一種在聚集態(tài)下具有活體細胞顯影功能的強雙光子吸收三苯胺衍生物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種在聚集狀態(tài)下具有強雙光子吸收性能的有機材料及其制備方法， 具體地說是一種在聚集狀態(tài)下具有低毒性、活體細胞顯影功能的三苯胺基強雙光子吸收材 料及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著雙光子吸收材料的迅速發(fā)展和熒光共聚焦顯微鏡的商品化應用，雙 光子熒光成像技術在應用方面有了重大突破。由于雙光子躍迀具有很高的空間分辨率和選 擇激發(fā)性，所以在生物成像中具有顯著的優(yōu)點：雙光子吸收采用紅外或近紅外波段的激光 作為激發(fā)光源，能大大降低生物組織對激發(fā)光的吸收，避免組織自發(fā)熒光的干擾，獲得較強 的樣品熒光；同時，由于雙光子技術使用的是長波激發(fā)，具有激發(fā)能量低、波長長、穿透性 強、光損傷小等特點，因此雙光子技術在生物分子探測、醫(yī)療診斷和熒光顯微成像技術等領 域中有巨大應用潛力和廣闊應用前景。
[0003] 聚集誘導發(fā)光(AIE)是克服熒光分子在高濃度下應用瓶頸的重要手段，特別是對 雙光子吸收分子，具有AIE效應的雙光子分子能有效避免高濃度誘導的熒光淬滅，使之更適 合于生物體內(nèi)的顯微成像，因此，開發(fā)具有AIE效應的有機雙光子吸收材料成為一個新的研 究熱點（D.Ding，K.Li，B.Liu，B.Z.Tang.Accounts of chemical research,2013,46( 11): 2441-2453.)
[0004] 三苯胺衍生物具有可變的漿型結構、較強的給電子能力以及易于結構修飾等優(yōu) 點，一直是光功能材料的重要構筑基元。（G.Keke，Z.Jian，C.Jiule，D.Ming.Optical review，2013，20(5): 385-389.)。同時三苯胺衍生物易于構建成枝狀分子，而枝狀分子在聚 集誘導發(fā)光和雙光子吸收材料中具有廣泛的應用前景。因此，近年來，人們對于具有雙光子 活性的三苯胺衍生物在聚集態(tài)下作為雙光子敏化材料表現(xiàn)出了極大的興趣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種在聚集態(tài)下具有活體細胞顯影功能的枝狀三苯胺衍生物雙 光子吸收材料及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明通過篩選合適的具有雙光子吸收性質(zhì)的有機材料構筑基元，與三苯胺縮合 成具有不同枝數(shù)的有機小分子，通過枝數(shù)的調(diào)整來優(yōu)化材料的聚集誘導發(fā)光性能和雙光子 吸收性能，并使其具備低毒性和在聚集態(tài)下具有強雙光子顯影功能，從而適于活體細胞生 物顯影。
[0007] 本發(fā)明三苯胺衍生物的通式如（I)所示：
[0008
[0009] 通式（I)中，經(jīng)R4、R5、R6組合形式如下產(chǎn)物：
[0010] T1)R4 = H，R5 = H，R6=X;或
[0011] T2)R4 = H，R5=X，R6=X;或
[0012] T3)R4=X，R5=X，R6=X;
[0013] 所述 T1)、T2)、T3)中
[0014] 一種在聚集態(tài)下具有活體細胞顯影功能的強雙光子吸收三苯胺衍生物的制備方 法，其特點在于，按以下步驟進行：
[0015] a、將DMF、三氯氧磷和三苯胺混合，升溫至40-60°C反應lh，得到中間體I;
[0016] b、將DMF、三氯氧磷和三苯胺混合，升溫至90-110°C反應10-24h，得到中間體Π 和 中間體m;
[0017] c、將中間體I、對硝基苯乙腈和無水乙醇混合，加熱溶解，再加入催化劑哌啶，升溫 至60-80°C反應2h，冷卻，抽濾，醇洗后干燥得到目標產(chǎn)物T1;
[0018] d、將中間體Π 、對硝基苯乙腈和無水乙醇混合，加熱溶解，再加入催化劑哌啶，升 溫至60-80°C反應2h，冷卻，抽濾，醇洗后干燥得到目標產(chǎn)物T2;
[0019] e、將中間體m、對硝基苯乙腈和無水乙醇混合，加熱溶解，再加入催化劑哌啶，升 溫至60-80°C反應24h，冷卻，抽濾，醇洗后干燥得到目標產(chǎn)物T3。
[0020] 作為優(yōu)選，所述步驟a的具體步驟為：
[0021 ]冰浴條件下，向反應容器中加入DMF，磁力攪拌下緩慢滴加三氯氧磷，繼續(xù)攪拌至 形成白色漿狀物后升溫至50-60°C，加入三苯胺，反應lh后溶液變成深紅色，然后將反應液 倒入大量冰水中，并用飽和Na 2C03水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，得到大量黃色沉淀，抽濾得淡黃色 粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析得中間體I。
[0022]進一步，所述步驟a中DMF、三氯氧磷和三苯胺的摩爾用量為8:10:1。
[0023]作為優(yōu)選，所述步驟b的具體步驟為：
[0024]冰浴條件下，向反應容器中加入三苯胺、N，N_二甲基甲酰胺，磁力攪拌下緩慢滴加 三氯氧磷，直至容器底部形成淡黃色固體，90-1HTC下回流12h;反應結束后將黑色油狀液 體倒入冰水中，不斷攪拌下飽和Na 2C03水溶液調(diào)至pH=8.0，有黑色沉淀出現(xiàn)，將沉淀減壓抽 濾，濾液用90mL CH2C12分三次萃取，將沉淀用上述CH2C12萃取液溶解，加入200-300目硅膠， 濃縮至干，經(jīng)柱層析分別得中間體Π 和中間體m。
[0025] 進一步，所述步驟b中三苯胺、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩爾用量為1:10 : 10。
[0026] 作為優(yōu)選，所述步驟c的具體步驟為：
[0027]將中間體I，對硝基苯乙腈溶于無水乙醇，加熱使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流2h，停止反應，冷卻至室溫，有大量紅色沉淀析出，抽濾、濾出物用乙醇洗滌數(shù)次， 真空干燥得紅色產(chǎn)物T1。
[0028]進一步，所述步驟c的中間體I和對硝基苯乙腈的摩爾用量為1:1.2。
[0029] 作為優(yōu)選，所述步驟d的具體步驟為：
[0030] 將中間體Π ，對硝基苯乙腈溶于無水乙醇，加熱使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流12h，停止反應，冷卻至室溫，有大量紅色沉淀析出，抽濾、濾出物用乙醇洗滌數(shù)次， 真空干燥得紅色產(chǎn)物T2。
[0031] 進一步，所述步驟d的中間體Π 和對硝基苯乙腈的摩爾用量為1:2.4。
[0032] 作為優(yōu)選，所述步驟e的具體步驟為：
[0033] 將中間體m，對硝基苯乙腈溶于無水乙醇，加熱使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流24h，停止反應，冷卻至室溫，有大量紅色沉淀析出，抽濾、濾出物用乙醇洗滌數(shù)次， 真空干燥得紅色產(chǎn)物T3。
[0034]進一步，所述步驟e的中間體ΙΠ 和對硝基苯乙腈的摩爾用量為1:3.6。
[0035]本發(fā)明以具有強供電子能力的三苯胺和強吸電子能力的對硝基苯乙腈為構筑基 元，利用Vilsmeier反應合成具有不同枝數(shù)的三苯胺衍生物作為聚集態(tài)下的雙光子顯影材 料，簡潔高效地制備了具有較高熒光量子產(chǎn)率的有機小分子雙光子顯影材料，并測得其具 有較低的生物毒性和活體組織細胞雙光子熒光顯影的特性。
[0036]經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的三苯胺衍生物T1-T3在聚集態(tài)下分別在780nm、800nm和 800nm處雙光子吸收截面(σ)最大，雙光子吸收能力最強。HepG2細胞被目標產(chǎn)物染色后，可 清晰地觀察到該系列有機分子對ifepG2細胞細胞質(zhì)具有高的識別能力。
[0037]與已有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0038] 1、本發(fā)明合成的有機小分子雙光子吸收材料T1-T3是一類在聚集態(tài)下具有細胞顯 影功能的雙光子吸收材料。與其它材料相比在高濃度條件下或水溶性環(huán)境中出現(xiàn)聚集后具 有較大的雙光子吸收截面，激發(fā)能量低、波長長、穿透性強、光損傷小、低毒等特點，因此，對 細胞無損傷，可用于活體細胞檢測，具有明顯的應用價值；
[0039] 2、HepG2細胞被目標產(chǎn)物染色后，可清晰地觀察到該系列雙光子材料對細胞質(zhì)具 有尚的識別能力；
[0040] 3、本發(fā)明原料易得，成本低，合成步驟簡單，產(chǎn)率高，易于操作。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明的制備路線圖。
[0042]圖2(a)是本發(fā)明有機雙光子吸收材料T1的掃描電鏡(SEM)和動態(tài)光散射(DLS)。 [0043]圖2(b)是本發(fā)明有機雙光子吸收材料T2的掃描電鏡(SEM)和動態(tài)光散射(DLS)。
[0044] 圖2 (c)是本發(fā)明有機雙光子吸收材料T3的掃描電鏡(SEM)和動態(tài)光散射(DLS)。
[0045] 圖3(a)為本發(fā)明有機雙光子吸收材料T1的雙光子吸收圖（激發(fā)能量為36mW)。
[0046] 圖3(b)為本發(fā)明有機雙光子吸收材料T2的雙光子吸收圖（激發(fā)能量為36mW)。
[0047] 圖3(c)為本發(fā)明有機雙光子吸收材料T3的雙光子吸收圖（激發(fā)能量為36mW)。
[0048] 圖4是有機雙光子吸收材料T1-T3對HepG2細胞熒光共聚焦顯微成像:al_a3為目標 產(chǎn)物著色的HepG2細胞的單光子熒光共聚焦顯微照片;bl-b3為明場作用圖；cl-c3為目標產(chǎn) 物著色的IfepG2細胞的雙光子熒光共聚焦顯微照片;dl-d3為疊合的照片。
[0049] 以下結合附圖通過【具體實施方式】對本發(fā)明技術方案做進一步解釋說明。本部分對 本發(fā)明實驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性的描述。本領域技術人員清楚，在 下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料、設備和操作方法是本領域公知的。
【具體實施方式】
[0050] 本發(fā)明以二苯胺為起始原料，先制備中間體I N，N_二苯基_4_甲酰基苯胺，中 間體Π --N，N-二(4-甲?；交?苯胺和中間體ΙΠ --N，N-二(4-甲酰基苯基)-4-甲?；?苯胺，再由中間體I，Π 和m分別與對硝基苯乙腈合成目標化合物T1 一一(Z)-3-(4-二苯氨 基)苯基_2_(4_硝基)苯基丙稀臆，T2 4，4' -雙(2_ (4_硝基)苯基丙稀臆)_3_叉-二苯胺 和T3-一4,4'，4"_三(2-(4-硝基)苯基丙烯腈)-3-叉-三苯胺。具步驟如下：
[0051 ] 1、中間體I的制備：
[0052] 冰浴條件下，在100m