·07(2Η)，7·75(2Η)，6·22(2Η)，6·09 (2Η)，2·74(1Η)，2·29(3Η)，1·05(6Η)。
[0132] 6.(對(duì)異丙基甲苯）（4,7-二苯基-1，10-菲咯啉)RuC12(化合物10)合成
[0133]
[0134] 將0 · 613g( 1 · Ommol)[(對(duì)異丙基甲苯)RuCl2]2和0 · 665g(2mmol )4，7 ' -二苯基-1， 1 〇-菲咯啉溶解于50mL乙醇中，在氬氣保護(hù)下將溶液回流4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇，黃色固體溶 于二氯甲烷后滴入無水乙醚中。過濾收集黃色沉淀，并真空干燥。得到1.21g產(chǎn)物（收率 95%)</H NMR(CD30D，400M Hz，見圖4)δ9.89((1, J = 5.5Hz，2H)，8.13((1, J = 2.5Hz，2H)，8·05 (d，J = 5.4Hz，2H)，7.73-7.57(m，10H)，6.29(d，J = 6.4Hz，2H)，6.06(d，J = 6.3Hz，2H)，2.74 (m，J = 13.6,6.8Hz，lH)，2.30(s，3H)，1.07(t，J = 10.6Hz，6H)。
[0135] 7.(對(duì)異丙基甲苯）（紅菲咯啉二磺酸鈉)RuC12(化合物11)合成
[0136]
[0137] 將浴fl50mL甲醇中的0.8068(1.316臟〇1)[(對(duì)弁內(nèi)基甲苯）此(：12」2和浴亍7511^水 中的1.412g(2.632mmol)紅菲咯啉二磺酸鈉混合并在氬氣保護(hù)下溶液回流4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 除去溶劑后得黃色固體2.2g，該化合物無需提純直接用于后面的反應(yīng)步驟。
[0138] (L，）（L，，）RuC12 的合成
[0139] 我們證明，選自表1中^2、1^、1>丄5的任何一個(gè)配體1；'能替換中間體(對(duì)異丙基甲 苯）（L'）RuCl沖的剩余對(duì)異丙基甲苯，從而形成〇/)〇；'）1^12。由于立體異構(gòu)體混合物分 離困難，這些二氯雜配二亞胺配合物未經(jīng)提純直接用于制備三雜配ECL標(biāo)記物。作為示例， 圖5給出化合物15在⑶30D中的 1H NMR譜圖。
[0140] 8.合成cis-(2,2'-聯(lián)吡啶）[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基）丁酸]RuC12配合物（化合物 12)〇
[0141]
[0142] 將0 · 44g( 1 · 8mmol )4-(2，2 ' -聯(lián)吡啶-4-基）丁酸和0 · 83g( 1 · 74mmo1 )(對(duì)異丙基甲 苯）（2,2'_聯(lián)吡啶)RuC12以及0.61g(14.39mmol)氯化鋰混合于15mL DMF中。混合物在氮?dú)?保護(hù)下回流3小時(shí)。反應(yīng)過程中，溶液顏色從黃色變?yōu)樯钭仙Ｔ诨旌衔锢鋮s至室溫后，在攪 拌下，將混合物倒入200mL乙醚中。過濾收集深紫色的沉淀，再以甲醇/水為淋洗劑，用硅膠 色譜柱除去少量帶有熒光的副產(chǎn)物。產(chǎn)出產(chǎn)品0.40g(收率40 % )。
[0143] 9.cis-(2,2'-聯(lián)吡啶）[4_ 甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_聯(lián)吡啶]Ru(II)C12(化合物 13)的合成。
[014
[0145] 化合物13的合成方法與化合物12相同。
[0146] l〇.cis-(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉）[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)丁酸鈉]Ru(II)C1 2 (化合物14)的合成
[0147]
[0148] 將1.568(4.02111111〇1)2,2'-聯(lián)吡啶-4,4'-二甲磺酸鈉和2.568(3.92111111〇1)(口-cymeme) (4,7_二苯基-1，10-菲略啉）RuCl2以及 1 · 35g(31.84mmol)氯化裡混合于50mL DMF 中。將該溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3小時(shí)。冷卻至室溫后，將深紫色混合物倒入400mL丙酮中。 收集深紫色固體。濾液中也發(fā)現(xiàn)含有一定量的產(chǎn)物，因此將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。合并后的紫色固 體以甲醇為淋洗劑，用硅膠色譜柱處理。最后將紫色的濃溶液滴入干燥的乙醚中，經(jīng)過濾和 干燥，得到深紫色固體3.4g(收率97 % )。
[0149] 11. (2，2'-聯(lián)吡啶）（紅菲咯啉二磺酸鈉)Ru(II)C12配合物(化合物15)的合成
[0150]
11 1S
[0151] 將0.355g(2.27mmol)2,2'-聯(lián)吡啶和1.785g(2.12mmol)(對(duì)異丙基甲苯)紅菲咯啉 二磺酸鈉)RuC1 2以及0.772g( 18.2mmol)氯化鋰混合于30mL DMF中。該溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回 流3.5小時(shí)。在冷卻至室溫后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)深紫色溶液，固體再溶于甲醇中。硅膠色譜柱純化產(chǎn) 出1.75g深紫色固體(異構(gòu)體混合物）。圖5是化合物15在CD 30D中的1H NMR圖譜。
[0152] (L，）（L"）（L" '）Ru標(biāo)記物的合成
[0153] 12.三雜配金屬配合物標(biāo)記物-Ru(2，2 ' -聯(lián)吡啶）（紅菲咯啉二磺酸鹽）[4_(2，2 ' -聯(lián)吡啶-4-基)丁酸](16)的合成
[0154]
[0155] 標(biāo)記物16經(jīng)兩種不同的方案進(jìn)行合成。在方案A中，一個(gè)二價(jià)陰離子配體，紅菲咯 啉磺酸鈉鹽(在本發(fā)明中定義為L(zhǎng)2)，替代(Oa^RuCls配合物12中的兩個(gè)配位氯原子，生 成目標(biāo)標(biāo)記物16。在方案B中，一個(gè)可生物偶聯(lián)的配體，即化合物3,4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基） 正丁酸(在本發(fā)明中，定義為L(zhǎng) 1)，替代(L2)(L3)RuC12配合物15中的兩個(gè)配位氯原子，生成同 樣的目標(biāo)標(biāo)記物16。兩種合成方案的細(xì)節(jié)如下所示。
[0156] 方案A:將200mg(0.35mol)的化合物12和191.811^(0.36臟〇1)紅菲咯啉磺酸鈉鹽溶 解于25mL甲醇/水(4:1)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將該溶液回流3.5小時(shí)。在反應(yīng)過程中，溶液 由暗紫色變?yōu)槊髁恋某壬⒎磻?yīng)液過濾，濾液濃縮至5mL，再用甲醇/水(2:1)溶液做淋洗 劑，經(jīng)過硅膠色譜柱提純。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并真空干燥后，得到目標(biāo)化合物。產(chǎn)量200mg。
[0157] 方案 B:將800mg(0.925mol)化合物 15 和 224mg(0.925mmol)4-(2,2'-聯(lián)吡啶-4-基） 正丁酸(化合物3)溶解于40mL甲醇/水(3:1)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將該溶液回流3小時(shí)。在 反應(yīng)過程中，顏色由暗紫色變?yōu)槊髁恋某壬?。將反?yīng)液過濾，濾液濃縮至10mL，再用甲醇/水 (2:1)溶液做淋洗劑，經(jīng)過硅膠色譜柱提純。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)