專利名稱：純化鵝去氧膽酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種純化鵝去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5j5-膽酸)的方法。 尤其，本發(fā)明涉及一種以高產(chǎn)率和高純度、由豬膽汁固體中含有的低 等級鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
背景技術：
鵝去氧膽酸通常含在牛、豬、熊或家禽，例如雞或鵝的膽汁中， 也含在人的膽汁中。鵝去氧膽酸是制備熊去氧膽酸的原料，熊去氧膽 酸能夠有效緩解膽汁系統(tǒng)的疾病、高脂血癥、膽石病和慢性肝病，本 領域已知的制備熊去氧膽酸的常用方法如下所示。
制備鵝去氧膽酸的常用方法包括步驟用甲基酯化膽酸 (3a，7a，12a-三羥基膽酸)；用無水乙酸對3a和7a位上的羥基進行乙酰 化作用以對其進行保護；使用鉻酸將12ot位上的羥基氧化為羰基，然 后通過Wolff-kichner還原反應除去羰基；水解所得產(chǎn)物并脫保護以得 到鵝去氧膽酸。上述方法需要將反應維持在高于200。C的溫度下，而 且原料的供應可能由于牛海綿狀腦病等而被中斷。
家禽的膽汁中含有鵝去氧膽酸、石膽酸和少量的膽酸。因此，從 家禽制備鵝去氧膽酸的方法是本領域公知的，但是由于原料供應減少 和產(chǎn)率低的原因這種方法在經(jīng)濟上并不可行[參見，Windhaus等人，I Physiol. Chem.， 140， 177 ~ 185(1924)。
美國專利No.4，186，143公開了 一種從來自天然豬膽汁的鵝去氧膽 酸混合物完全分離和純化鵝去氧膽酸的方法。該方法包括以下主要步 驟通過膽汁的急化作用而預處理除去3a-羥基-6-氧代-5p-膽酸；膽汁 酸的酯化；膽汁酸酯的乙酰化；使用非極性有機溶劑除去中間產(chǎn)物； 對式I的乙?；孽ミM行結(jié)晶；脫保護；和利用在有機溶劑中的結(jié)晶 來制備式I化合物。但是，該專利沒有描述用于式I的乙酰化酯的
HPLC內(nèi)容物，而且由于特有的旋光性為[aD25 +13.8°(c=l， CHC13), 熔點為119~121°C [STD: [a]D25 +15.2°(c=l， CHC13)，熔點127 ~ 129°C，因此終產(chǎn)物的純度非常低。而且，經(jīng)結(jié)晶純化終產(chǎn)物需要非 常長的時間(即，16-48小時)，并且整個過程有八個(8)步驟之復雜。因 此，當使用上述方法純化式I化合物時，終產(chǎn)物的產(chǎn)物變低，反應時 間長達12天。因此，該方法經(jīng)濟上不可行。
尤其，當上述方法用于本發(fā)明中所用的含有35 55wt。/。鵝去氧膽 酸的豬膽汁固體時，攪拌過濾是困難的，因為所需的化合物與雜質(zhì)一 起沉淀和凝結(jié)。
為了克服上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種以高純度和高產(chǎn)率 純化式I和II化合物的方法，同時還縮短整個方法所需的時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種純化式I化合物的方法，<formula>formula see original document page 5</formula>
[式I
該方法包括下述步驟預處理豬膽汁；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯 的乙?；?；使用非極性有機溶劑除去中間產(chǎn)物；乙酰化膽汁酸酯的結(jié) 晶；和脫保護；其中該方法的特征在于
1) 作為預處理步驟，將含有35 55wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固 體溶解在含有鹽的有機溶劑中；
2) 作為結(jié)晶步驟，在15 25。C的溫度范圍內(nèi)，使從預處理步驟 獲得的產(chǎn)物在CL4醇中進行結(jié)晶；和
3) 作為脫保護步驟，通過加入堿使從結(jié)晶步驟獲得的產(chǎn)物脫保 護，并通過加入酸使脫保護的產(chǎn)物在水存在下結(jié)晶。
發(fā)明詳述
在本說明書中，措詞"豬膽汁固體"代表來自豬膽汁的固體，其含
有式I~IV的鵝去氧膽酸的混合物。
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，式I化合物代表鵝去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5p-膽酸， CDCA);式H化合物代表豬去氧膽酸(3a，6a-二羥基-5p-膽酸，HDCA); 式III化合物代表豬膽酸(3a，6a，7a-三羥基-5(5-膽酸，HCA);和式IV 化合物代表3a-羥基-6-氧代-5(5-膽酸(keto)。
下文中將舉例詳細說明根據(jù)本發(fā)明的純化鵝去氧膽酸的每個步驟。
步驟l:豬膽汁固體的預處理
為了在純化步驟中使用含有35 55wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固 體，攪拌所有的豬膽汁固體并在回流下將其溶解在有機溶劑中。然后， 將混合物冷卻至室溫，再攪拌1~2小時。之后使用濾紙，優(yōu)選濾紙和 硅藻土從混合物中除去不溶的物質(zhì)。減壓除去有機溶劑得到剩余物(例 如，CDCA、 HDCA、 HCA和keto)，將其用在下一步驟中。可以任 意選擇該步驟中使用的鹽，只要其不影響反應物中的化合物。優(yōu)選， 該鹽為選自氯化鈉、無水硫酸鎂(MgS04)和無水硫酸鈉中的至少 一種， 更優(yōu)選氯化鈉?；谟袡C溶劑的量，該步驟中所用的鹽的量優(yōu)選為5~ 10wt%。如果鹽的量小于5wt%，則不能充分除去豬膽汁固體中的水 和不溶性物質(zhì)(例如脂肪酸等)，其使過濾發(fā)生困難并且降低產(chǎn)率和酯 化反應的速度。如果鹽的量大于10wt%,則過量的鹽殘留成為雜質(zhì)， 使純化發(fā)生困難。優(yōu)選可以從能溶解豬膽汁固體中的鵝去氧膽酸并且 沒有不利影響的溶劑中任意選擇有機溶劑。更優(yōu)選，溶劑為乙酸乙酯 或丙酮。
步驟2:鵝去氧膽酸的酯化
向前面步驟所獲得的剩余物鵝去氧膽酸混合物中加入醇，之后回 流攪拌溶液直至剩余物完全溶解。然后將溶液冷卻至0 5。C。將酸催 化劑加入到溶液中，在室溫下攪拌溶液直至鵝去氧膽酸混合物的酯化 反應進行完全。當反應完全時，加入堿中和溶液，隨后進行過濾。用 醇洗滌濾出的物質(zhì)并減壓濃縮，得到剩余物鵝去氧膽酸酯混合物(例 如，CDCA-Me、 HDCA-Me、 HCA-Me和keto-Me)。對于用在該步驟
中的醇沒有特別限制，但是為了容易進行酯化反應優(yōu)選具有1 ~ 4個碳
原子的低級醇，更優(yōu)選甲醇。該步驟中使用的酸催化劑優(yōu)選為疏酸或
者對曱苯磺酸(PTSA)，堿為碳酸氫鈉、碳酸鈉或碳酸鉀。 步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙?；?br> 在回流下向前面步驟中獲得的剩余物中加入無水乙酸和弱堿，使 鵝去氧膽酸酯混合物中的所有羥基發(fā)生乙?；饔谩．敺磻耆珪r， 在回流攪拌下向反應溶液中加入甲苯。然后減壓濃縮反應溶液以除去 無水乙酸、乙酸和反應后剩余的堿，從而獲得剩余物乙酰化鵝去氧膽 酸酯混合物(例如，CDCA-diAc-Me、 HDCA誦diAc畫Me、 HCA國triAc畫Me 和keto-Ac-Me)。該步驟中使用的弱堿優(yōu)選為無水乙酸鈉或吡"定，更 優(yōu)選無水乙酸鈉。
步驟4:式III和IV中間產(chǎn)物的除去
將非極性溶劑加入到剩余物中。回流攪拌混合物直至剩佘物溶解 并冷卻至室溫。將溶劑的溫度保持在20~25°C, 4吏式ni和iv的中間 產(chǎn)物和一部分式II的中間產(chǎn)物(例如，HCA-triAc-Me、 keto-Ac-Me和 部分HDCA-diAc-Me)結(jié)晶并將其過濾除去。用非極性溶劑額外洗滌濾 過的物質(zhì)，之后減壓濃縮過濾和洗滌的溶液并真空干燥。該步驟中使 用的非極性溶劑優(yōu)選為己烷、庚烷、辛烷、異辛烷等，更優(yōu)選己烷或 庚烷。
步驟5:乙?；絀化合物的酯的制備
為了制備式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酉旨-甲酯(CDCA-diAe-Me)，其 為制備式I化合物的中間產(chǎn)物，將醇溶劑加入到從前面步驟獲得的產(chǎn) 物中，之后將混合物在15°C ~25°C，優(yōu)選20。C 25。C下放置2~3小 時以使式V化合物結(jié)晶。如果溫度低于15。C，則由于式V化合物發(fā) 生凝結(jié)而使攪拌和過濾發(fā)生困難，而如果溫度高于25。C,則結(jié)晶作用 不充分。當式V化合物發(fā)生結(jié)晶時，使用過濾從溶劑中除去式II的中 間產(chǎn)物。用醇溶劑洗滌如此過濾出的物質(zhì)，并真空干燥以獲得粗產(chǎn)物 式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酯-曱酯。為了以高純度，優(yōu)選99%或更高 含量地純化式V化合物，優(yōu)選加入醇溶劑并將混合物在0'C ~ 15°C,
優(yōu)選0°C 5。C下放置2~3小時。如果溫度低于0""C，則式V化合物 的含量降低，而如果溫度高于15。C，即使進行重結(jié)晶式V化合物的含 量仍降低。考慮到式V化合物的含量，結(jié)晶所用的醇溶劑優(yōu)選為具有 1~4個碳原子的直鏈或支鏈低級醇，更優(yōu)選乙醇、甲醇或異丙醇，最 優(yōu)選甲醇。結(jié)晶所用的醇的量為剩余物量的0.5~3倍，優(yōu)選1.0~2.0 倍。如果該量低于0.5倍，則由于晶體彼此凝結(jié)而難以過濾。如果該 量高于3倍，則式V化合物的含量不受該量的影響。
<formula>formula see original document page 9</formula>
步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結(jié)晶
在堿存在下對在前面步驟中獲得的式I化合物的中間產(chǎn)物-式V化 合物進行脫保護，并在酸性條件下將反應的pH調(diào)節(jié)至4或更低，優(yōu) 選2~3，以形成式I的鵝去氧膽酸。同時，在水存在下使反應溶液保 持在35~45°C，優(yōu)選35 40。C，以使式I化合物結(jié)晶。過濾反應溶液、 用水洗滌并真空干燥以完全精制鵝去氧膽酸。對用于脫保護的堿沒有 特別地限制，但是為了后處理步驟而優(yōu)選氫氧化鈉或氫氧化鉀。如果 pH大于4,則不形成晶體，如果pH小于2，則由于過量的酸而使終 產(chǎn)物的純度降低。如果在水中的結(jié)晶溫度低于35°C，則式I化合物的 純度降低，而如果溫度高于45。C，則由于來自式I化合物的晶體彼此 凝結(jié)而難以過濾。對用于中和反應溶液的酸沒有特別限制，但是為了 后處理步驟而優(yōu)選鹽酸或硫酸。由于來自前面步驟的剩余物含有99% 或更多的式V化合物，由于雜質(zhì)含量低，因而無需使用有機溶劑進行 附加的結(jié)晶作用就可以完全精制式I化合物。含有根據(jù)本發(fā)明的、從 水中結(jié)晶的式I化合物的產(chǎn)物適合于工業(yè)制備方法，因為與在有機溶
劑中結(jié)晶的式I化合物相比，其熔點高出約20。C，并且具有更小的體積。
下列實施例將更詳細地闡釋本發(fā)明。但是，應該理解下列實施例 的意圖是說明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 分析方法
使用HPLC來確定每個步驟分離出來的中間產(chǎn)物，試驗條件如下
柱Capcell pak UG120 C18(4.6 X 250mm， Shiseido)
流動相乙腈/水(85:15)
檢測器紫外分光計(21011111)
流速1.0ml/min
注入20jil
實施例
步驟l:豬膽汁固體的預處理
將600g含有35 ~ 40wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固體和240g氯化鈉 在2400ml乙酸乙酯中攪拌回流1小時，以溶解所有的豬膽汁固體。 然后，將混合物冷卻至20~25°C,攪拌1小時并用硅藻土過濾，用 240ml乙酸乙酯洗滌如此過濾的物質(zhì)。減壓濃縮過濾出的物質(zhì)以除去 有機溶劑，從而獲得剩余物鵝去氧膽酸混合物(CDCA、 HDCA、 HCA 和keto)。
步驟2:鵝去氧膽酸的酯化
向得自前面步驟的剩余物中加入1500ml甲醇，回流攪拌混合溶 液30分鐘直至剩佘物完全溶解。將溶液冷卻至0 10。C，在攪拌下將 19.5ml硫酸加入到溶液中，之后通過在20 ~ 25。C下攪拌2小時而使鵝 去氧膽酸混合物的酯化反應進行完全。當酯化反應完成后，用53.9g 碳酸氫鈉中和溶液，之后過濾。用600ml甲醇洗滌如此過濾的物質(zhì)， 并減壓濃縮而獲得534g剩余物鵝去氧膽酸酯混合物(CDCA-Me、 HDCA畫Me、 HCA-Me和keto-Me)。
步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙?；?br> 向534g得自前面步驟的鵝去氧膽酸酯混合物中加入80g無水乙酸
鈉和800ml無水乙酸。在120~ 140。C下回流混合溶液5小時，之后立 即減壓濃縮。向反應溶液中加入100ml甲笨，回流攪拌15分鐘并減 壓濃縮以徹底除去無水乙酸和乙酸，從而獲得剩余物乙酰化鵝去氧膽 酸酯混合物(CDCA畫diAc-Me、 HDCA-diAc-Me 、 HCA-triAc-Me和 keto-Ac-Me)。剩余物的HPLC結(jié)果(RT): HCA-triAc-Me(8.76min)、 keto-Ac-Me(9.05min)、 CDCA-diAc-Me(12.21min)和HDCA-diAc-Me (12.81min)。
步驟4:式III和IV中間產(chǎn)物的除去
向得自前面步驟的剩余物中加入非極性溶劑(2670ml己烷)，之后 將混合溶液攪拌回流30分鐘。然后，將己烷溶劑冷卻至25~35°C， 攪拌3小時，隨后過濾。用534ml己烷額外洗滌如此過濾的物質(zhì) (HCA-triAc-Me和keto-Ac-Me)，并減壓濃縮經(jīng)過濾和洗滌的溶液， 從而獲得剩余物式I和II的中間產(chǎn)物(CDCA-diAc-Me 、 HDCA-diAc-Me)。剩余物的HPLC結(jié)果(RT): CDCA-diAc-Me (12.21min)和HDCA-diAc國Me(12.81min)。
步驟5:鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯的制備
向得自前面步驟的剩余物中加入801ml曱醇，并將混合溶液攪拌 回流30分鐘，冷卻至20 25。C，再攪拌2小時，之后過濾。用267ml 甲醇洗滌過濾出的物質(zhì)(CDCA-diAc-Me),在60'C下真空干燥獲得 95~98%含量的粗產(chǎn)物。然后，向粗產(chǎn)物中加入288ml甲醇，并在0~ 5。C下重結(jié)晶2小時，以獲得99。/。含量的鵝去氧膽酸-二乙酸酯。產(chǎn)率 為143g(113.8g+29.2g母液)。m.p.: 128~129°C。剩余物的HPLC結(jié) 果(RT): CDCA-diAc國Me(12.21 min)。
步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結(jié)晶
向1425ml水中加入143g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-酯和171g氫氧化 鈉，之后將溶液攪拌回流4小時。使用342ml鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié) 至2~3。之后在35 45。C下攪拌溶液1小時，然后過濾。用142ml 水洗滌過濾出的物質(zhì)并在70。C下真空干燥得到113.8g純鵝去氧膽酸。 m.p.: 160 ~ 161°C， [alD25 +13.0。(c=l， CHC13)。
對比例
步驟1:膽汁的預處理
將150g濃縮的豬膽汁溶解在1000ml熱水中。然后加入lOOg氫 氧化鈉，攪拌回流溶液20小時。將該溶液冷卻至25。C。向溶液中加 入1500ml水，使溶液保持冷卻1天。將10g硅藻土加入到反應溶液 中，然后攪拌并過濾以除去沉淀的、式IV的3a-羥基-6-氧代膽酸鈉。 使用濃硫酸將濾出液的pH調(diào)節(jié)至8，之后加入5g連二亞硫酸鈉，然 后攪拌15分鐘。隨后將400ml乙酸乙酯加入到溶液中，再使用稀釋 的硫酸將pH調(diào)節(jié)至5。將溶液攪拌30分鐘，通過層分離而從中除去 水層。向有機層中加入7g硅藻土和7g活性炭，然后攪拌30分鐘并過 濾。用50ml乙酸乙酯洗滌如此過濾出的物質(zhì)，并減壓濃縮。
步驟2:膽汁酸的酯化
將得自前面步驟的剩余物溶解在300ml甲醇中。將4.0ml濃疏酸 加入到溶液中，在室溫下攪拌l天。之后用碳酸氫鈉(pH7)中和溶液、 過濾，然后減壓濃縮。
步驟3:式II的曱酯的除去
將得自前面步驟的剩余物溶解在320ml熱苯中，將混合溶液濃縮 至225ml并保持低溫1天。然后過濾溶液；用苯洗滌如此過濾出的物 質(zhì)(式II的曱酯苯加合物)，減壓濃縮苯-過濾和洗滌的溶液。
步驟4:膽汁酸酯的乙?；?br> 向得自前面步驟的剩余物中加入75ml無水乙酸和7.5g無水乙酸 鈉，之后將混合溶液攪拌回流5小時。通過蒸餾無水乙酸、加入35ml 曱醇，之后攪拌回流15分鐘，隨后減壓蒸餾而除去剩余的無水乙酸。
步驟5:式III的乙酰化酯的除去
在200ml己烷溶劑中回流得自前面步驟的剩余物，在2(TC下將溶 液貯存l天；并過濾。用己烷洗滌如此過濾出的物質(zhì)(HDCA-triAc-Me 的粗晶體)，并減壓蒸餾經(jīng)過濾和洗滌的溶液。
步驟6:式V化合物的分離
將得自前面步驟的剩余物溶解在46ml熱乙醇中，之后保持冷卻1
天。過濾該溶液，用27ml冷乙醇洗滌如此過濾出的物質(zhì)，并在60°C 下真空干燥。使用乙醇對21.5g式V的化合物進行3次重結(jié)晶，以獲 得18.5g產(chǎn)物。m.p. 119~121。C; [ajD25 +10.4°(c=l， 二氧雜環(huán)己烷);aID25 +13.80(c=l，CHCl3)。 步驟7:皂化和中和
向185ml水中加入18,5g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯和18.5g氫氧 化鈉，之后將混合溶液攪拌回流14小時，然后使用濃硫酸將溶液的 pH調(diào)節(jié)至4.5。
步驟8:式l化合物的制備
使用乙酸乙酯萃取反應溶液，從中棄去水層。用6%的鹽水洗滌 溶液中的乙酸乙酯層，并將溶液蒸餾至約90ml。冷卻該溶液，加入 90ml己烷，之后保持冷卻1天并過濾。用20ml己烷洗滌如此過濾出 的物質(zhì)，并在60。C下真空干燥以制備12.7g鵝去氧膽酸。m.p. 142 ~ 1450C; ["Id25 +13.0o(c=1， CHC13)。
工業(yè)實用性
本發(fā)明可以從豬膽汁固體中高產(chǎn)率和高純度地純化式I的鵝去氧 膽酸。而且，本發(fā)明由于縮短純化時間而適合用于工業(yè)純化。
權利要求
1.一種純化式I化合物的方法，該方法包括以下步驟豬膽汁的預處理；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯的乙酰化；使用非極性有機溶劑除去中間產(chǎn)物；乙?；懼狨サ慕Y(jié)晶；和脫保護；其中該方法的特征在于1)作為預處理步驟，將含有35～55wt％鵝去氧膽酸的豬膽汁固體溶解在含有鹽的有機溶劑中；2)作為結(jié)晶步驟，在15～25℃的溫度范圍內(nèi)，使從預處理步驟獲得的產(chǎn)物在C1-4醇中進行結(jié)晶；和3)作為脫保護步驟，通過加入堿使從結(jié)晶步驟獲得的產(chǎn)物脫保護，并通過加入酸使脫保護的產(chǎn)物在水存在下結(jié)晶。
2. 根據(jù)權利要求1的方法，其中用在預處理步驟中的鹽為選自下 列的至少一種鹽氯化鈉、無水硫酸鎂和無水硫酸鈉。
3. 根據(jù)權利要求2的方法，其中基于有機溶劑的總重量計，鹽的 量為5~ 10wt%。
4. 根據(jù)權利要求1的方法，其進一步包括在結(jié)晶步驟之后于0~ 15°C的溫度范圍內(nèi)在d-4醇中進行重結(jié)晶，其中該重結(jié)晶產(chǎn)物含有99% 或更多的式V化合物 <formula>formula see original document page 3</formula>
5. 根據(jù)權利要求1的方法，其中結(jié)晶步驟在20 25。C的溫度范圍內(nèi)進行。
6. 根據(jù)權利要求1的方法，其中結(jié)晶步驟中所用的醇的量為從中 間產(chǎn)物除去步驟獲得的剩余物的量的0.5 ~ 3倍。
7. 根據(jù)權利要求l的方法，其中脫保護步驟的pH為4或更小。
8. 根據(jù)權利要求1的方法，其中在水存在下的結(jié)晶于35~45°。的 溫度范圍內(nèi)進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種純化鵝去氧膽酸(3α，7α-二羥基-5β-膽酸)的方法。尤其，本發(fā)明涉及一種以高產(chǎn)率和高純度、由低等級的鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
文檔編號C07H21/00GK101365711SQ200680050036
公開日2009年2月11日 申請日期2006年7月31日 優(yōu)先權日2005年12月30日
發(fā)明者尹然貞, 崔秀珍, 李圣宰, 李炳具, 林永默, 秦庸碩, 金月永, 金泰利, 金英洙 申請人:株式會社大熊制藥;大熊化學株式會社