°C，攪拌反應(yīng)24h后，再向其中加入 Phe-NCA(252. lmg，1. 32mmol)以及DMF(6mL)，繼續(xù)在35°C下，攪拌反應(yīng)24h。在無水乙醚中 沉降得到PEG-PBLG-PPhe三嵌段聚合物。
[0036] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將PEG-PBLG-PPhe (0· 2g，0. 182mmol的芐基官能團(tuán)）在40°C下溶 解于干燥的DMF(4mL)中，向其中加入蒸餾過的乙二胺（0. 656g，10. 92mmol)，攪拌反應(yīng)36h 后，向體系中滴加10%的乙酸溶液（12mL)，用0. 01M的HC1水溶液透析3次，蒸餾水透析3 次，冷凍干燥得到PEG-pGlu (EDA)-PPhe聚合物鹽酸鹽。
[0037] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將 PEG-pGlu (EDA) -PPhe (0· 08g，0· 00727mmol)溶于干燥的 DMF(4mL)中，再向其中依次加入硫辛酸（21.42mg，0. 104mmol)，DCC(22.25mg，0. 108mmol)， NHS (11. 96mg，0· 104mmol)，TEA (14. 22mg，0· 141mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng) 2d 后，抽濾除去 D⑶，最后用無水乙醚沉降兩次得到PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe聚合物。真空干燥48小時(shí)，產(chǎn) 率71 %。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為PEG-pGlu (EDA-LA) 1Q-PPhe，其中硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈 段單元聚合度為10。
[0038] 實(shí)施例二，合成聚合物 PEG-pGlu (EDA-LA) 5-PPhe2。(DP = 5, PEG :Mn = 5kDa)
[0039] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將CH30-PEG-NH2(0. 4g，0. 08mmo)溶于干燥DMF(4mL)中，向其中 加入BLG-NCA(126. 2mg，0. 48mmol)，將體系升溫至35°C，攪拌反應(yīng)24h后，再向其中加入 Phe-NCA(336. 2mg，1. 76mmol)以及DMF(8 mL)，繼續(xù)在35°C下，攪拌反應(yīng)24h。在無水乙醚 中沉降得到PEG-PBLG-PPhe三嵌段聚合物。
[0040] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將PEG-PBLG-PPhe (0. 3g，0. 1945mmol的芐基官能團(tuán)）在40°C下溶 解于干燥的DMF(6mL)中，向其中加入蒸餾過的乙二胺（0. 58g，9. 726mmol)，攪拌反應(yīng)36h 后，向體系中滴加10 %的乙酸溶液（7. 2mL)，用0. 01M的HC1水溶液透析3次，蒸餾水透析 3次，冷凍干燥得到PEG-pGlu (EDA)-PPhe聚合物鹽酸鹽。
[0041] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將 PEG-pGlu (EDA)-PPhe (0· 14g，0. 09369mmol)溶于干燥的 DMF(4mL)中，再向其中依次加入硫辛酸（25. lmg，0. 1218mmol)，DCC(26. lmg，0. 1265mmol)， NHS (14. Omg，0. 1218mmol)，TEA (30. 3mg，0. 3092mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng) 2d 后，抽濾除去 D⑶，最后用無水乙醚沉降兩次得到PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe聚合物。真空干燥48小時(shí)，產(chǎn) 率65%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為PEG-pGlu(EDA-LA)5-PPhe，其中硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈 段單元聚合度為5。
[0042] 實(shí)施例三，PEG-pGlu (EDA-LA) 1Q-PPhe2。(DP = 10, PEG :Mn = 5kDa)納米膠束制備
[0043] 聚合物PEG-pGlu (EDA-LA) 1(]-PPhe納米膠束通過透析方法制備。具體過程是：將 2mg聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)1Q-PPhe溶在lmL二甲亞砜中，在25°C攪拌條件下，向其中滴 加5mL去離子水。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO : 3500)，用去離子水透析24h。納米膠束130. 2納米，粒徑分布為0. 188。
[0044] 實(shí)施例四，PEG-pGlu (EDA-LA)5-PPhe2。(DP = 5, PEG :Mn = 5kDa)納米膠束制備
[0045] 聚合物PEG-pGlu (EDA-LA) 5-PPhe2。納米膠束通過透析方法制備。具體過程是：將 2mg聚合物PEG-P (BLG-LA) 5-PPhe2。溶在lmL二甲亞砜中，在25°C攪拌條件下，向其中滴加 5mL去離子水。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（SPECTRA/P0R，MWC0: 3500)，用去離子水透析24h。納米膠束尺寸為145. 1納米，粒徑分布為0. 198。
[0046] 按照實(shí)施例三和例四制備不同單元的殼層鏈段聚合物，并測(cè)試所得兩親三嵌段聚 合物形成的納米膠束的尺寸和分布，結(jié)果如表1所示：
[0047] 表1不同單元的殼層鏈段的兩親三嵌段聚合物納米膠束
[0048]
[0049] 實(shí)施例五，PEG-P (BLG-LA) 1Q-PPhe2。(DP = 10, PEG :Mn = 5kDa)納米膠束殼交聯(lián)
[0050] 為了得到殼交聯(lián)的聚合物納米膠束，將實(shí)施例三中形成的聚合物納米膠束（0. 45 毫克/毫升）溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,并通氮?dú)?0分鐘，加入lmg/mLl，4-二硫代-D，L-蘇丁 醇（DTT) 25. 3 μ L，將混合液在室溫氬氣保護(hù)條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。得到的殼交聯(lián)納米 膠束用去離子水透析，除去沒反應(yīng)的DTT。殼交聯(lián)納米膠束尺寸為113. 0納米，粒徑分布為 0.219,對(duì)高度稀釋（模擬靜脈注射），生理鹽度（150mM)有顯著的穩(wěn)定性。
[0051] 實(shí)施例六，PEG-P (BLG-LA) 5-PPhe2。(DP = 5, PEG :Mn = 5kDa)納米膠束制備
[0052] 為了得到殼交聯(lián)的聚合物納米膠束，將實(shí)施例四中形成的聚合物納米膠束（0. 50 毫克/毫升）溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,并通氮?dú)?0分鐘，加入lmg/mLl，4-二硫代-D，L-蘇糖 醇（DTT) 12. 6 μ L，將混合液在室溫氬氣保護(hù)條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。得到的殼交聯(lián)納米 膠束用去離子水透析，除去沒反應(yīng)的DTT。殼交聯(lián)納米膠束尺寸為124. 0納米，粒徑分布為 0.239,對(duì)高度稀釋（模擬靜脈注射），生理鹽度（150mM)有顯著的穩(wěn)定性。
[0053] 按照實(shí)施例五和例六制備不同單元的殼層鏈段聚合物的殼交聯(lián)納米膠束，并測(cè)試 形成的殼交聯(lián)納米膠束的尺寸和分布，結(jié)果如表2所示：
[0054] 表2不同單元的殼層鏈段兩親三嵌段聚合物的殼交聯(lián)納米膠束
[0055]
[0056] 實(shí)施例七：過量DTT使殼交聯(lián)的聚合物納米膠束解交聯(lián) PEG-P (BLG-LA) 10-PPhe20 (DP = 10, PEG ：Mn = 5kDa)
[0057] 氬氣保護(hù)下，將稱好的DTT加到2. 0ml交聯(lián)了的Dex-LA聚合物納米膠束（0. 001 毫克/毫升）的玻璃樣品池中，使最終DTT的濃度分別是0,10mM。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種兩親三嵌段聚合物，其特征在于：所述兩親三嵌段聚合物的鏈段由一種親水性 聚合物和兩種疏水性聚合物組成，中間鏈段的側(cè)鏈為硫辛?；?。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親三嵌段聚合物，其特征在于：所述親水性聚合物選自聚 乙二醇；所述親水聚合物的分子量為1000~lOOOODa。所述中間疏水性聚合物選自：聚谷 氨酸芐酯、聚天冬氨酸芐酯、聚N-芐氧羰基賴氨酸中的一種；所述中間疏水性聚合物的分 子量為500~5000Da。所述末端疏水性聚合物選自：聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚異亮氨酸中 的一種；所述術(shù)端疏水性聚合物的分子量為2000~lOOOODa。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親三嵌段聚合物，其特征在于：所述兩親三嵌段聚合物中 間鏈段被硫辛酸修飾，其中硫辛酰基的取代度（每個(gè)中間鏈段聚合物單元中硫辛酸的個(gè) 數(shù)）為20~100%。4. 一種交聯(lián)納米膠束，其特征在于：所述交聯(lián)納米膠束由權(quán)利要求1、2或3所述的兩 親三嵌段聚合物構(gòu)成，所述交聯(lián)納米膠束的外冠親水層由親水性聚合物構(gòu)成，中間殼由硫 辛酸修飾的疏水性聚合物構(gòu)成，內(nèi)核疏水層由疏水性聚合物構(gòu)成。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的交聯(lián)納米膠束，其特征在于：所述交聯(lián)納米膠束的粒徑為 30~200納米，粒徑分布PDI為0. 05~0. 35。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的交聯(lián)納米膠束，其特征在于：制備上述交聯(lián)納米膠束的方法 包括以下步驟： (1) 將權(quán)利要求1、2或3所述的兩親三嵌段聚合物通過自組裝形成納米膠束，所述納米 膠束的親水外冠由親水性聚合物構(gòu)成，中間殼層由側(cè)鏈為硫辛?；氖杷跃酆衔飿?gòu)成， 內(nèi)核疏水層由疏水性聚合物構(gòu)成； (2) 將步驟（1)中納米膠束的中間殼層交聯(lián)，通過對(duì)硫辛酰基的五元環(huán)交聯(lián)來穩(wěn)定納 米膠束結(jié)構(gòu)，得到殼交聯(lián)納米膠束。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的殼交聯(lián)納米膠束，其特征在于：步驟（2)中所述的交聯(lián)方法 為： 利用巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，通過1，4-二硫代-D，L-蘇糖醇對(duì)步驟（1)所得納米膠束 中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；其中，1，4_二硫代-D，L-蘇糖醇（DTT)的用量相對(duì) 于取代的硫辛酸的摩爾數(shù)的5~20%。8. 權(quán)利要求4、5、6、和7所述的殼交聯(lián)納米膠束作為藥物載體的應(yīng)用。9. 應(yīng)用權(quán)利要求4、5、6、或7所述的殼交聯(lián)納米膠束作為為藥物載體的方法，其特征在 于：包括以下步驟： (1) 藥物先溶在有機(jī)溶液中，再與權(quán)利要求所述兩親三嵌段聚合物的有機(jī)溶液共同攪 拌，然后再滴加二次水，將得到的溶液攪拌后透析，得到包裹藥物的納米膠束； (2) 對(duì)形成的納米膠束加入5~20mol %相對(duì)于雙硫鍵的1，4-二硫代-D，L-蘇糖醇進(jìn) 行交聯(lián)得到包裹藥物的殼交聯(lián)納米膠束； (3) 步驟（2)中包裹藥物的殼交聯(lián)納米膠束在還原性環(huán)境下，DTT含量大于等于10mM 時(shí)，解交聯(lián)釋放藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了硫辛酸修飾的聚乙二醇-聚氨基酸兩親三嵌段共聚物的制備和應(yīng)用，所述兩親三嵌段聚合物的親水鏈為聚乙二醇，中間疏水鏈段為聚谷氨酸芐酯，末端疏水鏈段為聚苯丙氨酸，且中間鏈段的側(cè)鏈用硫辛酸修飾。所述兩親三嵌段聚合物在水中自組裝形成外冠為聚乙二醇，中間殼為硫辛酸修飾的聚谷氨酸芐酯，內(nèi)核為聚苯丙氨酸的聚合物納米膠束；可以通過對(duì)納米膠束進(jìn)行交聯(lián)，得到穩(wěn)定的還原敏感的殼交聯(lián)納米膠束，使得納米膠束在細(xì)胞外和血液中不易解離，從而保證納米膠束包封的藥物穩(wěn)定；一旦進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，納米膠束則快速解交聯(lián)而解離，將藥物快速釋放出來，產(chǎn)生高效治療效果；克服了藥物在體內(nèi)易泄漏、輸送效率低、細(xì)胞內(nèi)釋放慢等局限。
【IPC分類】C08G69/48, C08G69/40, A61K47/34, C08J3/24, A61K9/107, C08J3/00
【公開號(hào)】CN105524272
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410592281
【發(fā)明人】李玉玲, 王賽, 沈玉玲, 杜百祥
【申請(qǐng)人】江蘇師范大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2014年10月24日