一種雜交瘤細(xì)胞的制備及其分泌的單抗與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到生物工程領(lǐng)域的雜交瘤細(xì)胞制備方法、單克隆抗體與應(yīng)用領(lǐng)域，具 體涉及到抗H-FABP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法以及單克隆抗體與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這 兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特 征是它的抗體分泌功能和能在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限 分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交 細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì) 胞，這種雜種細(xì)胞叫做雜交瘤細(xì)胞。
[0003] 雜交瘤細(xì)胞的制備方法通常包括動(dòng)物免疫制備脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞的制備、飼養(yǎng) 細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選以及雜交瘤細(xì)胞克隆這幾個(gè)步驟。
[0004] 通常的細(xì)胞免疫過程是利用重組蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生免疫脾細(xì)胞，在這一過程中， 某些重組蛋白的氨基酸序列具有多個(gè)抗原表位，能夠產(chǎn)生多種免疫脾細(xì)胞，包括分泌特異 性抗體和非特異性抗體的免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成雜交瘤細(xì)胞，96孔 板培養(yǎng)后進(jìn)入雜交瘤細(xì)胞篩選階段。
[0005] 常用的篩選方法是利用間接ELISA法篩選出96孔板中的陽性孔，其原理是利用抗 原和96孔板內(nèi)產(chǎn)生的抗體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，再通過顯色等二抗標(biāo)識(shí)出陽性孔，完成篩 選過程。但在上述具有多個(gè)抗原表位的重組蛋白免疫小鼠后，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體 包括特異性和非特異性抗體，當(dāng)利用間接ELISA法篩選時(shí)，其中的非特異性抗體也能發(fā)生 顯示陽性的免疫反應(yīng)，這就會(huì)導(dǎo)致在一些只有非特異性抗體而沒有特異性抗體的孔內(nèi)，篩 選結(jié)果也具有陽性的假陽性干擾，影響篩選的準(zhǔn)確性，妨礙了整個(gè)流程的效率。
[0006] 心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP)是分子量為14~15kd的可溶性胞漿蛋白，主要 分布于心肌組織中，約占心肌細(xì)胞可溶性蛋白的4%~8%，在骨骼肌、腎小管、腦組織、乳 腺、胎盤組織中也有少量分布。H-FABP是由132個(gè)氨基酸殘基組成酸性蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn) (PI)為5,其基因定位于1號(hào)染色體。
[0007] 在正常情況下，長(zhǎng)鏈脂肪酸是心肌細(xì)胞的主要能量來源。H-FABP作為脂肪酸的載 體蛋白與心肌內(nèi)的長(zhǎng)鏈脂肪酸相結(jié)合，將其從細(xì)胞質(zhì)膜向線粒體運(yùn)輸，從而進(jìn)入能量代謝 體系中氧化分解，生成三磷酸腺苷，為心肌收縮提供能量。此外，還參與旁路信號(hào)傳導(dǎo)：如通 過脂肪酸信號(hào)易位至過氧化物酶體增生物激活受體間接調(diào)控基因表達(dá)，并被認(rèn)為當(dāng)心肌缺 血造成局部長(zhǎng)鏈脂肪酸聚集時(shí)，H-FABP對(duì)心肌有保護(hù)作用。
[0008] 生理?xiàng)l件下，血漿和尿中不含H-FABP或含量很少，正常人血液中可以檢測(cè)到低濃 度的H-FABP。性別、年齡和晝夜節(jié)律均可引起H-FABP含量的變化如男性肌肉比例高于女 性，因此男性血漿H-FABP濃度高于女性；血中H-FABP主要由腎臟清除，血漿H-FABP濃度隨 年齡升高。
[0009]H-FABP具有很強(qiáng)的組織特異性，在心肌損傷后被迅速釋放入血，在急性心肌梗死 (AMI)發(fā)病1小時(shí)開始升高，快速達(dá)峰值，可以作為AMI等心肌損傷早期檢測(cè)的生化標(biāo)志物。
[0010] 目前，血漿H-FABP的臨床檢測(cè)主要有放射免疫分析（RIA)、酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)、免疫比濁法等方法。RIA檢測(cè)步驟繁瑣，且存在放射性污染，不適合臨床應(yīng)用； ELISA操作繁瑣，不適合單個(gè)樣品的檢測(cè)；免疫比濁法借助臨床全自動(dòng)免疫比濁分析儀，自 動(dòng)化程度高，但對(duì)儀器設(shè)備要求高，需要專業(yè)人士操作，因此這些方法在簡(jiǎn)便、快捷的應(yīng)用 模式上，均存在不可忽略的弊端，尤其不適合急診及現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。膠體金免疫層析技術(shù)屬于即 時(shí)檢測(cè)（p〇int-〇f-care-testing，P0CT)領(lǐng)域中的成熟技術(shù)，能快速、靈敏、簡(jiǎn)捷的實(shí)現(xiàn)指 標(biāo)的定性檢測(cè)，而且此技術(shù)正逐漸向定量檢測(cè)發(fā)展，尤其適合于單樣品的急診檢驗(yàn)。H-FABP 單克隆抗體（monoclonal-antibody，mAb)是診斷試劑盒中最關(guān)鍵的原材料，無論在何種免 疫學(xué)的檢測(cè)方法中均有使用，其親合力和特異性直接決定了H-FABP單檢測(cè)試劑盒臨床應(yīng) 用結(jié)果的準(zhǔn)確性。商品化mAb在國(guó)外已經(jīng)制備成功，國(guó)內(nèi)尚無此mAb能成功用于臨床診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞的制備方法，尤其是提供一種磁珠法篩選雜 交瘤細(xì)胞，排除免疫后產(chǎn)生非特異性抗體對(duì)的篩選干擾的方法。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是利用上述的制備方法制備分泌抗H-FABP單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞株FABP4A8和雜交瘤細(xì)胞株FABP4C2,于2015年6月26日保藏于位于湖北省武 漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)分別為CCTCC NO:C2015111和CCTCCNO:C2015112,并制備其單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供上述抗H-FABP單克隆抗體的應(yīng)用。
[0014] 具體方案如下：
[0015] -種雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選、雜交瘤 細(xì)胞克隆，其特征是在雜交瘤細(xì)胞篩選過程中，排除非特異性抗體的干擾，選出目的細(xì)胞進(jìn) 行細(xì)胞克隆，具體步驟如下：將非特異性抗體特異結(jié)合抗原偶聯(lián)磁珠，稀釋后加入96孔板 置于磁鐵上方，吸附抗原~磁珠在板底部，加入細(xì)胞上清，非特異性抗體與抗原~磁珠結(jié)合 在板底部，排除其干擾，再確定陽性孔，進(jìn)行目的細(xì)胞克隆得到雜交瘤細(xì)胞。
[0016] 在動(dòng)物免疫過程中，免疫原具有特異性抗原表位和非特異性抗原表位，免疫后產(chǎn) 生分泌特異性抗體的細(xì)胞和分泌非特異性抗體的細(xì)胞。
[0017] 所述的非特異性抗體干擾是由于在檢測(cè)陽性孔時(shí)，非特異性抗體和特異性抗體均 能產(chǎn)生陽性反應(yīng)，在不存在特異性抗體僅存在非特異性抗體的孔中，檢測(cè)結(jié)果也判定成陽 性孔，造成錯(cuò)誤，干擾正常陽性孔的判斷。
[0018] 利用上述方法制備的雜交瘤細(xì)胞，為分泌抗H-FABP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞， 分別命名為雜交瘤細(xì)胞株FABP4A8和雜交瘤細(xì)胞株FABP4C2,保藏編號(hào)為CCTCCN0: C2015111和CCTCCNO:C2015112。
[0019] 制備該細(xì)胞時(shí)，以H-FABP重組蛋白為免疫原，氨基酸序列表為SEQINNO:1，具有 特異性抗原表位SEQINNO:2和SEQINNO:3和非特異性抗原表位SEQINNO:4,非特異 性抗原表位免疫后生成分泌非特異性抗體的細(xì)胞干擾細(xì)胞篩選，利用所述細(xì)胞篩選方法排 除干擾，完成篩選和細(xì)胞克隆得到目的細(xì)胞。
[0020] 所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗H-FABP的單克隆抗體，命名為4A8和4C2,單克隆抗體 亞型為IgGl。
[0021 ] -種如上所述的單克隆抗體的應(yīng)用，利用已制備的抗體4A8和/或4C2分別作檢 測(cè)和捕獲抗體，建立標(biāo)準(zhǔn)的雙抗夾心檢測(cè)方法，檢測(cè)天然血清中的H-FABP。
[0022] -種如上所述的單克隆抗體在免疫診斷檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，包括化學(xué)發(fā)光免疫 試劑盒、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、膠體金免疫試劑盒、熒光免疫試劑盒中，抗體均采用所述的 抗H-FABP單克隆抗體。
[0023] 有益效果
[0024] 本發(fā)明在雜交瘤細(xì)胞篩選過程中采用磁珠偶聯(lián)抗原排除非特異性抗體對(duì)陽性孔 篩選的干擾，不同于傳統(tǒng)的篩選方式，簡(jiǎn)化了篩選過程，提高了工藝效率。同時(shí)本發(fā)明通過 成熟、規(guī)?；目贵w篩選及應(yīng)用平臺(tái)，自主研發(fā)制備單克隆抗體，為診斷試劑提供關(guān)鍵性的 生物材料，屬于國(guó)內(nèi)首創(chuàng)，突破了FABP診斷試劑領(lǐng)域所面臨的原料進(jìn)口、試劑進(jìn)口的嚴(yán)重 依賴狀況。雜交瘤細(xì)胞株可穩(wěn)定、高效分泌單抗，經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)、凍存，復(fù)蘇后仍生長(zhǎng) 良好。本發(fā)明制備出的單克隆抗體效價(jià)均在1 :1〇5以上，經(jīng)鑒定后其特異性高，能應(yīng)用于心 肌梗死早期檢測(cè)和診斷制劑和試劑盒中去。
【附圖說明】
[0025] 圖1為使用本發(fā)明雜交瘤篩選方法對(duì)含特異性抗體、非特異性抗體混合體系作用 示意圖
[0026]圖2為使用本發(fā)明雜交瘤篩選方法對(duì)錦漢非特異性抗體體系作用示意圖
[0027] 圖3為ELISA鑒定單克隆抗體4