其類似物，前述識別性配對物的結(jié)合配對物，或 者能與被測物形成共價鍵的反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)，其類似物或結(jié)合配對物。上述物質(zhì)也可以與 一個或多個結(jié)合配對物和/或一個或多個反應(yīng)性組分形成的組合相連接。另外，上述物質(zhì)也 可連接與結(jié)合配對物、反應(yīng)性組分、或者一個或多個結(jié)合配對物和/或一個或多個反應(yīng)性組 分形成的組合相連接的被測物或其類似物。落入本發(fā)明范圍的還包括多個有待直接、或通 過如上述的其它分子連接到被測物或其類似物的上述物質(zhì)。
[0048]本專利涉及電中性的帶有金屬配合物發(fā)光體的ECL標(biāo)記物。本文中可能用到的短 語"中性"，"電中性"或者"電子中性"指的是金屬陽離子的正電荷被陰離子性的多原子取代 基團(tuán)所平衡或者中和的狀態(tài)，這些陰離子性的多原子取代基團(tuán)直接或者間接地鍵接于雙齒 (優(yōu)選二亞胺)配體上的一個或多個芳環(huán)上。這類配體包括2,2'_聯(lián)吡啶，1，10-菲咯啉及其 衍生物。
[0049] 由于在配位金屬配合物中的金屬離子的陽離子本性，現(xiàn)有技術(shù)中公開的標(biāo)記分子 的電中性是由反離子達(dá)成的。對于帶正電荷發(fā)光體的ECL標(biāo)記物（例如美國專利US 5221605,5238808,5310687,5714089,5731147,6140138,6316607)，反離子是氯離子、六氟 磷酸根離子等。而對于帶負(fù)電荷發(fā)光體的ECL標(biāo)記物(披露于美國專利US 6808939)，反離子 例如是鈉離子或質(zhì)子。因此，現(xiàn)有技術(shù)中公開的ECL發(fā)光體和ECL標(biāo)記物在化學(xué)上均為離子 型化合物，其在適宜的電解質(zhì)溶液中，比如磷酸鹽緩沖溶液中，離解為陽離子和陰離子。
[0050] 本發(fā)明所公開的帶有電中性發(fā)光體的ECL標(biāo)記物是電中性的兩性離子。在本發(fā)明 所公開的金屬配合物發(fā)光體結(jié)構(gòu)中，金屬陽離子的正電荷被一個或多個雙齒配體(優(yōu)選是 二亞胺）的芳環(huán)上的帶負(fù)電荷的取代基所中和。因此，本發(fā)明所公開的ECL發(fā)光體和ECL標(biāo)記 分子在溶解于電解質(zhì)溶液中時，不會離解為陽離子和陰離子。
[0051] 這類電中性的金屬配合物標(biāo)記物具有以下通式
[0052] Mn+[L，L，，L，，，]n-(I)
[0053] 其中，Μ選自過渡金屬，優(yōu)選是釕或者鋨;η是電荷數(shù)，等于或者大于2;L'、L"和L"' 獨立地選自含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自2，2聯(lián)吡啶、1，10-菲咯啉及其取代的同系物。至 少有一個配體具有至少一個可生物偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)，如羧基、N-琥珀酰亞胺基羧酸酯(NHS 酯）、N-羥基磺化琥珀酰亞胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亞磷酰胺、異硫氰基、甲?；被?、肼 基、羥基和馬來酰亞氨基等。
[0054]基于三個二亞胺配體是相同還是不同的，三-二亞胺金屬配合物可能是均配、二雜 配或三雜配的。對于正二價的金屬離子，如釕（II)，不可能形成電中性的均配型三-二亞胺 配合物。因此，本發(fā)明只涉及二雜配和三雜配金屬配合物，特別是具有以下結(jié)構(gòu)的三雜配金 屬配合物：
[0055] Μη+[?ΛΑ3]η-(II)和
[0056] Μη+[?ΛΛ/]η-(III)
[0057] 其中，Μ選自過渡金屬，優(yōu)選是釕或者鋨;η是電荷數(shù)，等于或者大于2。
[0058] L1是含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自取代的2，2 聯(lián)吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如 下所示：
[0059]
[0060] L1具有至少一個反應(yīng)基團(tuán)（X)，比如羧基、Ν-琥珀酰亞胺基羧酸酯(NHS酯）、Ν-羥基 磺化琥珀酰亞胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亞磷酰胺、異硫氰基、甲?；?、氨基、肼基、羥基和 馬來酰亞氨基，X直接(無需連接體Τ)或者間接(通過連接體Τ)與一個芳環(huán)連接。Τ是含碳或 者含雜原子的連接體，包括Ci-Cn)的亞烷基、CrCn)的亞烯基、Q-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Q- &0-、-顯(》-(：1-&()-、-(：1-(： 9-〇)順1?1-、取代或非取代的5-或者6-元芳環(huán)。1是氫或者任何不帶 電荷的取代基團(tuán)，優(yōu)選為Ci-Cio的烷基、Ci-Cio的烯基、Ci-Cio的烷氧基、 -CONH-Ci-Cio、-NHCO-Ci-Ciq、-Ci_C9 -C0NHR3、取代或非取代的5_或者6_兀芳環(huán)、羥基、氨基、腈、氰基或者鹵素。 [0061 ] L2是含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自取代的2，2 聯(lián)吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如
下所示-
[0062]
[0063] 1/具有帶電荷的取代基團(tuán)，它的總負(fù)電荷數(shù)與η相同（η大于或等于2,優(yōu)選為2)，其 中Ε是帶電荷基團(tuán)；Α是含碳或者含雜原子的連接體。優(yōu)選地，Ε是帶負(fù)電荷的基團(tuán)，比如_ S03-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等;A是含碳或者包含雜原子的連接體，包括CrCw的烷基、&-&〇 的烯基、&-CK)的烷氧基、-CONH-Ci-Cio-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-Cg-CONHRr、取代或非取代的 5-或者6-元芳環(huán)。
[0064] L3是電中性的含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自不帶電荷的2,2'_聯(lián)吡啶，1，10-菲咯 啉，或者其上至少帶有一個取代基團(tuán)W'。取代基團(tuán)W'優(yōu)選是氫或者不帶電荷并且在溫和水 溶液條件下不具有反應(yīng)性的取代基團(tuán)，例如Ci-Cnj的烷基Xi-Cio的烯基、&-&〇的烷氧基、_ CONH-CrCn)、-NH⑶-Ci-Cio、-CrCg-CONHRs、取代或非取代的5-或者6-元芳環(huán)、羥基、氨基、 腈、氰基或者鹵素。
[0065] L4和L5各自是帶有單價陰離子的含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自取代2,2'_聯(lián)吡啶和 1，10-菲咯啉，如下所示：
[0066
[0067] L4PL5各自具有帶負(fù)電荷的取代基，其中E是帶電荷基團(tuán)，A是含碳或者含雜原子的 連接體。優(yōu)選地，E是帶負(fù)電荷的基團(tuán)，比如-S0 3_、-0S03_、-Ρ03Η_、-0Ρ03Η，; A是含碳或者包 含雜原子的連接體，包括Ci-Cn)的烷基Xi-Cn)的烯基Xi-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Ci-Cn)-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-CVCONHRi-、取代或非取代的5-或者6-元芳環(huán)。
[0068] 以二氯(對異丙基甲苯)釕（II)二聚體，即[(對異丙基甲苯)RuC12]2,作為起始原 料，依次用兩個二亞胺配體逐步替代其中的兩個對異丙基甲苯分子，下面的通用合成方法 使得三個二亞胺配體(相同或者不同）與金屬離子逐步配位：
[0069] [(對異丙基甲苯)RuC12]2+L' - (對異丙基甲苯）（L'）RuC12
[0070] (對異丙基甲苯）（L'）RuC12+L"4(L"）（L'）RuC12
[0071] (L"）（ L，）RuC 12+L" ' -（ L，）（ L"）（ L"，）Ru
[0072] (這里，L'、L"和L" '是L\L2和L3,或者L\L4和L5)
[0073] 本發(fā)明提出了同樣的三雜配目標(biāo)配合物（L'）（L"）（L"'）Ru能夠從不同的起始原 料，通過不同的中間體合成出來。在釕（II)中心引入配體的具體順序并不重要。這種配體置 換循序上的適應(yīng)性有助于減少在制備供篩選的大量化合物時所需的合成步驟數(shù)目，因為不 同的目標(biāo)化合物可以共用某些通用中間體。
[0074] 例如，改變上述三個反應(yīng)的配體替換順序，我們可以有如下的另一個合成路徑：
[0075] [(對異丙基甲苯)RuC12]2，+L" ' -(對異丙基甲苯）（L" '）RuC12
[0076] (對異丙基甲苯）（L" '）RuC12+L' -（L'）（L" '）RuC12
[0077] (L，）（L，，，）RuCl2+L，，-（L，）（L，，）（L，，，）Ru
[0078] (這里，L '、L" 和L"，是L1，L2和L3，或者L1，L 4和L5)
[0079] 總之，合成順序包括以下步驟。首先，使[(對異丙基甲苯)RuC12]2和L'、L"或L"'反 應(yīng)形成第一中間體(對異丙基甲苯）（1/)此(：1 2、（對異丙基甲苯）（1；'）此(：12或(對異丙基甲 苯）（L" '）RuC12。第二步，通過使(對異丙基甲苯）（L'）RuC12與L"或L" '反應(yīng)，使(對異丙基甲 苯）（L"）RuC12與L'或L"'反應(yīng)，或使(對異丙基甲苯）〇；''）此(：1 2與1/或1；'反應(yīng)，將第一中間 體轉(zhuǎn)化為第二中間體(L'）（L"）RuC12，（L'）（L" '）RuC12或者(L"）（L" '）RuC12。第三步，使(L'） 〇；'）此(：12與1；''反應(yīng)，或使〇/)〇；''）1^1 2與1；'反應(yīng)，或者使〇；'）〇；''）1^12與1/反應(yīng)，將 第二中間體轉(zhuǎn)化為〇/)〇；'）〇；''）此。在以上的合成步驟中，1/、1；'和1；''可以替換為1^兒 2和 L3，或者替換為L1，L4和L5，以保持在釕核的周圍布置有三個配體。
[0080] -系列的合成實施例證明了任何配體都可以在上述的通用合成路徑中的任何一 個步驟中與釕（II)配位。表1列出了以上和以下定義的1^丄 2丄3丄4和1^配體，它們將被用于 本發(fā)明的實施例中。
[0081 ]表1本發(fā)明實施例中所用到的雙齒二亞胺配體示例
[0082]
[0083]如上所述，L1是生物偶聯(lián)功能化的含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自2,2'_聯(lián)吡啶、1， 10-菲咯啉以及它們的取代的同系物。L1無論是游離態(tài)或者與金屬離子配位后，都能夠與生 物物質(zhì)在溫和的條件下發(fā)生反應(yīng)或者偶聯(lián)。所述功能基團(tuán)或者生物偶聯(lián)基團(tuán)選自羧基、N-琥珀酰亞胺基羧酸酯(NHS酯）、N-羥基磺化琥珀酰亞胺基羧酸酯(磺化-NHS酯），亞磷酰胺、 異硫氰基、甲酰基、氨基、肼基、羥基和馬來酰亞氨基等。除了表1中所列舉的本發(fā)明中用作 ECL標(biāo)記物合成實施例的配體外，L1還可以選自以下，但不局限于以下，可生物偶聯(lián)的二亞 胺配體：
[0084]
[0085]
[0086] L1尤選是具有肉個貨電何的ΙΓΜΙ澩樸雙齒配懷，1尤選選目m天μκ哫和1，1U-菲 咯啉的衍生物。表1中所示的配體L 2為磺酸化的2,2'_聯(lián)吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。示例 的配體的荷負(fù)電基團(tuán)是-S03-。不過，該負(fù)電基團(tuán)也可以選自-0S0 3-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等。合成 過程中使用的原料或中間體可以鹽形式存在，比如鈉鹽。除了表1中所列舉的本發(fā)明中用作 ECL標(biāo)記物合成實施例的配體外，L2還可以選自以下，但不局限于以下的二價陰離子二亞胺 配體：
[00871 一·ι.η η -
[0088] L3是不帶任何電荷基團(tuán)的含氮雙齒配體，優(yōu)選選自2,2'-聯(lián)吡啶、1，10-菲咯啉以 及它們的取代的同系物。除了表1中所列舉的本發(fā)明中用作ECL標(biāo)記物合成實施例的配體 外，L 3還可以選自以下配體，但不局限于以下配體：
[008?
一IN IN- 一IN M- 一IN IN -
[0090] L4和L5優(yōu)選為一價陰離子型含氮雜環(huán)雙齒配體，優(yōu)選選自2，2 聯(lián)吡啶和1，10-菲 咯啉的衍生物。表1所例示的L4和L5配體為磺酸化的2,2'_聯(lián)吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。 所示配體中的的負(fù)電荷基團(tuán)是-S03_。但負(fù)電荷基團(tuán)也可選自-0S03_、-Ρ03Η_、-0P0 3Hg。合成 過程中的起始原料或中間體可以鹽形式存在，比如鈉鹽。除了表1中所列舉的本發(fā)明中用作 ECL標(biāo)記物合成實施例的配體外，L4和L5還可選自，但不局限于，以下描述的一價陰離子二亞 胺配體：
[0091]
[0092] 表1中所例不的配體Li谷目具有羧酸基團(tuán)作為生物偶聯(lián)基團(tuán)。在形成多二業(yè)肢金 屬配合物以后，該羧酸基團(tuán)可以容易地轉(zhuǎn)化為N-琥珀酰亞胺酯(NHS酯）和N-羥基磺化琥珀 酰亞胺酯（磺化-NHS酯）。具體將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為NHS酯的方法詳見文獻(xiàn)(M.Zhou et al， Anal. Chem. 2003，75，6708-6717)和專利（如US6808939 B2)。在轉(zhuǎn)化過程中，通常使用N，N-二環(huán)己基碳酰二亞胺(DCC，溶于二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，乙腈，四氫呋喃 等有機(jī)溶劑)或者1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，用于水溶液）。
[0093] 由于有大量可供選擇的配體作為釕（II)的潛在配位伙伴，以及以上描述的合成方 案的靈活性，多種可能的配體組合方案可以導(dǎo)致電中性的釕配合物，即Μ η+α?3]η?ΡΜη+ α?5]η'這些釕配合物的例子如下所示。這些釕標(biāo)記物的合成在實施例中舉例描述。
[0094]
[OUVDJ
[C

[0098]
[0099」
[ο




[0104] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了標(biāo)記的生物分子，它由電中性的金屬配合物與生物分子反應(yīng) 形成，它們具有如下結(jié)構(gòu)：
[0105] {Mn+[L，L，，L，，，]n-}m_B(V)，
[0106] {Μη+[?ΛΑ3]η-} m_B(VI),
[0107] {Mn+ [ LH5 ]n-} m_B (V11)，or
[0108] {Μη+[?ΛΛ]η-}m-B(VIII)
[0109] B是具有化學(xué)、生物化學(xué)或者生物活性的物質(zhì)，優(yōu)選選自半抗原、氨基酸、核酸、核 苷、核苷酸、蛋白質(zhì)、適配子、抗體和抗原等;m是大于或者等于1的整數(shù)。
[0110]經(jīng)過標(biāo)記的生物分子被用作生物分析，所述生物分析涉及對金屬配合物在光子激 發(fā)或電化學(xué)激發(fā)下產(chǎn)生的發(fā)光的測量。進(jìn)一步的步驟