一種制備蜀葵單倍體細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種制備植物單倍體材料的方法，特別是設及一種制備蜀葵單倍體材 料的方法。
【背景技術】
[0002] 蜀葵，又稱一丈紅，為錦葵科蜀葵屬多年生草本植物。蜀葵全株入藥，有很大的藥 用價值，具有清熱解毒、鎮(zhèn)咳利尿的功效。蜀葵花中含有大量花青素，可作為食用著色劑。蜀 葵花呈總狀花序頂生單瓣或重瓣，有紫、粉、紅、白等色，顏色亮麗、清新，具有極大的觀賞價 值，可種植在庭院W及公園內，同時蜀葵對二氧化硫、氯化氨等具有較強抗性，是優(yōu)良的城 市景觀植物，已經培養(yǎng)出了千葉、五屯、、重臺、剪絨、銀口等名貴品種。由于其出色的藥用、觀 賞、及城市綠化價值，近年來對蜀葵的需求量也越來越大。
[0003] 單倍體細胞可W用來培育單倍體植株，培育新品種，獲得純系育種材料和進行單 倍體育種，縮短育種年限和提高育種效率。另外在發(fā)酵動力學方面，利用單倍體材料建立 單細胞懸浮體系用來進行單倍體細胞在植物細胞懸浮培養(yǎng)中的動力學研究，探索單倍體細 胞在植物懸浮培養(yǎng)中的優(yōu)勢。然而自然界中自然產生單倍體的頻率一般是很低的，僅在 0. 002%~0. 02%之間，依據植物細胞全能性，利用花藥培養(yǎng)來獲得單倍體材料成功的解決 了運一問題，目前已經有200多種具有經濟價值和觀賞價值的植物通過花藥培育獲得了單 倍體，其中W茄科和禾本科居多，然而有關蜀葵乃至錦葵科植物方面花藥培養(yǎng)的報道幾乎 沒有。因此非常有必要提供一種方法來驗證花藥培養(yǎng)在蜀葵乃至錦葵科植物中的可行性， 并獲得單倍體細胞。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用花藥培養(yǎng)制備蜀葵單倍體細胞的方法。 陽005]本發(fā)明的技術方案概括如下。
[0006] 一種利用花藥培養(yǎng)制備蜀葵單倍體細胞的方法包括W下步驟：
[0007] (1)蜀葵花蕾采摘和預處理：五月底，采集尚未開放的蜀葵花蕾，鏡檢花粉鑒定花 藥發(fā)育時期處于單核中期或者后期。并放入4°c冰箱進行低溫預處理24~72h。
[0008] (2)蜀葵花藥培養(yǎng)：將預處理的花蕾用自來水沖洗比，用濃度為2%~10%得次氯 酸鋼浸泡lOmin~25min。用無菌水沖洗后，在超凈臺上剝開花蕾取出花藥用75%酒精沖 洗20~30s，然后用無菌水反復沖洗干凈，再用無菌濾紙吸干多余水分，接種于固體培養(yǎng)基 上。在生化培養(yǎng)箱中25~27°C溫度條件下暗培養(yǎng)20d左右即可得到愈傷組織。繼代培養(yǎng) 3~5次。
[0009] 做流式細胞術鑒定不同倍性細胞：從的愈傷組織上切下300~500mg的愈傷，放 在提前預冷的平皿上，加入解離緩沖液2ml，用刀片快速切碎，整個過程在冰上操作。在4°C 下解育lOmin，用200目篩子過濾，2000r/min離屯、5min，棄上清，加入400ul濃度為50ug/ ml的PI(含RNA酶A)后在4°C下避光染色20min，用500目篩子過濾，收集濾液利用流式細 胞儀測定。處理數據統(tǒng)計其中單倍體細胞和多倍體細胞的數目和比例。
[0010]蜀葵花藥愈傷誘導固體培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、 6-節(jié)氨基嚷嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為1~3111旨/1、糞乙酸的最終濃 度為0~2mg/l、6-節(jié)氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/l、薦糖終濃度為30/L、瓊脂終濃度為6g/ L，抑=5. 8-6. 0。 W11] 流式細胞術應用的解離緩沖液為Ga化raith緩沖液：45mmol/L MgCl2、30mmol/L， sodium citrate(巧樣酸鋼）、20mmol/L M0PS(4-丙橫酸基嗎嘟）和0.1% (w/v)T;riton X-100,去離子水定容至200血，pH7. 0 陽01引本發(fā)明的優(yōu)點
[0013] 本發(fā)明利用花藥培養(yǎng)得到蜀葵單倍體細胞，首次驗證了通過花藥培養(yǎng)得到單倍體 細胞在蜀葵乃至錦葵科植物上應用的可行性。且不受外部條件限制，操作相對簡單，成本低 廉，重復性好，誘導速度快，得到的愈傷生長快、長勢好。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0015] 花藥愈傷誘導率=(誘導出愈傷組織的花藥數/總接種花藥數）X 100%。
[0016] 實施例1
[0017]固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-節(jié)氨基嚷 嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為Img/l，糞乙酸的最終濃度為Omg/l，6-節(jié) 氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/L，薦糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為6g/l，調抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。 陽〇1引實施例2
[0019]固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入2，4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-節(jié)氨基嚷 嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為Img/l，糞乙酸的最終濃度為Img/l，6-節(jié) 氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/L，薦糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為6g/l，調抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0020] 實施例3
[0021]固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-節(jié)氨基嚷 嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為Img/l，糞乙酸的最終濃度為2mg/l，6-節(jié) 氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/L，薦糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為6g/l，調抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用. 陽0巧實施例4
[0023] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-節(jié)氨基嚷 嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為2mg/l，糞乙酸的最終濃度為Omg/l，6-節(jié) 氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/L，薦糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為6g/l，調抑=5. 8,在 12rC，0.IMpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用.
[0024] 實施例5
[00巧]固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入2,4二氯苯氧乙酸、糞乙酸、6-節(jié)氨基嚷 嶺、薦糖和瓊脂，使2,4二氯苯氧乙酸的終濃度為2mg/l，糞乙酸的最終濃度為Img/l，6-節(jié) 氨基嚷嶺的終濃度為1. 5mg/L，薦糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為6g/l，調抑=5