膽酸修飾的聚氨基酸嵌段共聚物的合成及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種膽酸修飾的聚氨基酸嵌段共聚物，具體涉及一種聚氨基酸及在聚 氨基酸末端修飾膽酸，側(cè)鏈用硫辛酸修飾的兩親性嵌段聚合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合物膠束是由兩親性聚合物通過分子間的相互作用（氫鍵、親/疏水作用及范 德華力等）在水溶液中自組裝得到。是以疏水基團為內(nèi)核、親水基團為外殼的通過自組裝 形成的分子有序聚集體。聚合物膠束除了具有納米藥物載體的一些常見優(yōu)點之外，還有相 對其他納米載體而言（如脂質(zhì)體和聚合物納米粒）更為優(yōu)越的物理和生化性能：具有明顯 的核殼結(jié)構(gòu)，其中疏水核部分可用來包裹疏水藥物，親水殼可以使得膠束在水溶液中具備 優(yōu)越的穩(wěn)定性；可以有效減少人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)巨噬細(xì)胞的吞噬，能穿越細(xì)胞間隙， 可通過人體最小的毛細(xì)血管及血腦屏障（BBB)并被細(xì)胞組織吸收；增強的水溶解度和生物 利用度；延長藥物的循環(huán)時間，減少副作用；納米膠束藥物載體可以達(dá)到靶向輸送的目的 并能控制藥物釋放，有利于藥物對一些特殊部位的治療。納米膠束的諸多優(yōu)點，使其在藥物 的控制釋放上具有巨大應(yīng)用前景。
[0003] 將末端官能化的親水鏈段作為大分子引發(fā)劑對單體進行開環(huán)聚合反應(yīng)是制備兩 親聚合物的主要方法之一。常見的親水主鏈包括聚乙二醇（PEG)或聚磷酸酯（PEEP)等。常 用的可生物降解的疏水鏈段有聚氨基酸（如聚β-苯甲酰-L-天冬氨酸、聚γ-芐基-L-谷 氨酸和聚天冬氨酸等）。作為親水主鏈，聚乙二醇（PEG)是pH中性、無毒、水溶性、無抗原性 和免疫原性的聚合物，其具有優(yōu)越的水溶性和良好的生物相容性及血液相容性，作為膠束 的外殼，可以避免載藥系統(tǒng)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的識別和蛋白質(zhì)的吸附，從而延長了載藥系 統(tǒng)在血液中的循環(huán)時間，提高了藥物的生物利用度。作為疏水鏈段，天然的及合成的聚氨基 酸具有良好的生物相容性，其代謝產(chǎn)物對人體無害；就氨基酸材料而言，其為人體必需，能 自行降解、代謝而被機體吸收和排泄，具有其他的材料無法超越的優(yōu)點。已有聚氨基酸材料 用作縫合線材料，人工皮膚等，在藥物降解、抗腫瘤藥物控釋等領(lǐng)域已被廣泛的應(yīng)用。
[0004] 膽酸是人體內(nèi)主要的膽汁酸，其存在于人體內(nèi)，已有報道表明膽酸的修飾可以明 顯增加聚合物的載藥量及包封率，而且已經(jīng)成功地運用于藥物釋放。
[0005] 然而兩親聚合物通過自組裝形成的膠束往往不夠穩(wěn)定，注入體內(nèi)被血液大量稀釋 而發(fā)生解離，或與存在于血液中的細(xì)胞和生物分子相互作用造成藥物過早釋放，不能將藥 物輸送至靶向位點。交聯(lián)可以有效提高膠束穩(wěn)定性。近年來，具有環(huán)境（PH、溫度，氧化還原 環(huán)境等）響應(yīng)性的納米載體成為研究熱點（Sang Cheon Lee，et al. Biomaterials 2012， 33 :1489-1499 ;Chen et al，Journal of Controlled Release，2013,69 :171-179)。二硫 鍵交聯(lián)的膠束具有優(yōu)越的生物相容性，在生理環(huán)境下抑制藥物釋放，在體內(nèi)非常穩(wěn)定能長 循環(huán)，進入細(xì)胞后，能對體內(nèi)環(huán)境具有響應(yīng)性而解除交聯(lián)，將藥物釋放出來，從而產(chǎn)生了較 高的抗腫瘤活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種兩親嵌段聚合物的制備及應(yīng)用的方法。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是膽酸修飾的聚氨基酸嵌段共聚物的合成 及應(yīng)用，所述嵌段共聚物的主鏈由親水段和疏水段組成，疏水段末端修飾膽酸小分子，疏水 段側(cè)鏈為硫辛?；?。
[0008] 上述技術(shù)方案中，所述親水聚合物可選用的原料為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的原料， 所述親水性聚合物可選自但不限于：聚乙二醇（PEG)、聚磷酸酯中的一種；所述的兩親性聚 合物的分子量為5000~30000。
[0009] 上述技術(shù)方案中，所述膽酸修飾的聚氨基酸嵌段共聚物的疏水段側(cè)鏈包含硫辛酰 基。
[0010] 制備上述兩親性聚合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，以聚乙二醇-聚 (氨基酸-硫辛酸）-膽酸（PEG-pGlu (EDA-LA) -CA)的制備為例來說明膽酸修飾的兩親性嵌 段聚合物的制備方法，聚乙二醇-聚氨基酸通過開環(huán)聚合反應(yīng)方便得到：首先用PEG-NHjt 為大分子引發(fā)劑，開環(huán)BLG-NCA，然后在聚氨基酸末端連上膽酸，再對聚氨基酸部分進行胺 解，連上硫辛酸，其合成路線如圖1所示。
[0011] 上述技術(shù)方案中，所述聚氨基酸嵌段共聚物中硫辛?；臄?shù)目可通過加入的聚乙 二醇與BLG-NCA的比例、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等來調(diào)節(jié)。
[0012] 上述技術(shù)方案中，將硫辛酰基引入疏水聚合物聚氨基酸的側(cè)鏈，得到的兩親性聚 合物，通過自組裝形成納米膠束，然后通過還原劑如1.4-二硫代蘇糖醇（DTT)對硫辛酰基 的五元環(huán)進行交聯(lián)，來增加納米膠束的穩(wěn)定性，形成交聯(lián)納米膠束，這種交聯(lián)納米膠束對 細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境具有響應(yīng)性，能解除交聯(lián)。
[0013] 上述技術(shù)方案中，聚氨基酸末端修飾的膽酸可以增加膠束核的疏水面積，從而增 加載藥量。
[0014] 本發(fā)明的另一目的為提供一種交聯(lián)納米膠束。
[0015] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，一種交聯(lián)納米膠束，所述納米膠束的親 水層由親水性聚合物構(gòu)成，疏水層由膽酸和聚氨基酸構(gòu)成，聚氨基酸側(cè)鏈的硫辛?；梢?交聯(lián)。
[0016] 上述技術(shù)方案中，所述交聯(lián)納米膠束的粒徑為100~150納米，粒徑分布PDI為 0. 10 ~0. 25^
[0017] 制備上述交聯(lián)納米膠束的方法包括以下步驟：
[0018] (1)將上述膽酸修飾的兩親性嵌段聚合物通過自組裝形成納米膠束，所述納米膠 束的親水外層由聚乙二醇構(gòu)成，疏水層由小分子膽酸和聚氨基酸及硫辛?；鶚?gòu)成；
[0019] (2)將步驟（1)中納米膠束的核交聯(lián)，通過對硫辛酰基的五元環(huán)的交聯(lián)來穩(wěn)定納 米膠束結(jié)構(gòu)，得到交聯(lián)納米膠束。
[0020] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)中所述兩親聚合物在水中自組裝形成以硫辛?；揎?的聚氨基酸為疏水部分的尺寸穩(wěn)定，分布均一的納米膠束，所述納米膠束的粒徑為100~ 150nm〇
[0021] 上述技術(shù)方案中，步驟（2)中所述的交聯(lián)可采用但不局限于下列方法：
[0022] 利用疏基-二硫鍵交換（thiol-disulfide exchange)反應(yīng)，通過1，4-二硫代蘇 糖醇（DTT)對步驟（1)所得納米膠束中的含二硫鍵的五元環(huán)進行化學(xué)交聯(lián)；其中，1，4-二 硫代蘇糖醇（DTT)的用量是聚合物中的硫辛?；哪枖?shù)的10%，納米膠束能夠被成功交 聯(lián)。
[0023] 上述技術(shù)方案所得交聯(lián)納米膠束的穩(wěn)定性相對于沒有交聯(lián)的納米膠束大大提高， 即使稀釋1000倍（模擬IV注射）也不發(fā)生解離；對150mM和2M的氯化鈉的水溶液穩(wěn)定， 粒徑和分布變化不大；對有機溶劑如二甲亞砜穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)粒徑只是稍有變大。
[0024] 上述技術(shù)方案所得交聯(lián)納米膠束在還原環(huán)境中可以發(fā)生解交聯(lián)，用來解 交聯(lián)的還原劑可選自但不限于：含疏基的分子，如1，4_二硫代蘇糖醇（DTT)，谷 胱甘肽（GSH)或含三價磷的化合物，如磷酸三丁酯（Bu 3P)三（2-氯乙基）磷酸酯 (tris(2_carboxyethyl)-phosphine，TCEP);例如當(dāng) DTT 的濃度為 10mM 的時候，上述交聯(lián) 納米膠束會被解交聯(lián)。
[0025] 因為上述交聯(lián)納米膠束具有還原敏感性，所以可以應(yīng)用所述交聯(lián)納米膠束作為藥 物載體，兩親性嵌段聚合物末端修飾膽酸可提高交聯(lián)納米膠束對藥物的包載效率，提高交 聯(lián)納米膠束在體內(nèi)血液中循環(huán)的穩(wěn)定性，提高交聯(lián)納米膠束被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的效率，從而 提高藥物的生物利用度，同時交聯(lián)納米膠束可方便排除體外。
[0026] 本發(fā)明的另一目的為提供上述交聯(lián)納米膠束的應(yīng)用，所述交聯(lián)納米膠束作為藥物 載體的應(yīng)用。
[0027] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為，應(yīng)用上述膽酸修飾的兩親性聚合物 作為藥物載體的方法，包括以下步驟：
[0028] (1)藥物先溶在有機溶液中，再與所述兩親聚合物的有機溶液共同攪拌，然后再滴 加二次水，將得到的溶液攪拌0. 5小時后透析24小時，得到包裹藥物的納米膠束；
[0029] (2)對形成的納米膠束加入lOmol %相對于雙硫鍵的1，4-二硫代蘇糖醇（DTT)進 行交聯(lián)得到包裹藥物的交聯(lián)納米膠束。
[0030] 上述技術(shù)方案中，所述藥物可選自但不局限于：疏水性藥物中的一種。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)需要選擇所需包封的藥物分子。
[0031 ] 進一步技術(shù)方案中，為了解決藥物釋放中載體的細(xì)胞穿透/滲透性差的問題，通 ?？梢酝ㄟ^受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞（receptor mediated endocytosis)來促進細(xì)胞攝取。受 體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞一般通過生物靶向分子如單抗、多肽（如RGD)和葉酸的主動靶向來實現(xiàn) 細(xì)胞內(nèi)吞，從而增加藥物的生物利用度。
[0032] 以PEG-pGlu (EDA-LA) -CA為例，首先通過PEG-NH2開環(huán)聚合BLG-NCA得到兩親性 聚合物，聚氨基酸末端進行酯化反應(yīng)連上膽酸，用乙二胺對聚氨基酸中的芐氧羰基部分進 行胺解，再經(jīng)過酰胺化反應(yīng)連上硫辛酸。
[0033] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，PEG-pGlu (EDA-LA)-CA，其中，PEG溶于水和許多溶劑中，且該 聚合物有優(yōu)異的生物相容性，能被機體迅速排除體外而不產(chǎn)生任何毒副作用，還具有易于 改性的優(yōu)點；聚氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋 白質(zhì)的基本物質(zhì)。聚氨基酸能在體內(nèi)酶的作用下降解為氨基酸，生物相容性好，且安全無 毒，聚氨基酸的研究已受到廣泛的關(guān)注。聚氨基酸是一類低毒、生物相容性好、容易被機體 吸收、代謝的生物降解高分子，聚氨基酸與藥物通過化學(xué)鍵形成偶聯(lián)物，在體內(nèi)酸性環(huán)境及 酶的作用下化學(xué)鍵斷裂釋放藥物，達(dá)到緩釋、靶向的作用，并且可以降低藥物的毒性。硫辛 酸是FDA批準(zhǔn)的一種內(nèi)源性的抗氧化劑，可以去除機體自由基，降低血糖。因此整個體系具 有非常優(yōu)良的生物相容性。
[0034] 由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：
[0035] (1)由于本發(fā)明的兩親性聚合物的疏水部分為聚氨基酸和膽酸，膽酸能增加膠束 中核面積，從來提高載藥量，而聚氨基酸側(cè)鏈連上硫辛酸，可以通過對兩親聚合物自組裝形 成的納米膠束進行核交聯(lián)，得到穩(wěn)定的交聯(lián)的還原敏感的聚合物納米膠束，該納米膠束在 細(xì)胞外和血液中不易解離，從而保證納米膠束包裹的藥物穩(wěn)定；克服了藥物在體內(nèi)提前釋 放、運載效率低等不足。
[0036] (2) -旦進入腫瘤細(xì)胞，納米膠束快速解交聯(lián)而解離，藥物快速釋放出來，從而產(chǎn) 生高效治療作用。
【附圖說明】 圖1是膽酸修飾的聚氨基酸嵌段共聚物PEG-pGlu(EDA-LA)-CA的合成路線圖； 圖2是PEG-pGlu (EDA-LA) -CA載藥交聯(lián)膠束的制備，及其在