br>[0157] 金標(biāo)紙層析試紙的制備方法包括W下步驟：
[0158] 1)包被硝酸纖維素膜（NC膜）2
[0159] 用濃度為l-5mg/mL的單克隆抗體lF2anti包被檢測線燈線）。用濃度為l-5mg/ mL的羊抗鼠免疫球蛋白（購自北京博爾西科技有限公司）包被質(zhì)控線（C線）。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機(jī)將單克隆抗體lF2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分別噴于300mm長、25mm 寬的硝酸纖維素膜（購自Millipore公司）2上，形成相互分離的檢測線6和質(zhì)控線5,質(zhì)控 線和測試線間距一般為0. 3-1.Ocm,優(yōu)選0. 5cm，37°C干燥1小時(shí)備用。
[0160] 2)結(jié)合物釋放墊4的制備
[0161] 2. 1用膠體金標(biāo)記單克隆抗體lF2anti，方法為：在磁力加熱攬拌下，向=角瓶中 加入155血純化水，煮沸。加入1 %四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1 %巧樣酸S鋼溶液 7mU煮沸5分鐘，即為膠體金溶液，冷卻后保存于2-8°C。取1毫升膠體金溶液于離屯、管 中。加入15y1 0. 2M碳酸鐘溶液，室溫靜止5min。加入10y1抗體，混勻后靜置30min。加 入10^120%654溶液，平衡5111111。加入10^120%陽620000溶液，平衡30111111;用離屯、 機(jī)1000化pm，離屯、lOmin，去上清液。加入IOOiil金標(biāo)復(fù)溶液（含有2%薦糖、1 %酪蛋白、 0. 5%BSA、0.ITritonX100、0. 1%SDS的棚酸緩沖液），復(fù)溶后備用。
[0162] 2. 2制備結(jié)合物釋放墊：結(jié)合物釋放墊的材質(zhì)為玻璃纖維膜，其上包被有膠體金 標(biāo)記的特異性單克隆抗體lF2anti，將復(fù)溶后的金子用金標(biāo)復(fù)溶液1:4稀釋后按照8yVcm 的速度噴膜，37°C下放置2小時(shí)干燥，備用。
[0163] 3)制備金標(biāo)紙層析測試條和測試卡
[0164] 在PVC背板7上先黏貼硝酸纖維素膜2,在靠近硝酸纖維素膜質(zhì)控線的一端黏貼吸 水墊1，在靠近測試線一端黏貼結(jié)合物釋放墊4和樣品墊3,得到用于檢測口蹄疫O型（0/ Mya98/BY/2010)病毒金標(biāo)紙層析試紙，然后可按所需大小進(jìn)行切割，得到用于檢測口蹄疫 O型（0/Mya98/BY/2010)病毒金標(biāo)紙層析測試條，加干燥劑后密封保存。
[0165] 如將上述步驟制備的測試條裝入塑料卡中，制成測試卡，并組裝成試劑盒，該試劑 盒對(duì)應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點(diǎn)樣口，對(duì)應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗（圖7)。
[0166] 2、金標(biāo)紙層析測試條和測試卡的使用
[0167] 金標(biāo)紙層析試紙條的使用方法：將樣品墊端浸入樣品中，樣品墊3即吸取液體向 上端移動(dòng)，流經(jīng)結(jié)合物釋放墊4時(shí)使干片上的膠體金標(biāo)記單克隆抗體lF2anti復(fù)溶，并帶動(dòng) 其向硝酸纖維膜2滲移。若樣本中有待測特異抗原（陽性樣本），其可與膠體金標(biāo)記單克隆 抗體lF2anti結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至檢測線6即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色檢 測線條燈線）。過剩的膠體金標(biāo)記單克隆抗體lF2anti繼續(xù)前行，至質(zhì)控線5與羊抗鼠免 疫球蛋白（固相二抗）結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條（C線）。反之，若樣本中無待測特異抗 原（陰性樣本），則無檢測線條燈線），而僅顯示質(zhì)控線條（C線）。如果檢測線燈線）與 質(zhì)控線（C線）均不顯色或僅檢測線燈線）顯色，則表示金標(biāo)紙層析試紙（卡）失效（圖 5)O
[0168] 金標(biāo)紙層析測試卡和試劑盒的使用方法：檢測時(shí)，取待檢樣品1-2滴，滴在試紙盒 的點(diǎn)樣口，根據(jù)觀測窗內(nèi)的檢測線燈線）和質(zhì)控線（C線）是否出現(xiàn)色帶來確定樣品中是 否存在口蹄疫O型（0/Mya98/BY/2010)病毒。
[0169] 3、用單克隆抗體lF2anti及金標(biāo)紙層析試紙盒檢測口蹄疫O型（0/Mya98/ BY/2010)病毒
[0170] 用單克隆抗體lF2anti及金標(biāo)紙層析試紙盒檢測不同濃度（濃度分別為500、250、 125、62. 5、31.3ng/mL)的口蹄疫O型（0/Mya98/BY/2010)病毒，W檢測試紙盒的靈敏度。
[0171] 檢測結(jié)果如圖7所示，檢測靈敏度可達(dá)62. 5ng/mU表明該產(chǎn)品具有較好的靈敏 度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒為免疫原免疫小鼠獲得的持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1F2,保藏編號(hào)為CGMCC No.10896。2. 由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株1F2CGMCCNo. 10896分泌的單克隆抗體 lF2anti〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體lF2anti，其特征在于：所述單克隆抗體lF2anti 的重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQIDNo: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且可與口蹄疫〇型（〇/ Mya98/BY/2010)病毒特異結(jié)合的多肽，輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQIDNo:2的氨基酸 殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQIDNo:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且可與口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒特異結(jié)合的多肽。4. 編碼權(quán)利要求2或3所述單克隆抗體lF2anti的基因（lF2anti)，其重鏈可變區(qū)編 碼基因具有序列表中SEQIDNo:3的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:l的DNA序列或 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，其輕鏈可 變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:2的DNA 序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5. 獲得權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的方法，包括以下步驟： 1) 用口蹄疫〇型（〇/Mya98/BY/2010)病毒作為免疫原免疫動(dòng)物； 2) 分離免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤； 3) 篩選雜交瘤細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞株1F2。6. 獲得權(quán)利要求2或3所述單克隆抗體lF2anti的方法，在權(quán)利要求5的基礎(chǔ)上繼續(xù) 包括以下步驟： 4) 從雜交瘤細(xì)胞株1F2的培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞株1F2的動(dòng)物的腹水液中分離并純 化出單克隆抗體lF2anti。7. -種檢測口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA試劑盒，包括權(quán)利要求2或 3或4所述單克隆抗體lF2anti。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，包括用lF2anti作為包被抗體包被的微孔 板和用lF2anti作為酶標(biāo)抗體的酶標(biāo)記抗體工作液； 所述用lF2anti作為包被抗體包被的微孔板指的是用10mMρΗ7· 0-7. 4PBS將lF2anti稀釋成〇. 5-10μg/mL，加入微孔板中，110μ1/孔，置于2-8°C過夜；拍干后，加入含1 %BSA 的10mM?!17.0-7.4?85,30(^1/孔，置于2-8°(：過夜；拍干、干燥后真空裝入鋁箱袋中備用； 所述酶標(biāo)抗體可用辣根過氧化物酶（HRP)或堿性磷酸酯酶（ALP)等標(biāo)記酶標(biāo)記抗體， 然后用酶標(biāo)記抗體稀釋液（配方為：Na2HP04 · 12H20 2. 9g，NaH2P04 · 2H20 0. 296g，NaCl 8.5g，Proclin300 0.6mL，BSA10g，胎牛血清 150mL，酶穩(wěn)定劑 5g，Tween-20 0.25mL，用雙 蒸水定溶至l〇〇〇mL，調(diào)整pH值至7. 6-7. 8)稀釋成工作液，工作液的濃度為0. 1-1. 0μg/ mL〇9. 權(quán)利要求7或8所述試劑盒的使用方法，用于對(duì)口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病 毒的ELISA檢測，是用權(quán)利要求2或3所述單克隆抗體lF2anti作為包被抗體及酶標(biāo)抗體 的雙抗夾心ELISA檢測，包括以下步驟： 1) 用單克隆抗體lF2anti包被96孔微孔板并封閉； 2) 加待測樣品，洗板； 3) 加用辣根過氧化物酶（HRP)或堿性磷酸酯酶（ALP)標(biāo)記的單克隆抗體lF2anti，洗 板； 4) 加底物顯色； 5)終止反應(yīng)； 6) 測定0D45。值。10. -種檢測口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的金標(biāo)紙層析試紙，由玻璃纖維膜 樣品墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊、硝酸纖維素膜（NC膜）組成，硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C線），其特征在于： 用濃度為l_5mg/mL的權(quán)利要求2或3所述單克隆抗體lF2anti包被檢測線（T線）； 用濃度為l_5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被質(zhì)控線（C線）；結(jié)合物釋放墊上包被有膠體 金標(biāo)記的特異性單克隆抗體lF2anti;所述單克隆抗體lF2anti如權(quán)利要求2或3所述。
【專利摘要】本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的抗口蹄疫O型病毒的單克隆抗體與應(yīng)用，使用可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作為免疫原得到能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1F2，并由該細(xì)胞株分泌得到單克隆抗體1F2anti。該單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，可用于檢測口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，并具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用在口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的檢測、疫苗生產(chǎn)、流行病學(xué)研究中。CGMCC No.1089620150623
【IPC分類】C12N5/20, G01N33/535, C12N15/13, G01N33/558, C12R1/91, G01N33/577, G01N33/569, G01N33/543, C07K16/10
【公開號(hào)】CN105296434
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510737022
【發(fā)明人】鄭金來, 張翀宇, 吳園園, 劉國英, 任旭榮, 李蓉, 范秀麗, 郝金寶, 蒼楓, 劉飛
【申請(qǐng)人】北京三聯(lián)博悅生物技術(shù)有限公司, 金宇保靈生物藥品有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月3日