化合物i和化合物ii及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤癌癥疾病預(yù)防和治療的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及化合物I和 化合物II及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性黑色素瘤是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，是皮膚癌中常見(jiàn)的惡性腫 瘤，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，目前主要的治療方法是放療、化療和手術(shù)治療，然而，傳統(tǒng)的治療并不能將 其徹底治愈，隨著腫瘤免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療已成為人們研究 的熱點(diǎn)。Toll樣受體（Toll like receptors, TLRs)是一類(lèi)重要的模式識(shí)別受體，屬于I 型跨膜蛋白，在各種免疫細(xì)胞上有表達(dá)，TLRs在激發(fā)先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)過(guò)程中 發(fā)揮重要作用。TLRs的激動(dòng)劑作用于抗原遞呈細(xì)胞，比如樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cell， DC)，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而更好的激發(fā)免疫反應(yīng)。TLR7 (Toll like receptor 7)是 Toll樣受體之一，TLR7的配體主要是病毒核酸成分，也可以識(shí)別一些合成的小分子激動(dòng) 劑，TLR7被激活后能夠引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。T7(第一反應(yīng)物）是深圳大學(xué)深圳合成生 物學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室合成的一種化學(xué)小分子TLR7受體的激動(dòng)劑，據(jù)研究表明Τ7具有提高先 天性免疫的能力，在體外作用于骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠迅速產(chǎn)生炎癥介質(zhì)TNF-α和 IL-12以及作用于淋巴細(xì)胞迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-12,其中T7的來(lái)源和制備過(guò)程參考文 獻(xiàn)"Local administration of a novel Toll-like receptor 7agonist in combination with doxorubicin induces durable tumouricidal effects in a murine model of T cell lymphoma" Journal of Hematology&Oncology. 2015, Mar 4 ；8(1) :21. doi:10. 1186/ S13045-015-0121-9)"。利尿酸（Ethacrynic acid，EA，第二反應(yīng)物）又叫依他尼酸，是一種 利尿劑，有文獻(xiàn)表明，利尿酸具有多種抗腫瘤效應(yīng)，但無(wú)法激發(fā)特異性的抗腫瘤細(xì)胞免疫反 應(yīng)，使得其抗腫瘤效應(yīng)差、副作用大，腫瘤細(xì)胞反復(fù)復(fù)發(fā)生長(zhǎng)。
[0003] 乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，患者大部分是女性，并且晚期患者 易發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，乳腺癌的治療方式主要是手術(shù)治療、放療、化療，然而放療和化療在殺傷 癌細(xì)胞同時(shí)也會(huì)殺傷正常細(xì)胞，嚴(yán)重破壞了機(jī)體的免疫系統(tǒng)。腫瘤生物治療是腫瘤治療的 第四種方式，腫瘤免疫治療是腫瘤生物治療中比較有應(yīng)用前景的一種治療方法，而這種治 療對(duì)乳腺癌也是比較好的一種治療方法。腫瘤免疫治療的目的是激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系 統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的免疫細(xì)胞，從 而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。R0R1 (Receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor，第三 反應(yīng)物）是一個(gè)典型的I型孤兒受體酪氨酸激酶樣表面蛋白，研究發(fā)現(xiàn)許多人源癌細(xì)胞系 表達(dá)R0R1，R0R1在乳腺腺癌中高表達(dá)，但是正常乳腺組織不表達(dá)R0R1，R0R1的表達(dá)與腫瘤 生長(zhǎng)有關(guān)，R0R1表達(dá)越高，腫瘤生長(zhǎng)越快。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，R0R1的表達(dá)與乳腺腺癌早期轉(zhuǎn)移、 復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)，R0R1表達(dá)越高轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的概率越高并且預(yù)后越差，高表達(dá)R0R1的 患者無(wú)轉(zhuǎn)移生存期比低表達(dá)患者短，阻礙R0R1的表達(dá)能有效抑制癌細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移，因此 R0R1可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，但是R0R1的免疫原性較弱，不能激發(fā)先天性免疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供結(jié)構(gòu)式為式I和式II的化合物及其制備方法和應(yīng)用，即化 合物I和化合物II及其制備方法和應(yīng)用，具體是提供由T7 (第一反應(yīng)物）和EA (第二反應(yīng) 物）偶聯(lián)得到的結(jié)構(gòu)全新的式I的化合物，并由式I的化合物聯(lián)合R0R1 (第三反應(yīng)物）共 價(jià)得到全新的式II的化合物，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的EA和R0R1無(wú)法誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而引起的 治療效果差及帶來(lái)的不良反應(yīng)等問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種式I的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0007] 上述式I化合物的制備方法，包括如下步驟：
[0008] S1、將第一反應(yīng)物
和第二反應(yīng)物利尿酸
溶于反應(yīng)溶劑中，加入HBTU苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽、三乙胺和催化 劑4-二甲氨基吡啶，室溫下攪拌反應(yīng)；
[0009] S2、反應(yīng)完成后將反應(yīng)液倒入水中，抽濾，濾渣經(jīng)水洗、干燥得到式I的化合物。
[0010] 在本發(fā)明的式I的化合物的制備方法中，在步驟S1中，所述第一反應(yīng)物、第二反 應(yīng)物、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽和三乙胺以下述摩爾比份數(shù)進(jìn)行反 應(yīng)：第一反應(yīng)物4-12份、第二反應(yīng)物5-15份、HBTU苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六 氟磷酸鹽5-15份以及三乙胺18-30份。優(yōu)選地，所述第一反應(yīng)物、第二反應(yīng)物、苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽和三乙胺以下述摩爾比份數(shù)進(jìn)行反應(yīng)：第一反應(yīng)物 6-10份、第二反應(yīng)物7-12份、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽7-12份以及 三乙胺22-28份；更優(yōu)選地，第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物之間的反應(yīng)摩爾比為1 :1。而催化劑 4_二甲氨基吡啶的用量為催化量即可。
[0011] 在本發(fā)明的式I的化合物的制備方法中，在步驟S1中，所述反應(yīng)溶劑選自四氫呋 喃、甲苯、苯、Ν，Ν-二甲基甲酰胺、Ν，Ν-二甲基乙酰胺和Ν-甲基吡咯烷酮中的任意一種或多 種，優(yōu)選Ν，Ν-二甲基甲酰胺。
[0012] 在本發(fā)明的式I的化合物的制備方法中，步驟S1的反應(yīng)時(shí)間為8-24小時(shí)，優(yōu)選為 10-15小時(shí)。
[0013] 在本發(fā)明的式I的化合物的制備方法中，在步驟S2后還包括步驟S3 :將得到的式 I的化合物經(jīng)柱層析分離進(jìn)行純化，其中柱層析分離所用溶劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶 劑，二氯甲烷與甲醇的體積比為20 :1。
[0014] 上述式I的化合物具有在制備用于預(yù)防和免疫治療黑色素瘤引起的皮膚癌的藥 物中的用途。
[0015] 本發(fā)明還提供了由式I的化合物制備得到的式II的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0017] 上述式II的化合物的制備方法是：將第三反應(yīng)物溶于二甲基亞砜中，加入式I的 化合物，室溫?cái)嚢?-24小時(shí)，優(yōu)選攪拌12小時(shí)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測(cè)反應(yīng)，制備液 相色譜分離，得到式II的化合物；
[0018] 其中，第三反應(yīng)物為R0R1，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0020] 第三反應(yīng)物與式I的化合物的反應(yīng)摩爾配比為1 :1。
[0021] 上述式II的化合物具有在制備用于預(yù)防和免疫治療乳腺癌的藥物中的用途。
[0022] 實(shí)施本發(fā)明的式I和式II的化合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：本 發(fā)明中的新合成的式I的化合物在大大提高利尿酸（EA)的抗腫瘤效果上，能夠激發(fā)抗腫瘤 的先天性免疫和細(xì)胞免疫，探索了抗腫瘤免疫協(xié)同一體化的藥物設(shè)計(jì)；證明了式I的化合 物抗黑色素瘤的免疫反應(yīng)機(jī)制。本發(fā)明由式I的化合物與R0R1共價(jià)制備的式II的化合物 明顯減慢了乳腺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)，證明式II的化合物治療乳腺癌的免疫反應(yīng)機(jī)制，同 時(shí)證明了式I的化合物不僅具有激發(fā)先天性免疫和適應(yīng)性免疫的功能，還具有有免疫佐劑 的作用。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為式I化合物T7-EA的HPLC譜圖；
[0024] 圖2為式I化合物T7-EA的質(zhì)譜圖；
[0025] 圖3A為不同濃度的式I化合物T7-EA體外誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ影響的對(duì) 比圖；
[0026] 圖3Β為不同濃度的式I化合物Τ7-ΕΑ體外誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-12影響的對(duì) 比圖；
[0027] 圖4為不同濃度的式I化合物T7-EA對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖影響的對(duì)比圖；
[0028] 圖5為式I化合物Τ7-ΕΑ、Τ7、ΕΑ和對(duì)照組分別對(duì)腫瘤增長(zhǎng)影響的對(duì)比圖；
[0029] 圖6為式I化合物Τ7_ΕΑ、Τ7、ΕΑ和對(duì)照組分別引起細(xì)胞毒性Τ淋巴細(xì)胞引起反應(yīng) 的對(duì)比圖；
[0030] 圖7為式II化合物的質(zhì)譜圖；
[0031] 圖8Α為不同濃度的Τ7-ΕΑ誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ影響的對(duì)比圖；
[0032] 圖8Β為不同濃度的Τ7-ΕΑ誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-12影響的對(duì)比圖；
[0033] 圖9為式II化合物T7-EA-R0R1、Τ7-ΕΑ、R0R1和對(duì)照組分別刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生 的細(xì)胞因子TNF-α的對(duì)比圖；
[0034] 圖10A為式II化合物T7-EA-R0R1、T7-EA、R0R1和對(duì)照組分別刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn) 生的細(xì)胞因子IFN-γ的對(duì)比圖；
[0035] 圖10B為式II化合物T7-EA-R0R1、T7-EA、R0R1和對(duì)照組分別刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn) 生的細(xì)胞因子IL-12的對(duì)比圖