一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法及其在降解氯代酚中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物與環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法及其在降解氯代酚中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氯代酚類化合物是合成有毒有機(jī)物中的一大類，對許多微生物具有抑制毒害作用，在環(huán)境中難以被微生物分解，屬于難降解有機(jī)物。此類化合物是美國環(huán)保局(EPA)重點控制的129種優(yōu)先污染物(pr1rity pollut1ns)之一，我國也將其列在重點污染物的黑名單之中。氯代酚類化合物在化工、農(nóng)藥、醫(yī)藥、造紙、防腐劑等工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時也導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境問題。其中2-氯代酚、4-氯代酚和2，3_ 二氯代酚是較為常見的污染物。它們常作為木材的防腐劑、除草劑、殺菌劑、溶劑以及熱交換過程中的工業(yè)生產(chǎn)廢棄物而釋放到環(huán)境中，對水體和土壤造成了很大的危害。對于有毒有機(jī)物的污染控制，生物處理技術(shù)由于成本較低，降解徹底等特點而受到人們的青睞。由于氯代酚類化合物具有殺菌作用，它們更難于被生物降解，因此氯代酚的微生物降解收到重視。
[0003]國內(nèi)外已有許多氯代酚類化合物微生物降解的研究報道。但是由于氯代酚對微生物的毒性，使用游離的微生物細(xì)胞降解氯代酚存在降解效率不高，生物催化劑失活的缺陷。
[0004]相比較游離細(xì)胞，使用固定化的細(xì)胞降解氯代酚可以提高生物催化劑的耐受性，并且固定化細(xì)胞可以重復(fù)利用，可以提高生物處理的經(jīng)濟(jì)性。進(jìn)而，納米磁性顆?？梢栽黾庸潭ɑw粒的比表面積，更有利于生物催化劑接觸底物，因此采用納米磁性顆粒固定化細(xì)胞，可以解決常規(guī)固定化細(xì)胞存在的物質(zhì)傳輸障礙的問題，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中采用游離的微生物細(xì)胞降解氯代酚存在降解效率不高、生物催化劑失活等問題，本發(fā)明研究了一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法。
[0006]本發(fā)明還提供了所述得到的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
I)制備苯胺降解菌細(xì)胞懸液:將苯胺降解菌接種于M65培養(yǎng)基中，28°(:恒溫培養(yǎng)24h，然后4000 r/min離心1min，收集菌絲細(xì)胞，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，分散于水中，制得苯胺降解菌細(xì)胞懸液，備用；
2 )納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:從下述a )和b )中任選一種方法:a)將瓊脂糖或卡拉膠加熱至完全溶化，50°C保溫加入步驟I)的苯胺降解菌細(xì)胞懸液和Fe3(k納米磁性顆粒，混合均勾，降溫至4°C，得固體混合物，將該混合物切割為3mmX 3mm的均勻顆粒，然后將顆粒置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%氯化鉀水溶液中固定2h，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
步驟a)中，所述瓊脂糖或卡拉膠與苯胺降解菌細(xì)胞懸液質(zhì)量比為3:1。
[0008]b)將質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)冷膠水溶液或質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉水溶液與步驟I)的苯胺降解菌細(xì)胞懸液按體積比1:1混合，并加入Fe3O4納米磁性顆粒，混合均勻，然后均勻滴加至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣水溶液中，固定2h，生成球狀顆粒，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
步驟I)中，所述苯胺降解菌細(xì)胞懸液OD 600=300。
[0009]步驟I)中，所述培養(yǎng)基為M65培養(yǎng)基，其成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和10 g/L的麥芽提取物，培養(yǎng)基pH 7.2。
[00?0] 步驟2)中，所述Fe304納米磁性顆粒加入濃度為3?12 g/L，優(yōu)選9g/L。
[0011 ] 所述的苯胺降解菌為玫瑰色紅球菌DSM 6263(Rhodococcus rhodochrousDSM6263)購自德國菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)
本發(fā)明方法制備得到的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應(yīng)用，所述氯代酚為2-氯代酚、4-氯代酚或2，3-二氯代酚。
[0012]所述納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應(yīng)用，方法為:
I)制備納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
2)向氯代酸樣品中加入步驟I)制備的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌，于180 rpm、28°C搖床中，反應(yīng)21?24h，至氯代酚充分降解。
[0013]上述應(yīng)用，步驟2)中，所述氯代酚樣品為0.25mM的氯代酚一磷酸緩沖液；
上述應(yīng)用，步驟2)中，所述納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌加入量為濕重14g/L;
上述應(yīng)用中，納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后可回收，回收處理方式為:通過磁鐵吸附回收納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌，將其放置于M65培養(yǎng)基中活化30min，取出后再用去尚子水洗滌2遍。
[0014]上述應(yīng)用中，納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌可至少回收重復(fù)使用7批次。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:
采用納米磁性顆粒固定化高效苯胺降解菌，固定化的細(xì)胞可以高效的降解2-氯代酚，4-氯代酚和2，3_ 二氯代酚。降解濃度高，速度快。同時由于固定化材質(zhì)中含有磁性顆粒，可以方便的用外部磁場從水體中回收固定化細(xì)胞，極大的方便的生物催化劑的回收和再利用，有利于降低生物處理成本，在氯代酚廢水處理過程中具有巨大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0016]圖1為不同材質(zhì)固定化的細(xì)胞對2-氯代酚的降解情況；
圖2為不同材質(zhì)固定化的細(xì)胞對4-氯代酚的降解情況；
圖3為不同材質(zhì)固定化的細(xì)胞對2，3_ 二氯代酚的降解情況；
圖4為添加不同濃度Fe3O4磁性顆粒的固定化細(xì)胞對2-氯代酚的降解情況；
圖5為重復(fù)利用磁性固定化的細(xì)胞對2-氯代酚的降解情況。
【具體實施方式】
[0017]下面將通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本
【發(fā)明內(nèi)容】
所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018]實施例1
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
1)制備苯胺降解菌細(xì)胞懸液:將苯胺降解菌接種于成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和1g/!的麥芽提取物、PH 7.2的1165培養(yǎng)基中，28°(:恒溫培養(yǎng)2411，然后4000 r/min離心1min，收集菌絲細(xì)胞，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，分散于水中，制得苯胺降解困細(xì)胞懸液，OD 600=300，備用；
2)納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:將卡拉膠加熱至完全溶化，50°C保溫并按質(zhì)量比為3:1加入步驟I)的苯胺降解菌細(xì)胞懸液和濃度為9g/L的Fe3O4納米磁性顆粒，混合均勻，降溫至4°C，得固體混合物，將該混合物切割為尺寸3_X3mm的均勻的顆粒，然后將顆粒置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%氯化鉀水溶液中固定2h，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌。
[0019]實施例1苯胺降解菌為玫瑰色紅球菌DSM 6263(Rhodococcus rhodochrousDSM6263)購自德國菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，下同。
[0020]實施例2
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
1)制備苯胺降解菌細(xì)胞懸液:同實施例1;
2)納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:將瓊脂糖加熱至完全溶化，50°C保溫并按質(zhì)量比為3:1加入步驟I)的苯胺降解菌細(xì)胞懸液和濃度為6g/L的Fe3O4