專利名稱：制備雜交細(xì)胞/嵌合細(xì)胞的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交細(xì)胞和用于生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。具體地,本發(fā)明涉及從至少3 個(gè)細(xì)胞的雜交產(chǎn)生的雜交細(xì)胞，其中至少2個(gè)細(xì)胞源自不同的譜系。本發(fā)明另外涉及雜交細(xì)胞用于表達(dá)蛋白的應(yīng)用，所述蛋白可用于多種診斷用途、預(yù)防用途、治療用途和/或研究用途。
背景技術(shù)：
在本說明書自始至終對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的任何討論，絕不能視作承認(rèn)這樣的現(xiàn)有技術(shù)是廣泛已知的，或形成本領(lǐng)域的普通一般常識(shí)的一部分。多種不同的細(xì)胞類型目前被用于表達(dá)蛋白，所述蛋白在商業(yè)上與多種診斷用途、 預(yù)防用途、治療用途和/或研究用途有關(guān)。目前，這樣的蛋白的生產(chǎn)常規(guī)地在細(xì)胞中進(jìn)行， 所述細(xì)胞例如細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲和非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)常以多種翻譯后修飾來修飾蛋白，所述翻譯后修飾包括、但不限于糖基化、?；?、磷酸化、甲基化、硫酸化、異戍二烯化和脂質(zhì)化(Iipidation)。這些修飾是物種特異性的，且因而，目前用于生產(chǎn)商業(yè)上有關(guān)的蛋白的細(xì)胞表現(xiàn)出這樣的翻譯后修飾所述修飾不同于在從人細(xì)胞表達(dá)的蛋白或在人體中天然存在的蛋白上觀察到的翻譯后修飾。例如，許多用于生產(chǎn)商業(yè)上有關(guān)的蛋白的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型要么缺少糖基化蛋白的能力， 要么表現(xiàn)出這樣的糖基化模式所述模式不同于在人細(xì)胞中表達(dá)的蛋白所表現(xiàn)出的糖基化模式。甚至在非人哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，確證了與人細(xì)胞相比糖基化模式的顯著差異。例如，用于重組蛋白表達(dá)的CHO細(xì)胞系缺乏功能性的(α2， 6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，該酶用于合成在人細(xì)胞中存在的(α 2，6)-連接的末端唾液酸。此外， 在CHO-細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白上存在的唾液酸基序易于被CHO細(xì)胞內(nèi)源性的唾液酸酶降解 (Gramer 等人 Biotechnology 13(7) :692_&，1995)。作為非人表達(dá)系統(tǒng)的不同翻譯后修飾譜(repertoires)的結(jié)果，由它們表達(dá)的蛋白可能表現(xiàn)出不同于人細(xì)胞-衍生的蛋白的生理化學(xué)特征和藥理學(xué)特征，諸如半衰期、免疫原性、穩(wěn)定性和功能性的功效。這可以在很大程度上影響這些蛋白的臨床效用。還有日益增多的證據(jù)表明，除了它的物種-依賴性的性質(zhì)以外，在相同的物種內(nèi)， 翻譯后修飾也可以是組織特異性的，甚至是細(xì)胞類型特異性的。這具體地與表現(xiàn)出終末糖基化的蛋白的組織特異性的表達(dá)和細(xì)胞類型特異性的表達(dá)有關(guān)(Feizi Nature 314 53-54,1985 ;Rademacher 等人 Annu Rev Biochem 57 :785-838,1988)。具體地，已經(jīng)表明， 3種唾液酸轉(zhuǎn)移酶(它們將末端唾液酸附著至糖蛋白糖鏈上)表現(xiàn)出在大鼠的7種組織中顯著不同的表達(dá)(Paulson等人J. Biol. Chem. 264 :10931-10934，1989)。這為相同蛋白的組織特異性的糖基化提供了支持。此外，使用由來自骨髓的小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)的高度磷酸化的糖蛋白(小鼠骨橋蛋白)的兩種同工型的研究，表現(xiàn)出它們的磷酸化程度的主要差異，這與生物活性的差異有關(guān)。這些結(jié)果提示，由不同的細(xì)胞類型生產(chǎn)的骨橋蛋白的功能是不同的(Christensen 等人 J Biol. Chem. 282(27) : 19463-19472)。適用于生產(chǎn)表現(xiàn)出全人特征的生物制品的有效的細(xì)胞系統(tǒng)理想地應(yīng)當(dāng)滿足許多標(biāo)準(zhǔn)，包括、但不限于
a)源自人組織；
b)在培養(yǎng)中高密度生長；
c)表現(xiàn)出商業(yè)上可行的蛋白得率；
d)允許穩(wěn)定的外來基因?qū)耄?br> e)允許基因擴(kuò)增方法；
f)允許使用親本細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體生產(chǎn)，如在人-人雜交瘤中；
g)表現(xiàn)出穩(wěn)定的長期蛋白表達(dá)；
h)在無血清的和無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的能力；
i)缺乏內(nèi)肽酶活性，從而減少蛋白降解，
j)不含有致病劑，包括病毒DNA和支原體；
k)生產(chǎn)表現(xiàn)出翻譯后修飾的蛋白，所述翻譯后修飾在功能上與在天然存在的人蛋
白上發(fā)生的翻譯后修飾類似或相同，優(yōu)選地是組織和細(xì)胞特異性的。這些翻譯后修飾可以包括、但不限于糖蛋白上的碳水化合物部分。盡管存在許多用于表達(dá)人蛋白的人宿主細(xì)胞或異源雜交瘤(heterohybridomas), 但它們都沒有成功地滿足所有上述標(biāo)準(zhǔn)。最值得注意的是，從現(xiàn)有的人細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以臨床上有用的得率表達(dá)和分離蛋白的嘗試，已經(jīng)導(dǎo)致有限的成功。真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)在多個(gè)階段受到控制，所述階段包括(a)調(diào)節(jié)因子對(duì)染色質(zhì)中的基因的影響；(b)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)；和(c)翻譯后修飾。認(rèn)為這些不同的階段是發(fā)育階段特異性的和/或組織特異性的。因而，當(dāng)將編碼所需蛋白的外源基因摻入細(xì)胞中時(shí)，所需蛋白的表達(dá)可能小于最佳量?？赡墚a(chǎn)生問題，諸如缺乏穩(wěn)定的表達(dá)(Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 95 :3650-3654,1998 ;Miyaji 等人，Cytotechnology，3 :133_140，1990 ; Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :173-180,1990 ；Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :39-43, 1990 ;Satoh 等人，Cytotechnology 13 :79_88，1993)、低表達(dá)得率(Airoldi 等人，Cancer Research 61 :1285-1290，2001 ；Hosoi 等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)和非最佳的翻譯后修飾(Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 =3466-3473,2003)。所有這些因素都可能影響蛋白的潛在商業(yè)效用。作為一個(gè)實(shí)例，Namalwa細(xì)胞(在懸浮培養(yǎng)物中生長并適應(yīng)沒有血清和清蛋白的培養(yǎng)基的人B類淋巴母細(xì)胞)的一個(gè)亞系Namalwa KJM-1,被用于大規(guī)模生產(chǎn)α-干擾素， 后者是伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞的內(nèi)源蛋白。但是，當(dāng)將G-CSF蛋白(它對(duì)于伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞而言是外來的，但是對(duì)于B細(xì)胞而言是內(nèi)源的(Airoldi等人，Cancer Research 61 1285-1290,2001))用作經(jīng)由電穿孔的轉(zhuǎn)染的靶向蛋白時(shí)，G-CSF表達(dá)水平在多個(gè)氨甲蝶呤 (MTX)抗性的克隆中存在不同，且最高的G-CSF生產(chǎn)克隆具有僅2. 4μ g/ml/天的比生產(chǎn)率 (當(dāng)適應(yīng)無血清的條件時(shí))。此外，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目超過7xl05細(xì)胞/ml時(shí)，高密度培養(yǎng)抑制比生產(chǎn)率(Hosoi等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)。即使報(bào)道的最大G-CSF濃度顯著提高并達(dá)到41 μ g/ml, 但為了實(shí)現(xiàn)它，需要廣泛地并費(fèi)力地操縱細(xì)胞培養(yǎng)條件，其中非常嚴(yán)緊地控制pH。也表明用于最佳生長的培養(yǎng)基不同于用于最佳生產(chǎn)的培養(yǎng)基，因而產(chǎn)生希望的高密度和高生產(chǎn)率之間的明顯沖突，并導(dǎo)致工業(yè)上不可行的系統(tǒng)。因?yàn)檎婧松镏械幕虮磉_(dá)在多個(gè)步驟中受到控制，所述步驟包括(a)染色質(zhì)中的基因的調(diào)節(jié)因子的可用性和可接近性；(b)對(duì)特定轉(zhuǎn)錄起始速率的可及啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)；和(c)隨后在不同的步驟處的轉(zhuǎn)錄后事件，組織特異性的和發(fā)育特異性的轉(zhuǎn)錄因子的存在對(duì)基因的表達(dá)具有很大影響。此外，特定細(xì)胞類型的基因調(diào)節(jié)需要幾種順式作用的DNA調(diào)節(jié)序列的協(xié)同作用，所述調(diào)節(jié)序列是將分子信號(hào)傳遞給基因的蛋白的結(jié)合位點(diǎn) (Blackwood等人,Science 281 :60-63,1998)。這些序列結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，以形成稱作增強(qiáng)體 (enhanceosome)的復(fù)合物(Marika 等人,Curr Opin Genet Dev 11(2) :205-208, 2001)。 因而，當(dāng)導(dǎo)入人譜系特異性的宿主細(xì)胞中時(shí)被靶向的基因離它的通常細(xì)胞環(huán)境越遠(yuǎn)，所需蛋白在高生產(chǎn)水平的穩(wěn)定表達(dá)和生產(chǎn)越低。當(dāng)用外來蛋白的基因轉(zhuǎn)染Namalwa KJM-I細(xì)胞時(shí)，所述外來蛋白進(jìn)一步遠(yuǎn)離譜系特異性的蛋白(對(duì)于類淋巴母細(xì)胞系而言)，諸如β干擾素(Miyaji 等人，Cytotechnology, 3 :133-140,1990 ；Miyaji 等人，Cytotechnology 4 173-180,1990)或人淋巴毒素(Miyaji 等人，Cytotechnology 4:39-43,1990)或尿激酶原 (Satoh等人，Cytotechnology 13 :79-88,1993),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞生產(chǎn)率甚至更低。外來基因在人譜系特異性的細(xì)胞系中的有效表達(dá)也需要小心的、且有時(shí)使人厭煩的合適的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子選擇，所述增強(qiáng)子/啟動(dòng)子將含有人宿主細(xì)胞可利用的核因子的結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)這樣的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子仍然可能導(dǎo)致這樣的啟動(dòng)子的有限的適合性。例如，當(dāng)研究幾種增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(諸如猿猴病毒40(SV40)早期基因啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(hCMV)主要立即早期基因啟動(dòng)子、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MuLV)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)在Namalwa KJM-I細(xì)胞中對(duì)外來基因的更有效表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Mo-MuLV啟動(dòng)子是傳統(tǒng)的SV40早期啟動(dòng)子的約10倍強(qiáng)，且高生產(chǎn)克隆達(dá)到 30-40 μ g/IO6 細(xì)胞 / 天的生產(chǎn)率(Satoh 等人，Cytotechnology 18 162-172,1996)。 但是，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體諸如Mo-MuLV的問題是,難以用于具有倒轉(zhuǎn)序列(inverting sequences)(內(nèi)含子)的基因的轉(zhuǎn)染，這是由于核剪接機(jī)制對(duì)它們的去除(Li等人，Proc Ntl Acad Sci USA 95:3650-3654,1998)。在由2個(gè)基因編碼的蛋白(諸如抗體)的情況下，甚至進(jìn)一步增加細(xì)胞和核環(huán)境之間的不匹配。此外，盡管Namalwa KJM-I細(xì)胞被用于制備人-人雜交瘤，但抗體得率使得該細(xì)胞系不適合工業(yè)生產(chǎn)。作為另一個(gè)實(shí)例，已經(jīng)證實(shí)人胚腎細(xì)胞系293可以被外來來源的基因非常容易地轉(zhuǎn)染，具有高度的穩(wěn)定性。但是，源自293轉(zhuǎn)染子的蛋白具有有限的用途，且通常僅適用于研究目的，這是因?yàn)?93細(xì)胞包括人腺病毒AdOTNA (HEK 293細(xì)胞)。但是，在商業(yè)場(chǎng)合使用 293細(xì)胞的最大限制是它的貼壁性質(zhì)。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來使293細(xì)胞適合懸浮液中的有效轉(zhuǎn)染，其中使用節(jié)省成本的載體諸如聚乙烯亞胺(Durocher等人，Nucleic Acids Res 30(2) :e9, 2002 ;Schlaeger 等人,Cytotechnology 30:71-83,1999)或憐酸隹丐(Girard 等人，Cytotechnology 38 :15-21, 2002 ； Jordan 等人，Cytotechnology 26 :39-47,1998 ； Meissner 等人，Biotechno I Bioeng 75(2) :197-203, 2001)。但是，這些載體僅導(dǎo)致重組蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，這意味著，對(duì)于接種的培養(yǎng)物的每個(gè)新批次，必須重復(fù)轉(zhuǎn)染。在EBV的oriP 存在于載體主鏈上時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)懸浮生長和更高的蛋白表達(dá)，必須遺傳地修飾293細(xì)胞，以穩(wěn)定地表達(dá) ElB 病毒 EBNAl 蛋白(293E) (Durocher 等人，Nucleic Acids Res 30(2) e9, 2002 ;Parham 等人，Cytotechnology 35 :181-187, 2001 ;Schlaeger 等人，Cytotechnology 30 :71-83，1999)。甚至在用EBNAl轉(zhuǎn)染以后，當(dāng)在無血清培養(yǎng)基(HEK293EBNA1)中培養(yǎng)(大規(guī)模生產(chǎn)的先決條件)時(shí)，293E細(xì)胞表現(xiàn)出非常差的轉(zhuǎn)染率，這最可能是由于為了防止細(xì)胞集合而加入的聚陰離子(肝素，硫酸葡聚糖)的存在。已經(jīng)嘗試如下減輕該問題給培養(yǎng)基補(bǔ)加蛋白胨，所述蛋白胨從動(dòng)物來源(諸如肉、明膠和酪蛋白)的酶促水解得到(Pham 等人，Biotechnol Bioeng 84(3) :332-42,2003) 當(dāng)將 HEK293 EBNAl 細(xì)胞系用于生產(chǎn) Tie-2 (血管形成素(angiopoietin)生長因子的受體酪氨酸激酶)和神經(jīng)租蛋白-IED (介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞導(dǎo)向的受體)時(shí)，蛋白表達(dá)受到得到的低細(xì)胞密度培養(yǎng)物(與在未轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中得到的那些相比)的限制。同樣，得到的蛋白的>95%的純度僅適用于研究級(jí)產(chǎn)物。 另外，HEK293EBNA1細(xì)胞不適用于生產(chǎn)單克隆抗體(mAb)。目前的生產(chǎn)治療用mAb的策略包括使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(即CHO或NSO轉(zhuǎn)染瘤)來重組地生產(chǎn)由下述獲得的mAbs :免疫接種攜帶人Ig基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(xenomice), 人源化哨齒類動(dòng)物mAbs,或通過篩選人mAb文庫(van Di jk等人,Curr. Opin. Chem. Biol. 5 368-374,2001)。盡管在它們的序列方面，治療用mAb最近已經(jīng)發(fā)展成嵌合抗體(嚙齒類動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū))、人源化的抗體(除了嚙齒類動(dòng)物互補(bǔ)決定區(qū)以外，都是人序列) 和全人抗體(人Ab)以使變應(yīng)性應(yīng)答最小化，但治療用mAb的重要方面是它的引起免疫效應(yīng)子功能(諸如抗體依賴性細(xì)胞毒作用)的能力，如果mAb是由改變它的天然糖基化模式的非人宿主細(xì)胞生產(chǎn)的，則該能力受損(Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 =3466-3473, 2003)?？紤]到這些事實(shí)，理想的方案是，由人細(xì)胞生產(chǎn)治療用抗體。在該情況下，全人mAb 將能夠發(fā)揮人效應(yīng)子功能，并因?yàn)樗鼈兊奶烊坏娜私Y(jié)構(gòu)而具有非常有限的免疫原性。已經(jīng)報(bào)道了雜交瘤或EB病毒(EBV)-轉(zhuǎn)化的源自人B細(xì)胞的類淋巴母細(xì)胞系的制備(Kirman 等人，Hybrid. Hybridomics 21 :405-414,2002 ；Boerner 等人，J. Immunol. 147 86-95,1991 ;Zafiropoulos 等人，J. Tmmunol. Methods 200 :181-190,1997)。但是，關(guān)于這些mAb和系在它們的長期穩(wěn)定性和生產(chǎn)過程的適合性(尤其是整批生產(chǎn)過程中的生產(chǎn)水平和Ig分泌的穩(wěn)定性)方面的表征，存在有限的信息。盡管已經(jīng)報(bào)道了在4天運(yùn)行期間以 I. 2g/升的累積效價(jià)生產(chǎn)抗人GM-CSF的人mAb的細(xì)胞系，但這些細(xì)胞系源自原代人B細(xì)胞與異源髓淋巴瘤(heteromyelolymphoma)K6H6/B5細(xì)胞(即從人B細(xì)胞淋巴瘤和小鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交得到的小鼠-人細(xì)胞系)的體細(xì)胞雜交(融合)(Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 103(10) :3557-3562,2006)。在EBV-轉(zhuǎn)化的情況下，困難是，確立完全無限增殖化的人B細(xì)胞系，同時(shí)維持穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)。這是由于無限增殖化的低功效、細(xì)胞生長的停滯、和生產(chǎn)IgM的細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)無限增殖化。另外，最近的報(bào)道已經(jīng)表明，大多數(shù)EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞具有縮短的端粒和有限的壽命，主要是在160群體倍增水平之前(Sugimoto等人，J Virol 73 =9690-9691,1999 ； Toda等人，J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787 :197-206, 2003)。為了克服該問題，已經(jīng)嘗試使EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞與合適的配偶體細(xì)胞系(表達(dá)系統(tǒng))雜交(或融合)，但是實(shí)際上，這些配偶體細(xì)胞系代表異源雜合體(heterohybrid)的各種組合，諸如源自小鼠-人異源雜交瘤與人B細(xì)胞的三源雜交瘤(trioma) (Ainai等人,Hum Antibodies 15 139-154, 2006 ;Kalantarov 等人，Hum Antibodies 11 :85-96, 2002 ;Karpas 等人，ProcNatl Acad Sci USA 98 :1799-1804，2001)。當(dāng)將這樣的三源雜交瘤與生產(chǎn)針對(duì)破傷風(fēng)毒素 (TT)的抗體的原代EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞融合時(shí)，導(dǎo)致產(chǎn)生具有1/4的小鼠組分的四源雜交瘤 (tetroma)。盡管在連續(xù)克隆四源雜交瘤3次以后仍然可能穩(wěn)定地生產(chǎn)針對(duì)TT的mAb，但這樣的重復(fù)的細(xì)胞克隆步驟是費(fèi)力的且費(fèi)時(shí)的。另外，盡管由四源雜交瘤生產(chǎn)的mAb的量對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩允亲銐虻模撍綄?duì)于作為藥物的mAb的大規(guī)模生產(chǎn)而言是不足的。仍然有疑問的是，在有多克隆激活劑CpG 2006或者CD19或BCR的共同連接(co-ligation) 存在下，無限增殖化是否可能產(chǎn)生完整的系統(tǒng)，用于以適當(dāng)?shù)捏w積有效地生產(chǎn)用于治療用途的特定 mAb (Hartman 等人，J Tmmunol 164 :944-953, 2000 ;Hur 等人，Cell Prolif 38: 35-45,2005 ;Traggiai 等人，Nat Med 10 :871-875,2004)。已經(jīng)嘗試了許多方法來使用人細(xì)胞生產(chǎn)生物學(xué)物質(zhì)，諸如生長因子、抗體和可溶性的蛋白。本發(fā)明的一個(gè)目的是，克服或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)缺點(diǎn)，或提供有用的替代方案。

發(fā)明內(nèi)容
普遍認(rèn)為，多融合細(xì)胞是不穩(wěn)定的，且參與融合的細(xì)胞越多，得到的雜交細(xì)胞的不穩(wěn)定性越大。令人驚奇地，在本發(fā)明中，由許多細(xì)胞(例如3個(gè)細(xì)胞)的融合產(chǎn)生的雜交細(xì)胞表現(xiàn)出功能穩(wěn)定性。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，源自不同譜系的細(xì)胞可以體細(xì)胞地 (somatically)融合或雜交，以形成基本上穩(wěn)定的嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及如下制備的跨譜系(cross-lineage)嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞雜交至少3個(gè)親本細(xì)胞，產(chǎn)生三雜交體(tri-hybrid)，其中至少2個(gè)親本細(xì)胞源自不同的譜系，且其中在雜交中沒有包括骨髓瘤細(xì)胞。還已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的穩(wěn)定的嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞具有多種用途，例如，用于生產(chǎn)表現(xiàn)出希望的翻譯后修飾(例如，但不限于，人糖基化模式)的蛋白。還已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)從本發(fā)明的嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞同時(shí)地表達(dá)第二種所需蛋白時(shí)，可以增強(qiáng)來自本發(fā)明的穩(wěn)定的嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞的所需蛋白的表達(dá)水平。此外，從本發(fā)明的嵌合細(xì)胞/雜交細(xì)胞同時(shí)地表達(dá)第三種所需蛋白，可以增強(qiáng)2種靶蛋白的表達(dá)水平。因此，本發(fā)明提供了在雜交細(xì)胞的多方適應(yīng)性和穩(wěn)定性方面明顯勝過以前已知的系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過融合2個(gè)相同的細(xì)胞或相同譜系的2個(gè)細(xì)胞以及不同譜系的I個(gè)細(xì)胞，生產(chǎn)本發(fā)明的雜交細(xì)胞。這樣的雜合體傾向于出現(xiàn)指向在雜交中使用的大多數(shù)細(xì)胞類型的表型。這些雜交細(xì)胞可以特別地用于表達(dá)蛋白，其中已知組織-特異性的翻譯后修飾對(duì)于蛋白功能而言是重要的。例如，從包括至少2個(gè)源自B細(xì)胞譜系的細(xì)胞的雜交細(xì)胞，可以更有效地表達(dá)已知在從B細(xì)胞表達(dá)時(shí)具有特定功能性的翻譯后修飾的細(xì)胞因子，從而確保功能性的翻譯后修飾。由于蛋白的翻譯后修飾可能是組織特異性的或細(xì)胞類型特異性的，所以技術(shù)人員顯而易見，本發(fā)明的雜交細(xì)胞也可以富含特定細(xì)胞類型或表型(如特定CD標(biāo)記物的存在所證實(shí)的)，以允許表達(dá)這樣的蛋白所述蛋白表現(xiàn)出希望的翻譯后修飾或與特定細(xì)胞類型或表型有關(guān)的希望的功能性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及雜交細(xì)胞，其包括使用至少一個(gè)無限增殖化的細(xì)胞。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，本發(fā)明也涉及非無限增殖化的細(xì)胞的融合，所述細(xì)胞隨后可以通過體外轉(zhuǎn)化方法無限增殖化，所述方法例如導(dǎo)入病毒基因，例如EB病毒 (EBV)、猿猴病毒40 (SV40) T抗原、腺病毒ElA和ElB和人乳頭瘤病毒(HPV) E6和E7?；蛘撸?通過表達(dá)端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白(TERT)，可以使非無限增殖化的細(xì)胞無限增殖化。 無限增殖化的細(xì)胞也可以源自其中癌基因表達(dá)已經(jīng)被修飾的細(xì)胞。無限增殖化的細(xì)胞另外可以源自誘導(dǎo)無限生長的能力的任何動(dòng)作，包括、但不限于紫外線暴露或自發(fā)轉(zhuǎn)化(其中無限增殖的機(jī)理不明)。顯而易見，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及3個(gè)個(gè)別細(xì)胞的融合。在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及3個(gè)細(xì)胞群體的融合，其中每個(gè)群體包括多個(gè)相同的細(xì)胞類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，細(xì)胞群體的融合可以在大量細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行。然后可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如通過選擇性培養(yǎng)基，諸如次黃嘌呤氨基蝶呤胸苷(HAT)培養(yǎng)基，鑒別和分離希望的雜交的細(xì)胞?；蛘?，通過鑒別特定的細(xì)胞標(biāo)記物，諸如CD標(biāo)記物，可以鑒別和分離融合的細(xì)胞。顯而易見，通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，諸如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)方法， 可以實(shí)現(xiàn)基于它們的標(biāo)記物(諸如CD標(biāo)記物)的表達(dá)以及細(xì)胞對(duì)特定細(xì)胞類型或表型的富集來分離細(xì)胞。還顯而易見，可以用編碼所需蛋白的DNA穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染本發(fā)明的細(xì)胞。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，諸如通過在用于轉(zhuǎn)染的DNA中包含選擇報(bào)道基因，可以鑒別出這些穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這樣的報(bào)道基因可以包括這樣的基因所述基因能夠使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在化合物-缺陷型培養(yǎng)基中生長，例如二氫葉酸還原酶(dhFr)基因。報(bào)道基因還可包括賦予轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的目視鑒定的基因，例如，螢光素酶基因或綠色熒光蛋白(gfp) 基因。或者，報(bào)道基因可以賦予對(duì)特定化合物(例如G418)的抗性。這樣的報(bào)道基因是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞可以用于表達(dá)單克隆抗體。傳統(tǒng)上， 已經(jīng)通過融合骨髓瘤細(xì)胞和源自免疫接種的動(dòng)物(諸如小鼠)的脾的B細(xì)胞，進(jìn)行單克隆抗體生產(chǎn)。但是，骨髓瘤細(xì)胞不穩(wěn)定性且尤其是基因組不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致所需抗體的差強(qiáng)人意的表達(dá)。另外，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞被用于生產(chǎn)雜交瘤，所以生產(chǎn)的抗體表現(xiàn)出非人翻譯后修飾。當(dāng)將抗體用作人治療劑時(shí)，具有非人翻譯后修飾的抗體可能產(chǎn)生顯著的問題。這些問題可能包括抗體的降低的效應(yīng)子功能以及免疫原性，從而導(dǎo)致令人不滿意的體內(nèi)半衰期和因此導(dǎo)致的降低的體內(nèi)功效。也有證據(jù)提示，在沒有骨髓瘤細(xì)胞存在下，不能成功地生產(chǎn)雜合體。本發(fā)明的雜交細(xì)胞令人驚訝地表明，在沒有骨髓瘤細(xì)胞存在下，可以生產(chǎn)穩(wěn)定的雜合體。此外，由本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)的抗體解決了與使用由雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體有關(guān)的問題。這些抗體表現(xiàn)出人源化的翻譯后修飾，并由表現(xiàn)出功能穩(wěn)定性的細(xì)胞表達(dá)。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過雜交下述細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞第一個(gè)細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是干細(xì)胞或源自未定型的祖細(xì)胞的細(xì)胞；源自淋巴共同祖細(xì)胞的第二個(gè)細(xì)胞；和源自淋巴共同祖細(xì)胞的第三個(gè)細(xì)胞，且其中所述第一個(gè)細(xì)胞不是骨髓瘤細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞源自T淋巴譜系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述第一個(gè)細(xì)胞是源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞。這樣，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶16、⑶15或 ⑶14。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的髓共同祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞⑶16、⑶15或⑶14。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)顯示至少一種下述CD抗原的髓共同祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞⑶16、⑶15或⑶14。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是單核細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)單核細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)單核細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是原代骨髓單核祖細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)原代骨髓單核祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)原代骨髓單核祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)選自下述的無限增殖化的細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2 個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)選自下述的無限增殖化的細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞骨髓單核祖細(xì)胞、 單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞源自脾、外周血、臍帶血或骨髓。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是前B細(xì)胞、幼B細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞前B細(xì)胞、幼B細(xì)胞、 幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞前B細(xì)胞、 幼B細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)B細(xì)胞是抗原處理過的(antigen-experienced) B-細(xì)胞或漿細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞抗原處理過的B-細(xì)胞或漿細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)抗原處理過的B-細(xì)胞或漿細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶19、 ⑶20、⑶72或⑶5。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)顯示至少一種下述CD抗原的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、 I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)選自下述的T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、 幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶3、 ⑶4、⑶5或⑶8。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞⑶3、⑶4、⑶5或 CD8。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞，所述T淋巴樣細(xì)胞選自顯示至少一種下述⑶抗原的T細(xì)胞⑶3、⑶4、CD5或⑶8。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞，所述B淋巴樣細(xì)胞中的至少一個(gè)可以是無限增殖的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)無限增殖的T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)源自淋巴組織的B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)源自淋巴組織的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞組織和I個(gè)源自淋巴組織的T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在本發(fā)明的雜交細(xì)胞中所包括的B或T淋巴樣細(xì)胞源自淋巴組織的情況下，所述淋巴組織優(yōu)選地選自外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體、腺樣體(adenoids)和局部淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的雜交細(xì)胞的制備中包含的細(xì)胞中的至少一個(gè)是人細(xì)胞。還顯而易見，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞可以包含至少一個(gè)小鼠細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是K562細(xì)胞。因此，顯而易見， 本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)K562細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)K562細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞或所述第三個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞或M0LT4 細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)WIL2-NS細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)M0LT4細(xì)胞而制備的雜交細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是M0LT4細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是原代B細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是 WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人骨髓單核祖細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代人T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS 細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是 WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是 SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代小鼠T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是 SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人或小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)所需蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)超過一種所需蛋白。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)2種所需蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)3種所需蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述所需蛋白是內(nèi)源蛋白，且在表達(dá)超過一種所需蛋白的情況下，至少一種所需蛋白是內(nèi)源蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是重組蛋白，且在表達(dá)超過一種所需蛋白的情況下，至少一種所需蛋白是重組蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白是細(xì)胞因子，例如集落刺激因子或白介素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是GM-CSF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是白介素2。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是受體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是可溶的受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是人IL-4受體α鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是IgM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是IgG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是CD54。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的雜交細(xì)胞表達(dá)超過一種所需蛋白的情況下，優(yōu)選地所需蛋白選自細(xì)胞因子、集落刺激因子、白介素或受體或其片段。在具體實(shí)施方案中，所需蛋白是免疫球蛋白，諸如IgM、且具體是可溶的人IgM ;細(xì)胞因子,例如白介素、且具體是白介素-2(IL-2)、且更具體地是人IL-2 ;和/或受體，具體是白介素受體、且更具體地是人白介素受體、且甚至更具體地是人白介素-4受體a (IL_4Ra)。技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的雜交細(xì)胞不限于表達(dá)特定所需蛋白，它們也不限于表達(dá)特定數(shù)目的蛋白。此外，技術(shù)人員顯而易見，從本發(fā)明的雜交細(xì)胞同時(shí)表達(dá)所需蛋白，可以導(dǎo)致所需蛋白表達(dá)水平的增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于制備本發(fā)明的雜交細(xì)胞的雜交是通過電方法來實(shí)現(xiàn)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制備本發(fā)明的雜交細(xì)胞的雜交是通過化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞另外與表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞雜交。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞與顯示CD25抗原的B淋巴細(xì)胞雜交。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞顯示CD25抗原，并表達(dá)免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雜交細(xì)胞與顯示CD25抗原的B淋巴細(xì)胞雜交，且得到的細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過雜交3個(gè)個(gè)別細(xì)胞，進(jìn)行所述用于制備本發(fā)明的雜交細(xì)胞的雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用3個(gè)細(xì)胞群體，進(jìn)行所述用于制備本發(fā)明的雜交細(xì)胞的雜交，其中每個(gè)所述群體包括多個(gè)相同的細(xì)胞類型或表型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述雜交細(xì)胞富含界定特定細(xì)胞類型的標(biāo)記物，以允許表達(dá)表現(xiàn)出希望的翻譯后修飾或希望的功能性的蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)蛋白的方法，所述方法包括下述步驟在根據(jù)本發(fā)明的雜交細(xì)胞中表達(dá)蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在根據(jù)本發(fā)明的雜交細(xì)胞中生產(chǎn)的蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的雜交細(xì)胞的方法，其中所述方法包括下述步驟雜交第一個(gè)細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是干細(xì)胞或源自未定型的祖細(xì)胞的細(xì)胞；源自淋巴共同祖細(xì)胞的第二個(gè)細(xì)胞；和源自淋巴共同祖細(xì)胞的第三個(gè)細(xì)胞，且其中所述第一個(gè)細(xì)胞不是骨髓瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞， 且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞源自T淋巴譜系。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述第一個(gè)細(xì)胞是源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶16、⑶15或 ⑶14。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的髓共同祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法⑶16、⑶15或⑶14。 本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)顯示至少一種下述CD抗原的髓共同祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法⑶16、⑶15或⑶14。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是單核細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)單核細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。 本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)單核細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是原代骨髓單核祖細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)原代骨髓單核祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)原代骨髓單核祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)選自下述的無限增殖化的細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或 2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)選自下述的無限增殖化的細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞源自脾、外周血、臍帶血或骨髓。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞或2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)源自脾、外周血、臍帶血或骨髓的髓共同祖細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是前B細(xì)胞、幼B細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或I個(gè)干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法前B細(xì)胞、幼B 細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法前 B細(xì)胞、幼B細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)B細(xì)胞是抗原處理過的B-細(xì)胞或楽:細(xì)胞。因此,本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法抗原處理過的B-細(xì)胞或漿細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)抗原處理過的B-細(xì)胞或漿細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶19、 ⑶20、⑶72或⑶5。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)顯示至少一種下述CD抗原的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、 I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)選自下述的T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法前T細(xì)胞、幼T 細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)選自下述的T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、 幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶3、 ⑶4、⑶5或⑶8。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)顯示至少一種下述⑶抗原的T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法⑶3、⑶4、⑶5 或CD8。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法，所述T淋巴樣細(xì)胞選自顯示至少一種下述⑶抗原的T細(xì)胞⑶3、⑶4、⑶5 或 CD8。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法，所述B淋巴樣細(xì)胞中的至少一個(gè)可以是無限增殖的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了通過雜交I 個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)無限增殖的T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞和2個(gè)源自淋巴組織的B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)源自淋巴組織的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。因此，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞組織和I個(gè)源自淋巴組織的T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在生產(chǎn)本發(fā)明的雜交細(xì)胞的方法中所包括的B或T淋巴樣細(xì)胞源自淋巴組織的情況下，所述淋巴組織優(yōu)選地選自外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體、腺樣體和局部淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在生產(chǎn)本發(fā)明的雜交細(xì)胞的方法中包含的細(xì)胞中的至少一個(gè)是人細(xì)胞。還顯而易見，在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)本發(fā)明的雜交細(xì)胞的方法可以包含至少一個(gè)小鼠細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是K562細(xì)胞。因此，顯而易見， 本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)K562細(xì)胞和2個(gè)B淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)K562細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)細(xì)胞或所述第三個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞或M0LT4 細(xì)胞。因此，顯而易見，本發(fā)明提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)WIL2-NS細(xì)胞和I個(gè)T淋巴樣細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過雜交I個(gè)髓共同祖細(xì)胞或干細(xì)胞、I個(gè)B淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)M0LT4細(xì)胞來生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是M0LT4細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是原代B細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人骨髓單核祖細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代人T細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代小鼠T細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人或小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。定義在本發(fā)明的上下文中，詞語“包含”、“包括”等應(yīng)當(dāng)解釋為它們的包括含義(而不是它們的排除含義)，也就是“包括、但不限于”的含義。雜交細(xì)胞
雜交細(xì)胞是包含來自超過一個(gè)基因組的組分的細(xì)胞(除了合子和它們的衍生物以外)。它是從例如2個(gè)或更多個(gè)生物細(xì)胞(親本細(xì)胞)的體細(xì)胞雜交(或全細(xì)胞雜交) 構(gòu)建出的細(xì)胞。所述親本細(xì)胞可以從相同的譜系(或物種)或不同的譜系(或物種)得到。 從相同的譜系和物種產(chǎn)生的雜交細(xì)胞被稱作同源雜合體(auto-hybrid)，從不同的譜系產(chǎn)生的雜交細(xì)胞被稱作異源雜合體(hetero-hybrid)。嵌合細(xì)胞嵌合細(xì)胞是使用源自2個(gè)或更多個(gè)不同物種的基因組人工生產(chǎn)的雜交細(xì)胞?？缱V系雜交細(xì)胞跨譜系雜交細(xì)胞是使用源自2個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的基因組人工生產(chǎn)的雜交細(xì)胞，所述細(xì)胞源自不同的細(xì)胞譜系。造血細(xì)胞被分成2個(gè)主要譜系淋巴樣(T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK 細(xì)胞)和髓樣(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突細(xì)胞)。三雜交細(xì)胞三雜交細(xì)胞是使用源自3個(gè)細(xì)胞的基因組人工生產(chǎn)的雜交細(xì)胞。穩(wěn)定的當(dāng)提及細(xì)胞時(shí)，術(shù)語“穩(wěn)定的”表示細(xì)胞的表現(xiàn)出下述一致性的能力給定生長或生產(chǎn)率參數(shù)的一致性，或細(xì)胞系的產(chǎn)物特征隨著世代數(shù)的漸增的一致性。當(dāng)關(guān)于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子使用時(shí)，它表示在相對(duì)恒定的水平基本上無限地表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系。體細(xì)胞雜交在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語“體細(xì)胞雜交”表示以下述方式從2個(gè)或更多個(gè)二倍體 (非配子)細(xì)胞(親本細(xì)胞)產(chǎn)生一個(gè)單獨(dú)的活細(xì)胞的過程誘導(dǎo)所述細(xì)胞的質(zhì)膜處于良好接觸，同時(shí)誘導(dǎo)親本細(xì)胞的質(zhì)膜在接觸點(diǎn)處可逆地分解，并使每個(gè)親本細(xì)胞的實(shí)體或細(xì)胞器組合在新形成的單個(gè)細(xì)胞的包膜內(nèi)。新形成的單個(gè)細(xì)胞被稱作雜交的細(xì)胞或雜交細(xì)胞。干細(xì)胞術(shù)語“干細(xì)胞”表示非特化的細(xì)胞，其具有通過有絲分裂進(jìn)行分裂和發(fā)育成多種不同細(xì)胞類型的能力。干細(xì)胞可以包括胚胎干細(xì)胞、源自臍帶的“成體”干細(xì)胞或源自成體的干細(xì)胞。干細(xì)胞包括具有分化成所有細(xì)胞類型的非限制能力的細(xì)胞，即全能細(xì)胞。干細(xì)胞還可以包括它們的分化成特化細(xì)胞的能力受限制的細(xì)胞，例如多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、多能干細(xì)胞(multipotent stem cell)、寡能干細(xì)胞(oligopotent stem cell)或單能干細(xì)胞(unipotent stem cell)。無限增殖化的細(xì)胞術(shù)語“無限增殖化的細(xì)胞”表示具有無限生長的能力的細(xì)胞。顯而易見，無限增殖化的細(xì)胞可以源自體內(nèi)惡性腫瘤或胚胎?；蛘?，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)無限生長能力的操作， 可以衍生出無限增殖化的細(xì)胞。這些操作可以包括，例如，體外轉(zhuǎn)化過程，例如導(dǎo)入病毒基因諸如EB病毒(EBV)、猿猴病毒40 (SV40) T抗原、腺病毒ElA和ElB和人乳頭瘤病毒(HPV) E6和E7?；蛘撸ㄟ^表達(dá)端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白(TERT)或其它方法，可以從細(xì)胞衍生出無限增殖化的細(xì)胞。也可以從已經(jīng)修飾了癌基因表達(dá)的細(xì)胞衍生出無限增殖化的細(xì)胞。無限增殖化的細(xì)胞可以源自誘導(dǎo)無限生長能力的任意操作，包括、但不限于紫外線暴露或自發(fā)轉(zhuǎn)化(其中無限增殖的機(jī)理不明)
骨髓瘤細(xì)胞術(shù)語“骨髓瘤細(xì)胞”表示漿細(xì)胞的惡性腫瘤。雜交瘤術(shù)語“雜交瘤”表示通過雜交骨髓瘤細(xì)胞和源自免疫接種的動(dòng)物的脾的B-細(xì)胞而生成的細(xì)胞。雜交瘤是具有生產(chǎn)單克隆抗體的能力的無限增殖化的細(xì)胞。未定型的祖細(xì)胞術(shù)語“未定型的祖細(xì)胞”表示干細(xì)胞的早期后代，其僅可以分化成有限種類的細(xì)胞，而不定向于任何特定譜系，但是它不再可以更新自身。髓共同祖細(xì)胞髓共同祖細(xì)胞是這樣的造血干細(xì)胞的后代所述造血干細(xì)胞限于髓譜系，且能夠產(chǎn)生巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞或粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，但不產(chǎn)生淋巴樣細(xì)胞。淋巴共同祖細(xì)胞淋巴共同祖細(xì)胞是這樣的造血干細(xì)胞的后代所述造血干細(xì)胞限于淋巴譜系，且產(chǎn)生B細(xì)胞、T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞，但不產(chǎn)生髓樣細(xì)胞。B淋巴譜系-衍生的細(xì)胞B淋巴譜系-衍生的細(xì)胞是源自淋巴共同祖細(xì)胞(在它的B譜系定型為變成任意類型的B細(xì)胞以后)的任何細(xì)胞。T淋巴譜系-衍生的細(xì)胞T淋巴譜系-衍生的細(xì)胞是源自淋巴共同祖細(xì)胞(在它的T譜系定型為變成任意類型的T細(xì)胞以后)的任何細(xì)胞。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞是這樣的祖細(xì)胞其源自髓共同祖細(xì)胞，且定型為粒細(xì)胞和單核細(xì)胞譜系，但是沒有定型為巨核細(xì)胞譜系和紅細(xì)胞譜系。巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞是這樣的祖細(xì)胞其源自髓共同祖細(xì)胞，且定型為巨核細(xì)胞譜系和紅細(xì)胞譜系，但是沒有定型為粒細(xì)胞和單核細(xì)胞譜系。前B細(xì)胞前B細(xì)胞是這樣的發(fā)育中的B細(xì)胞其處于膜結(jié)合的IgM的重鏈與替代輕鏈一起表達(dá)時(shí)的階段。幼B細(xì)胞幼B細(xì)胞表示骨髓內(nèi)的發(fā)育中的B細(xì)胞，其中在抗體的重組階段，基因座VJ重排在L鏈上，且VDJ重排在H鏈上，表現(xiàn)出IgM受體表達(dá)。幼稚B細(xì)胞幼稚B細(xì)胞是這樣的成熟的B細(xì)胞其通過它的表面免疫球蛋白的隨機(jī)基因重排， 已經(jīng)在骨髓中分化和成熟，但是尚未遇到周圍的關(guān)連抗原?；罨腂細(xì)胞一類成熟的B細(xì)胞，其已經(jīng)通過抗原識(shí)別(經(jīng)由BCR)遇到在周圍的它的關(guān)連抗原，從而導(dǎo)致克隆增殖和以T-依賴性的或非依賴性的方式終末分化成漿細(xì)胞的組合。效應(yīng)B細(xì)胞
效應(yīng)B細(xì)胞經(jīng)常與分泌抗體的漿細(xì)胞同義，后者是一類短壽B細(xì)胞，其分泌對(duì)特定抗原特異性的抗體以及過多的細(xì)胞因子，以吸引免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞。記憶B細(xì)胞記憶B細(xì)胞是從活化的B細(xì)胞形成的長壽B細(xì)胞，其對(duì)在初次免疫應(yīng)答過程中遇到的抗原是特異性的，且能夠在第二次暴露于相同抗原以后快速應(yīng)答。漿細(xì)胞漿細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的終末的有絲分裂后的、短壽細(xì)胞，其在CD4+淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)刺激時(shí)從B細(xì)胞分化，并分泌大量抗體。前T細(xì)胞前T細(xì)胞是這樣的發(fā)育中的T細(xì)胞其處于VbDbJb是完整的且TCRii鏈在雙陰性的(⑶4TD8_)T細(xì)胞(⑶3+)中表達(dá)時(shí)的階段。幼T細(xì)胞幼T細(xì)胞是這樣的發(fā)育中的T細(xì)胞其已經(jīng)從骨髓遷移至胸腺，但是尚未完成它的 TCR的重排，或針對(duì)它的TCR對(duì)在自身主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子背景下呈遞的自身肽的結(jié)合能力的選擇，或定型為T殺傷譜系或T輔助譜系，它們與細(xì)胞分別對(duì)MHC I類或 II類分子的TCR特異性精確地關(guān)聯(lián)。通過共同受體分子CD8或CD4之一的表達(dá)的喪失，在表型上標(biāo)記譜系定型。幼稚T細(xì)胞一種成熟的T細(xì)胞，其已經(jīng)在骨髓中分化，并成功地經(jīng)歷了胸腺中的中心選擇的正過程和負(fù)過程(重排它的TCR，并喪失共同受體分子之一)，但是尚未遇到在周圍的關(guān)連抗原?；罨腡細(xì)胞活化的T細(xì)胞是這樣的T細(xì)胞其通過在抗原呈遞細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體肽(肽MHC復(fù)合物)和B7家族成員分別對(duì)細(xì)胞表面上的TCR和CD28的銜接，開始變成抗原-特異性的效應(yīng)T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞效應(yīng)T細(xì)胞是一類短壽T淋巴細(xì)胞，其在接觸攜帶對(duì)于所述細(xì)胞而言適當(dāng)?shù)碾腗HC復(fù)合物的細(xì)胞時(shí)，能夠立即做出應(yīng)答。


圖I.鑒別和分選-純化的⑶71+K562細(xì)胞。圖2. CD15和CD71陽性的K562細(xì)胞的FACS概況；(a)原始的CD71-富集的K562 細(xì)胞群體中大約18%是⑶15陽性的(Rl區(qū)域)，和(b)在培養(yǎng)2個(gè)月以后⑶15陽性的K562 細(xì)胞的重新分析。圖3.⑶15在⑶34+AML單核的細(xì)胞上的表達(dá)。圖4.⑶16的FACS概況和通過⑶14磁珠(MACS)分離的不同⑶14+細(xì)胞群體的分選門。圖5.用小鼠抗-人⑶19和小鼠抗-人⑶5抗體染色的臍帶血單核的細(xì)胞的FACS 概況。
圖6.用小鼠抗-人⑶3和小鼠抗-人⑶5抗體染色的單核的臍帶血細(xì)胞的FACS 概況。圖7.用小鼠抗-人⑶20和小鼠抗-人⑶72抗體染色的骨髓單核的細(xì)胞的FACS 概況。圖8.扁桃體單核的細(xì)胞的⑶3和⑶54的典型FACS概況。圖9. IgM和IgG陽性的培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的鑒別；(A)在培養(yǎng)5天以后，18%的⑶19+ 細(xì)胞是IgM陽性的，且I %在細(xì)胞表面上具有可檢測(cè)的IgG ； (B)在培養(yǎng)10天以后，IgM陽性的淋巴細(xì)胞的百分比降低至2%，且IgG陽性的細(xì)胞的百分比增加至15%。圖10.在具有髓樣和淋巴樣來源的癌基因的KMW三雜交細(xì)胞上的⑶表達(dá)的FACS 概況。圖11.⑶4和⑶19在原代混合的脾淋巴細(xì)胞、分選的⑶4和⑶19群體以及得到的 KBT三雜交細(xì)胞系上的表達(dá)；(a)⑶4和⑶19在原代脾淋巴細(xì)胞上的表達(dá)；(b)分選的⑶19+ 細(xì)胞的純度概況(98. 1% ) ; (c)分選的CD4.細(xì)胞的純度概況(96. 8% ) ； (d)CD19和CD4在三雜交細(xì)胞上的共表達(dá)。三雜交細(xì)胞群體中超過99%共表達(dá)B和T細(xì)胞的標(biāo)記物。圖12.⑶19、⑶3和⑶5在KBT三雜交體上的表達(dá)，所述KBT三雜交體源自I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞和2個(gè)原代抗原處理過的淋巴樣細(xì)胞；(a) CD 19和CD5在KBT三雜交細(xì)胞表面上的表達(dá)；(b)⑶3和⑶5在KBT三雜交體上的表達(dá)。圖13.⑶4、⑶8、⑶72和⑶20在KBT三雜交細(xì)胞表面上的表達(dá)，所述KBT三雜交細(xì)胞源自I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞和2個(gè)原代淋巴樣細(xì)胞，所述淋巴樣細(xì)胞源自骨髓和胸腺；
(a)⑶4和⑶8的表達(dá)，(b)⑶4和⑶72的表達(dá)，(c)⑶20和⑶8的表達(dá)。圖14.在WTM三雜交體系上的⑶表達(dá)的FACS概況，所述WTM三雜交體系具有淋巴樣來源的癌基因和來自原代細(xì)胞的CD4和CD14 ； (a) CD19和CD4在三雜交細(xì)胞上的共表達(dá)， 表現(xiàn)出一群具有高⑶4表達(dá)水平的⑶19細(xì)胞(⑶19⑶4h)和另一群具有低⑶4表達(dá)水平的 ⑶19細(xì)胞(⑶19⑶妁；(b)⑶4和⑶14在相同的⑶19陽性的三雜交體群體上的共表達(dá)，表現(xiàn)出基于高或低⑶14表達(dá)的進(jìn)一步的細(xì)胞群體異質(zhì)性(⑶4%0141 KD4hCD14h ;ra4tD14H)。圖15.在WTM三雜交細(xì)胞上的⑶表達(dá)的典型FACS概況，所述WTM三雜交細(xì)胞具有淋巴樣來源WIL2-NS的癌基因、源自抗原處理過的T細(xì)胞的CD5和源自原代單核細(xì)胞的 CD14。圖16.在WTM三雜交細(xì)胞上的⑶表達(dá)的FACS概況，所述WTM三雜交細(xì)胞具有淋巴樣來源WIL2-NS的癌基因、源自細(xì)胞毒性T細(xì)胞的CD8和源自原代單核細(xì)胞的CD14。圖17.在WTM三雜交體上的⑶4和⑶8共表達(dá)的FACS概況，所述WTM三雜交體源自雙CD陽性的T細(xì)胞。圖18.源自骨髓單核祖細(xì)胞的WTM三雜交細(xì)胞的表面上的⑶表達(dá)；(A)使用⑶19、 CD4和CD15的三色染色，和(B)使用源自骨髓單核祖細(xì)胞的CD34和CD15和源自效應(yīng)T細(xì)胞的CD4的三色染色。圖19.源自⑶4+效應(yīng)T細(xì)胞的KWT三雜交細(xì)胞的譜系特異性的標(biāo)記物的表達(dá)。圖20.源自雙陽性的⑶4+⑶8+T細(xì)胞的KWT三雜交細(xì)胞的譜系特異性的標(biāo)記物的表達(dá)。圖21.源自⑶5+抗原處理過的T細(xì)胞的KWT三雜交細(xì)胞的譜系特異性的標(biāo)記物的表達(dá)。圖22. WWM三雜交細(xì)胞的典型⑶表達(dá)概況，所述WWM三雜交細(xì)胞源自2個(gè)各自含有淋巴樣癌基因的細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞；(a)⑶19和⑶14在三雜交細(xì)胞上的共表達(dá)(Rl 區(qū)域)，顯示了不表達(dá)⑶14的⑶19陽性細(xì)胞的獨(dú)特群體(R2區(qū)域)；(b)三雜交細(xì)胞上的 CD14表達(dá)，所述三雜交細(xì)胞源自Rl區(qū)域中的分選的細(xì)胞，并在培養(yǎng)中增殖2個(gè)月；(c)三雜交細(xì)胞上缺乏表面CD14，所述三雜交細(xì)胞源自2個(gè)月以后的R2區(qū)域中的分選的群體。圖23.從WWM三雜交細(xì)胞的不同亞群得到的⑶14的代表性的RT-PCR。圖24. K562細(xì)胞的單個(gè)克隆的核型分析。結(jié)果表明，K562細(xì)胞系是三倍體，具有 69個(gè)染色體模式數(shù)。檢測(cè)到下述染色體異常缺少I個(gè)X染色體；染色體2的長臂的臂內(nèi)倒位，其涉及帶q33和q35 ;缺少染色體3、額外的衍生染色體5,所述衍生染色體5用未知起源的額外染色體材料替代來自qll. 2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21. 2和p23之間的區(qū)段的重復(fù)；額外的染色體7，其具有染色體7的短臂的臂內(nèi)倒位，其涉及帶pl3和p22 ;缺少 I個(gè)染色體9 ;染色體9的短臂從帶pl3的末端缺失；由易位產(chǎn)生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個(gè)染色體9的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少染色體13 ;在一個(gè)染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少染色體14 ;未知起源的額外材料，其替代在2個(gè)染色體17上來自pl3的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體I和18的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體22 ；5個(gè)額外的不同的標(biāo)記物染色體。圖25. WIL2NS細(xì)胞系的5個(gè)克隆之一的核型分析。在該克隆(克隆I)中，檢測(cè)到下述異常由易位產(chǎn)生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體I和8的區(qū)段；染色體13 的額外同源物；由易位產(chǎn)生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；染色體17的來自q22_q23的區(qū)段的重復(fù)。圖26. KBT-I (⑶19+)&(⑶4+)三雜交體系的核型分析，顯示了接近三倍體的單個(gè)細(xì)胞克隆。由于隨機(jī)喪失，染色體計(jì)數(shù)在65-66之間變化，但是具有66的染色體模式數(shù)。檢測(cè)到下述的染色體異常由復(fù)雜易位形成的衍生物X，所述復(fù)雜易位涉及X染色體的短臂，并可能涉及2個(gè)其它的未鑒別的染色體；缺少I個(gè)X染色體；染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位, 其涉及帶q33和q35 ;缺少染色體3 ;缺失染色體3p ;衍生染色體4，其涉及染色體4和另一個(gè)未鑒別的染色體的區(qū)段；額外的衍生染色體5，其用未知起源的額外染色體材料替代來自qll. 2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21. 2和p23之間的區(qū)段的重復(fù)；額外的衍生染色體 7，其涉及染色體7的長臂和標(biāo)記物3的長臂；缺少I個(gè)染色體13 ;在一個(gè)染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少I個(gè)染色體14 ;缺少I個(gè)染色體15 ;未知起源的額外材料替代2個(gè)染色體17上來自pl3的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體I和18的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；缺少染色體22 ；4個(gè)額外的不同的標(biāo)記物染色體。圖27. KBT (K562&CD20+CD72+&CD4+CD8+ 細(xì)胞)跨譜系三雜交體(或 KBT-2 跨譜系) 的核型，顯示了 4個(gè)接近三倍體的克隆，(A)克隆I具有67的染色體模式數(shù)和下述的染色體異常由復(fù)雜易位形成的衍生物X，所述復(fù)雜易位涉及X染色體的短臂，并可能涉及2個(gè)其它的未鑒別的染色體；缺少I個(gè)X染色體；衍生染色體1，其包含來自染色體I的區(qū)段和最可能來自染色體4的區(qū)段；染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位，其涉及帶q33和q35 ;缺少I個(gè)染色體3 ;最可能地，缺失的染色體4可能是小衍生染色體4 ;額外的衍生染色體5，其用未知起源的額外染色體材料替代來自qll. 2的區(qū)段；染色體6的短臂在帶p21. 2和p23之間的區(qū)段的重復(fù)；額外的衍生染色體7，其涉及染色體7的長臂和標(biāo)記物3的長臂；缺少I個(gè)染色體9 ;染色體9的短臂從帶pl3的末端缺失；由易位產(chǎn)生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個(gè)染色體9的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的衍生染色體10，所述易位涉及來自染色體3和 10的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體13 ;在一個(gè)染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料； 缺少I個(gè)染色體14 ;未知起源的額外材料替代2個(gè)染色體17上來自P13的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體I和18的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體22 ；4個(gè)額外的不同的標(biāo)記物染色體，(B)由于隨機(jī)喪失，克隆2含有65-67個(gè)染色體(染色體模式數(shù)是 67)，且具有與克隆I類似的染色體特征，例外是，克隆I的缺失的染色體4被確定的衍生染色體4置換，后者涉及染色體4和另一個(gè)未鑒別的染色體的區(qū)段，(C)克隆3與克隆I基本上相同，但是缺少衍生染色體1，且存在源自染色體I和4的區(qū)段的不同衍生染色體4。由于隨機(jī)喪失，它含有67-68個(gè)染色體，模式數(shù)為67，(D)克隆4與克隆I基本上相同，但是缺少衍生染色體1，且存在由易位產(chǎn)生的不同衍生染色體1，所述易位涉及染色體I和4的區(qū)段。 僅存在2個(gè)正常染色體5’ s和一個(gè)衍生染色體5，后者似乎是隨體化的(satellited) 5q。圖28. KffT-I三雜交體系(源自無限增殖的髓樣細(xì)胞和B淋巴樣細(xì)胞和原代成熟的CD4+T輔助細(xì)胞的KWT三雜交體)的核型分析，顯示了接近六倍體的單個(gè)克隆，其具有 129-140染色體的模式數(shù)和下述的染色體異常缺少2個(gè)X染色體；缺少I個(gè)染色體I ;缺少I個(gè)染色體2 ;染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位,其涉及帶q33和q35 ;缺少2個(gè)染色體3 ； 缺少I個(gè)染色體4 ;衍生染色體4，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q35的區(qū)段；一個(gè)額外的染色體5同源物；染色體5的2個(gè)額外的衍生物，其用未知起源的額外染色體材料替代來自qll. 2的區(qū)段；一個(gè)額外的染色體6同源物；額外的染色體6，其具有染色體6的短臂在帶P21. 2和p23之間的區(qū)段的重復(fù)；一個(gè)額外的染色體7同源物；2個(gè)染色體7，它們具有染色體7的短臂的臂內(nèi)倒位，其涉及帶pl3和p22 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體I和8的區(qū)段；缺少2個(gè)染色體9 ;染色體9的短臂從帶pl3的末端缺失；2個(gè)由易位產(chǎn)生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個(gè)染色體9的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體12 ;—個(gè)染色體13，其具有在一個(gè)染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少2個(gè)染色體 14 ;由易位產(chǎn)生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體15 ;缺少I個(gè)染色體17 ；2個(gè)染色體17，其用未知起源的額外材料替代來自2個(gè)染色體17上的pl3的區(qū)段；2個(gè)染色體17，其具有來自q22_q23的區(qū)段的重復(fù)；缺少2個(gè)染色體18 ;額外的染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體22 ；7個(gè)額外的標(biāo)記物染色體，它們具有標(biāo)記物染色體2的2個(gè)拷貝。圖29. KWT-2 (源自無限增殖的髓樣細(xì)胞和B淋巴樣細(xì)胞和原代記憶⑶3+⑶5+T細(xì)胞的KWT三雜交體系)的核型分析，顯示了接近六倍體的單個(gè)克隆，其具有135-142染色體的模式數(shù)和下述的染色體異常缺少2個(gè)X染色體；缺少I個(gè)染色體I ;缺少I個(gè)染色體2 ； 染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位，其涉及帶q33和q35 ;缺少2個(gè)染色體3 ;缺少I個(gè)染色體4 ；衍生染色體4，其用未知起源的額外染色體材料替代來自q35的區(qū)段；一個(gè)額外的染色體5 的同源物；染色體5的2個(gè)額外的衍生物，其用未知起源的額外染色體材料替代來自qll. 2 的區(qū)段；一個(gè)額外的染色體6的同源物；額外的染色體6，其具有染色體6的短臂在帶p21. 2 和P23之間的區(qū)段的重復(fù)；2個(gè)染色體7，它們具有染色體7的短臂的臂內(nèi)倒位，其涉及帶 pl3和p22 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體I和8的區(qū)段；缺少2個(gè)染色體9 ;染色體9的短臂從帶pl3的末端缺失；2個(gè)由易位產(chǎn)生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個(gè)染色體9的區(qū)段；由易位產(chǎn)生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體12 ;—個(gè)染色體13，其具有在一個(gè)染色體13的短臂上的未知起源的額外染色體材料；缺少2個(gè)染色體14 ;由易位產(chǎn)生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體15 ;缺少I個(gè)染色體17 ；2個(gè)染色體17，它們用未知起源的額外材料替代在2個(gè)染色體17上的來自pl3的區(qū)段；2個(gè)染色體 17，其具有來自q22_q23的區(qū)段的重復(fù)；缺少2個(gè)染色體18 ;額外的染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；缺少I個(gè)染色體22 ；8個(gè)額外的標(biāo)記物染色體，它們具有標(biāo)記物染色體2的2個(gè)拷貝。圖30. KWT-3三雜交體系(源自無限增殖的髓樣細(xì)胞和B淋巴樣細(xì)胞和原代雙陽性的CD4+CD8+T細(xì)胞的KWT三雜交體)的核型分析，顯示了 3個(gè)克隆，它們是染色體模式數(shù)為124-139的超五倍體(hyperpentaploid)。(A)克隆I具有下述的染色體異常3個(gè)X染色體和單個(gè)Y染色體；額外的染色體I ;2個(gè)額外的染色體2 ;染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位，其涉及帶q33和q35 ;缺少I個(gè)染色體3 ;額外的由易位產(chǎn)生的染色體5衍生物，所述易位涉及染色體5和未知起源的染色體；額外的染色體6 ;染色體6的短臂在帶p21. 2和p23 之間的區(qū)段的重復(fù)；染色體7的短臂的額外的臂內(nèi)倒位，其涉及帶pl3和p22 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體8，所述易位涉及來自染色體I和8的區(qū)段；染色體9的短臂從帶pl3的末端缺失；由易位產(chǎn)生的衍生染色體9，所述易位涉及來自2個(gè)染色體9的區(qū)段；2個(gè)額外的染色體10 ;2個(gè)由易位產(chǎn)生的染色體10的衍生物，所述易位涉及來自染色體3和10的區(qū)段； 2個(gè)額外的染色體13 ;在一個(gè)染色體13的短臂上的額外的未知起源的染色體材料；缺少I 個(gè)染色體14 ;由易位產(chǎn)生的染色體14的衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段； 額外的未知起源的材料，其替換來自3個(gè)染色體17上的pl3的區(qū)段；來自q22_q23的區(qū)段中的染色體17的2個(gè)染色體重復(fù)；額外的染色體18 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體18，所述易位涉及來自染色體I和18的區(qū)段；額外的染色體19 ;缺少I個(gè)染色體20 ;由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及染色體I和21的區(qū)段；5個(gè)額外的標(biāo)記物染色體，它們具有每個(gè)標(biāo)記物染色體4和5的2個(gè)拷貝。(B)克隆2具有與克隆I類似的染色體異常，但是它喪失一個(gè)染色體9。(C)克隆3含有與克隆2相同的染色體異常，但是染色體2的長臂中的臂內(nèi)倒位被替換為等臂衍生(isoderivative)染色體2，后者因涉及衍生染色體2的等臂染色體的形成而產(chǎn)生，所述衍生染色體2由長臂中的臂內(nèi)倒位產(chǎn)生，其涉及帶q33和q35。圖31. WWM三雜交體(A)和它的⑶14富集的亞系⑶的核型分析，顯示了單個(gè)優(yōu)勢(shì)克隆，這將它的存在從在原始的WWM三雜交體中的55%增加至在它的CD14富集的亞系中的 95%。每個(gè)具有47染色體的模式數(shù)和下述的染色體異常由易位產(chǎn)生的染色體8衍生物， 所述易位涉及來自染色體I和8的區(qū)段；額外的染色體13同源物；由易位產(chǎn)生的染色體14 衍生物，所述易位涉及來自染色體5和14的區(qū)段；染色體17的來自q22_23的區(qū)段的重復(fù)；由易位產(chǎn)生的衍生染色體21，所述易位涉及來自染色體3和21的區(qū)段。原始的WWM三雜交體和它的CD14+富集的亞系之間的唯一差別在于，這些異常存在于僅55%的原始WWM細(xì)胞中和95%的CD14富集的亞系細(xì)胞中。WWM三雜交體中的剩余細(xì)胞是從接近三倍體(具有隨機(jī)的染色體喪失)至接近四倍體(具有隨機(jī)的染色體喪失)。 圖32.來自PioGM培養(yǎng)物的上清液的蛋白印跡。給泳道I和2分別裝載未活化的和活化的4天人T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。泳道4和5分別含有在沒有或有衣霉素存在下培養(yǎng)的ProGM培養(yǎng)物的上清液。在泳道3中使用非表達(dá)-GM-CSF的細(xì)胞的上清液。作為參照，在泳道6中使用源自大腸桿菌(E. coli)的重組hGM-CSF(IOng)。圖33.由ProGM雜交體系生產(chǎn)的人GM-CSF的凝膠電泳。從在有(泳道3和4)和沒有(泳道I和2)衣霉素存在下培養(yǎng)的樣品得到ProGM雜交體系的細(xì)胞上清液，對(duì)其進(jìn)行使用大鼠抗-人GM-CSF抗體(泳道I和3)和大鼠抗-小鼠GM-CSF抗體(泳道2和4)的免疫沉淀。通過銀染色，使蛋白顯影。圖34. CD4和CD54在ProCD54細(xì)胞系和它的CD54富集的亞系ProCD54EX的表面上的表達(dá)；(a) 100%的Pro⑶54細(xì)胞保持⑶4的表達(dá)。細(xì)胞群體中的大約72%也是⑶54陽性的，表達(dá)水平從低至高。門控和分選出42%的具有CD4+CD54+表型特征的細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體的⑶54表達(dá)水平從中等至高；(b)⑶4和⑶54在原始Pro⑶54的分選的⑶4+⑶54+ 亞系的表面上的表達(dá)分析表明，在培養(yǎng)超過6個(gè)月以后，98%的細(xì)胞仍然是兩種標(biāo)記物陽性的。圖35.由ProCD54和ProCD54EX細(xì)胞分泌的可溶的人CD54的蛋白印跡。使用KWT 三雜交體配偶體細(xì)胞系的細(xì)胞作為對(duì)照。Pro⑶54和Pro⑶54EX細(xì)胞脫落大約82kDa的可溶形式的⑶54。圖36. ProCD54 和 ProCd54EX 細(xì)胞中 ICAM-I 基因表達(dá)的 RT-PCR 分析。圖37.在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)，來自用hIL4_Ra鏈瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的KBT三雜交細(xì)胞系的細(xì)胞提取物的蛋白印跡分析。用100ng/ml hIL4刺激的人PBML和未轉(zhuǎn)染的KBT細(xì)胞分別用作hIL4-Ra鏈的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。圖38.用于檢測(cè)被hIL-2轉(zhuǎn)染的KBT三雜交細(xì)胞中的hIL_2mRNA的PCR輸出。表達(dá)水平類似于來自CD8+人T淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的那些。未轉(zhuǎn)染的KBT細(xì)胞和K562細(xì)胞用作陰性對(duì)照。圖39. (a)原始的KBT三雜交細(xì)胞和(b)KBT TR-IL2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)hIL_2的FACS 分析。大約41%的KBT細(xì)胞是⑶69活化分子陽性的。92%的KBT TR-IL2細(xì)胞是細(xì)胞內(nèi) hIL-2 (R1+R2)染色陽性的。hIL-2陰性的細(xì)胞是⑶69陽性群體的一部分，而⑶69陰性的細(xì)胞都是細(xì)胞內(nèi)hIL2陽性的。圖40.在hGM-CSF親和吸收以后，進(jìn)行RP-HPLC得到的洗脫圖。圖41.在hGM-CSF親和免疫吸收以后，進(jìn)行RP-HPLC所收集的級(jí)分的SDS-PAGE(下圖)和蛋白印跡(上圖)。蛋白印跡揭示級(jí)分之間由Pro-GM-SF分泌的hGM-CSF的分子量概況的變化。在24-28分鐘洗脫的級(jí)分對(duì)應(yīng)著RP-HPLC洗脫圖上的第一個(gè)峰，在29-31分鐘之間收集的級(jí)分代表第二個(gè)峰，而第三個(gè)峰落進(jìn)在34-36分鐘之間收集的級(jí)分。圖42.從PHA活化的人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物分離⑶4+細(xì)胞(A)從剩余的細(xì)胞群體門控(Rl)和分選用抗人CD4-FITC標(biāo)記的細(xì)胞。進(jìn)一步分析分選的細(xì)胞的純度；(B)分選的群體中100%的細(xì)胞是⑶4陽性的。圖43.源自Pro-GMsf的去糖基化的hGM-CSF的凝膠電泳。將純化的hGM-CSF暴露于PHGase F消化不同的時(shí)間段。溫育時(shí)間是泳道1-Omin， 泳道2-10min，泳道3_20min，泳道4_40min。泳道5-源自大腸桿菌的重組人GM-CSF。通過銀染色，使蛋白顯影。指示了分子量標(biāo)記物。圖44.小鼠骨髓瘤Sp2細(xì)胞系的TfR+細(xì)胞的鑒別和分選。圖45.來自用抗-小鼠CD4和CD8染色的(a)外周血和(b)脾的小鼠單核的細(xì)胞的FACS概況。門控的區(qū)域Rl和R3代表單個(gè)陽性的效應(yīng)輔助(CD4+CD8_) T細(xì)胞和細(xì)胞毒性 (CD8+CD4_) T細(xì)胞，而R2含有雙陽性的(CD4+CD8+) T細(xì)胞。圖46.通過磁珠負(fù)選擇從外周血分離出的小鼠單核細(xì)胞的純度概況。100%的分離的細(xì)胞是CDllb陽性的，且同時(shí)，這些細(xì)胞中超過98%是B220、⑶90、⑶49b和NKl. I陰性的。大約38%的⑶Ilb+細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)低水平的Ly5G。圖47.⑶138、⑶4和Cdllb在STmMm三雜交體上的表達(dá)的FACS概況，所述STmMm三雜交體源自I個(gè)Sp2的淋巴樣無限增殖細(xì)胞、原代小鼠⑶4+T細(xì)胞和⑶Ilb+單核細(xì)胞。通過 ⑶138在100%的三雜交細(xì)胞上的表達(dá)(a)和(b)，證實(shí)B淋巴譜系的表型。細(xì)胞群體中至少82%表達(dá)所有3個(gè)⑶標(biāo)記物，僅5%的細(xì)胞是⑶138陽性的，而不共表達(dá)⑶4或⑶lib。圖48.⑶138、⑶8和⑶Ilb在STmMm三雜交體上的表達(dá)的典型FACS概況，所述 STmMm三雜交體源自I個(gè)Sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細(xì)胞、原代小鼠細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和小鼠⑶IIb+單核細(xì)胞。盡管在97-100%的三雜交細(xì)胞上證實(shí)了小鼠⑶138的表達(dá)(a)和
(b)，分別在三雜交細(xì)胞群體中的56%和57%上檢測(cè)到T細(xì)胞和單核細(xì)胞標(biāo)記物的共表達(dá)。 整個(gè)三雜交體群體中的大約40%共表達(dá)所有3個(gè)標(biāo)記物(c)，且僅14%在它們的表面上既不表達(dá)⑶8也不表達(dá)⑶I lb。圖49.⑶138、⑶8和⑶Ilb在STmMm三雜交體上的表達(dá)的典型FACS概況，所述 STmMm三雜交體源自I個(gè)Sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細(xì)胞、I個(gè)原代小鼠雙陽性的CD4+CD8+T 細(xì)胞和I個(gè)原代小鼠⑶Ilb+單核細(xì)胞。三雜交細(xì)胞群體中的98-100%是⑶138陽性的， 群體中的93%也是⑶8陽性的(b)。整個(gè)細(xì)胞群體中的大約57-60%同時(shí)是⑶138、⑶8和 CDllb陽性的。圖50. CD4和CD8在STmMm三雜交體表面上的表達(dá)的典型概況，所述STmMm三雜交體源自I個(gè)Sp2的小鼠淋巴樣無限增殖細(xì)胞、I個(gè)原代小鼠雙陽性的⑶4+⑶8+T細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞。盡管95%的細(xì)胞是CD8陽性的，但三雜交體群體中的僅50%共表達(dá)CD4和 ⑶8。值得注意的是，實(shí)際上整個(gè)⑶4+群體也是⑶8陽性的。圖51.⑶138和⑶Ilb在SSMm三雜交體表面上的表達(dá)的典型概況，其中三雜交體群體中的93%顯示出⑶138陽性染色，70%的細(xì)胞共表達(dá)⑶lib。圖52.人⑶71和小鼠TfR在SWMm(a)和SWMh (b)三雜交體表面上的表達(dá)的典型概況。不論單核細(xì)胞的小鼠或人來源，100%的三雜交體是人和小鼠運(yùn)鐵蛋白受體陽性的。圖53.小鼠CD 138以及小鼠CDllb或人CD14在SWMm (a)和SWMh (b)三雜交體上的表達(dá)的典型概況。小鼠⑶138的表達(dá)似乎依賴于單核細(xì)胞的小鼠或人來源。盡管84%的 SWMm三雜交體是小鼠⑶138陽性的，但僅29%的SWMh在它們的表面上具有小鼠⑶138。圖54.人⑶19和人⑶14在SWMh嵌合的三雜交體的表面上的表達(dá)的FACS概況，顯示了 96%的細(xì)胞表達(dá)人⑶19，66%共表達(dá)人⑶14。圖55. —個(gè)單細(xì)胞操作/遞送系統(tǒng)。圖56. —個(gè)玻璃微量移液管。圖57. —個(gè)微電極。圖58. 2個(gè)平行的微電極。圖59.在組織培養(yǎng)板的孔中的2個(gè)微電極。圖60.含有處于2微電極中間的3個(gè)細(xì)胞的孔的頂視圖。圖61.圖60的孔的側(cè)視圖。圖62.在用第二種蛋白hIL-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前(A)和之后(B)，CD25和slgM在雜交細(xì)胞表面上的表達(dá)，所述雜交細(xì)胞通過雜交I個(gè)KBT細(xì)胞和I個(gè)shIgM+CD25+B細(xì)胞而產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式參考附圖，下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)施例II.細(xì)胞選擇、細(xì)胞操作和單細(xì)胞克隆下面的實(shí)施例描述了細(xì)胞制備，包括用于產(chǎn)生跨譜系三雜交體和用于表達(dá)所需蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和原代細(xì)胞的選擇和分離(或分選)。特定選擇技術(shù)的挑選，無論如何不是限制性的，而是指示性的，所述選擇技術(shù)用于得到具有特定特征的細(xì)胞的純?nèi)后w，或使用特定標(biāo)記物(或多個(gè)標(biāo)記物)來分離具有特定表型的細(xì)胞。其它細(xì)胞標(biāo)記物或分選程序可以用于產(chǎn)生類似的結(jié)果。I. I.從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系選擇細(xì)胞作為癌基因來源在標(biāo)準(zhǔn)的(正常的)條件下，在CO2培養(yǎng)箱中，在37 °C，在濕潤的5 % CO2氣氛中， 使用改良的RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基)，懸浮培養(yǎng)所有無限增殖的細(xì)胞系(參見下面)，所述培養(yǎng)基含有NaHCO3 (JRH Biosciences)、20mM Hepes(Sigma), 4mM L-谷氨酰胺(Sigma),并補(bǔ)加了 10%胎牛血清FCS (JRH Biosciences)。除非另外說明， 這里描述的組織培養(yǎng)基(TC培養(yǎng)基)是用于培養(yǎng)本發(fā)明的所有無限增殖細(xì)胞系、原代癌細(xì)胞、原代細(xì)胞培養(yǎng)物和確立的三雜交細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。一般而言，在不含抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)使用的所有細(xì)胞系、原代癌細(xì)胞和原代細(xì)胞。但是，當(dāng)懷疑存在細(xì)菌和/或真菌污染的高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中包含2%青霉素(5000單位)/鏈霉素(5mg)溶液(Sigma)。人細(xì)胞系可以用于本發(fā)明中的人細(xì)胞系如下a)髓共同祖細(xì)胞譜系，K562(源自人慢性髓細(xì)胞性白血病的細(xì)胞系)，b) T淋巴譜系，M0LT4 (人T淋巴母細(xì)胞)，和c) B淋巴譜系，WIL2NS (人B淋巴母細(xì)胞)。非人細(xì)胞系可以用于本發(fā)明中的非人細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系_Sp2 (B淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞)。I. I. I.單細(xì)胞遞送系統(tǒng)細(xì)胞分離或分選、細(xì)胞操作和單細(xì)胞克隆是本發(fā)明自始至終的基本過程。在這里， 我們描述了為了操作和/或克隆單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞而確立的單細(xì)胞遞送系統(tǒng)。所述細(xì)胞遞送系統(tǒng)(圖55)主要由玻璃微量移液管、Iml注射器和一維粗操作器(coarse manipulator)組成。圖56顯示了用于獲得單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的L-形玻璃微量移液管。移液管由血細(xì)胞比容毛細(xì)管制成,其長度為75毫米(mm),外徑和內(nèi)徑分別為I. 5mm和I. 10mm。通過加熱,拉伸管的一個(gè)末端，從而得到這樣的尖端(I):其具有大約250-300微米(μπι)的內(nèi)徑，尖端壁厚為大約30 μ m。微量移液管的另一個(gè)末端保持未改變(2)。在所述的細(xì)胞遞送系統(tǒng)(圖 55)中，注射器(4)安裝在粗操作器上，后者又安裝在磁性架(16)上。該系統(tǒng)以這樣的方式工作注射器的柱塞(6)可以被迫相對(duì)于注射器非常緩慢地向前或向后移動(dòng)。為了操作單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，必須使用柔性的醫(yī)學(xué)級(jí)管(3)，將注射器連接至微量移液管的未改變的末端 (2)，如圖所示。必須通過用70%乙醇沖洗幾次，將單細(xì)胞遞送系統(tǒng)滅菌，最后沒有氣泡地充入適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)基或溶液(根據(jù)無論什么需要)，然后進(jìn)行任何細(xì)胞操作。I. I. 2.單細(xì)胞克隆通過單細(xì)胞克隆，確立來自每個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞的克隆。下面描述了在本發(fā)明中使用的克隆或操作任意生物學(xué)細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞(例如，K562細(xì)胞系的細(xì)胞)的技術(shù)。將5μ I Κ562細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液從它的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物取出，并放入組織培養(yǎng) 96-孔板(TC板，Becton and Dickinson或BD)的孔中，所述孔含有150 μ I TC培養(yǎng)基。該孔被命名為“細(xì)胞儲(chǔ)存孔”。將板放在倒置顯微鏡(Axiovert 40C, Carl Zeiss)的XY顯微鏡載物臺(tái)上。在單細(xì)胞操作/克隆過程前，給微量移液管(圖56)沒有氣泡地完全充滿 TC培養(yǎng)基。將單細(xì)胞遞送系統(tǒng)的微量移液管、管和注射器(圖55)安裝在一維粗操作器 (Narishege)上。以使尖端位于顯微鏡的光學(xué)視野中心的方式，排列微量移液管尖端(I)。 為了操作和克隆單個(gè)K562細(xì)胞，將微量移液管插入細(xì)胞儲(chǔ)存孔中。通過在抽吸方向非常緩慢地移動(dòng)注射器的柱塞，將單個(gè)K562細(xì)胞放置在微量移液管中。從細(xì)胞儲(chǔ)存孔收回微量移液管。通過使顯微鏡載物臺(tái)從細(xì)胞儲(chǔ)存孔側(cè)向移動(dòng)至鄰近的孔(命名為“克隆孔”)，并隨后將微量移液管插入該克隆孔中，然后將微量移液管中的單個(gè)細(xì)胞輕輕從微量移液管釋放出來。這通過在釋放方向非常緩慢地移動(dòng)注射器的柱塞來實(shí)現(xiàn)。將從細(xì)胞儲(chǔ)存孔取出單個(gè)細(xì)胞并將所述單個(gè)細(xì)胞放入克隆孔中的過程重復(fù)多次，直到每個(gè)TC板得到60個(gè)單細(xì)胞克隆。在運(yùn)行于37°C、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱(Thermoline Scientific)中溫育克隆板10天的時(shí)段。在溫育時(shí)間段過程中，定期地用新鮮的TC培養(yǎng)基補(bǔ)充每個(gè)克隆孔中的培養(yǎng)基。每 24小時(shí)，記錄來自每個(gè)克隆孔的每個(gè)克隆的細(xì)胞增殖。在溫育時(shí)間段結(jié)束時(shí)，確立K562細(xì)胞的許多克隆。選擇具有最聞增殖速率或最聞目標(biāo)標(biāo)記物(其在細(xì)胞表面上表達(dá)，例如，在 K562細(xì)胞上的CD71運(yùn)鐵蛋白受體)水平的克隆，用于三雜交體生產(chǎn)或其它實(shí)驗(yàn)。I. 1.3. CD71+細(xì)胞的分選作為一個(gè)實(shí)例，下面的方法描述了使用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)從K562細(xì)胞系中進(jìn)行CD71陽性細(xì)胞的細(xì)胞選擇和分選。與20 μ I藻紅蛋白(PE)綴合的抗-CD71 (BD Pharmingen)或PE綴合的同種型對(duì)照抗體IgG2a, K (BD Pharmingen) 一起,將懸浮于100 μ I磷酸鹽緩沖溶液(Dulbeco PBS) 中的1χ105Κ562細(xì)胞在暗處在室溫溫育30分鐘，所述磷酸鹽緩沖溶液含有2 %牛血清清蛋白BSA(Sigma)。用Iml PBS稀釋溫育混合物，且通過在300g離心10分鐘，收集染色的細(xì)胞。在用Iml PBS洗滌另外一次以后，將染色的細(xì)胞懸浮于Iml PBS中，并立即使用FACS (BD FACSCalibur)進(jìn)行分析。圖I顯示了 K562細(xì)胞系的⑶71+細(xì)胞的概況。門控并分選⑶71+陽性的細(xì)胞(圖Ia)。原始的K562群體中大約65%是CD71陽性的。將分選的細(xì)胞在300g 離心10分鐘，并懸浮于Iml PBS中，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。收集IOOml懸浮的⑶71+-分選的細(xì)胞用于純度分析，如圖Ib所示。得到CD71+分選的細(xì)胞的99%純度。在細(xì)胞分選以后， 將K562細(xì)胞系的CD71+細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，或置于在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)物中，并標(biāo)記為^71-富集的1(562細(xì)胞。使用相同的方法，確立⑶71-富集的WIL2NS和⑶71-富集的M0LT4培養(yǎng)物。I. I. 3. I.從K562培養(yǎng)物分選骨髓單核細(xì)胞譜系的⑶71+細(xì)胞為了確保用于細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞的骨髓單核細(xì)胞表型，使用FACS分析和隨后的分選，進(jìn)一步富集⑶71+K562細(xì)胞中的⑶15+細(xì)胞。為此目的，用PE抗-人CD71和FITC抗-人CD15 (BD Pharmingen)標(biāo)記從在第 I. I. 3部分中所述的方法得到的⑶71-富集的K562細(xì)胞。與20 μ I抗-人⑶71-ΡΕ和抗-人CD15-FITC抗體或陰性同種型對(duì)照抗體或FITC和PE標(biāo)記的陰性同種型對(duì)照抗體一起，將懸浮于100 μ I含有2 % BSA的PBS中的IxlO5洗過的⑶71-富集的Κ562細(xì)胞在暗處在室溫溫育30分鐘。用Iml PBS稀釋溫育混合物，且通過在300g離心10分鐘，收集染色的細(xì)胞。在用Iml PBS洗滌另外一次以后，將染色的細(xì)胞懸浮于Iml PBS中，且立即使用 FACSCalibur (BD)進(jìn)行分析。典型的FACS概況示于圖2a。在培養(yǎng)5個(gè)月以后，99%的⑶71-富集的K562細(xì)胞保持⑶71陽性，其中大約18%表達(dá)表面⑶15。門控⑶71和⑶15陽性的細(xì)胞(圖2a)，并分選。通過在300g離心10分鐘，收集分選的細(xì)胞，并懸浮于Iml PBS中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。 收集100 μ I懸浮的⑶71+⑶15+分選的細(xì)胞，用于純度分析。在2個(gè)月培養(yǎng)以后，關(guān)于⑶71 和CD15的共表達(dá)，重新分析分選的細(xì)胞(圖2b)。結(jié)果表明，大約98%的純化的細(xì)胞保持 ⑶71和⑶15。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些在早期在表面上表達(dá)⑶71和⑶15的細(xì)胞已經(jīng)喪失它們的 CD15表達(dá)(圖2b)，從而提示，K562細(xì)胞中向骨髓單核細(xì)胞譜系的定型是不穩(wěn)定的和可逆的。I. I. 4.從小鼠Sp2細(xì)胞系選擇運(yùn)鐵蛋白受體陽性的細(xì)胞當(dāng)在三雜交體的產(chǎn)生中使用小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2時(shí)，該群體富集表達(dá)小鼠運(yùn)鐵蛋白受體(TfR)(人CD71的類似物)的細(xì)胞。遵循與第I. I. 3部分(其描述了人細(xì)胞系中⑶71+細(xì)胞的富集)基本上相同的規(guī)程，但是使用FITC-綴合的大鼠抗-小鼠TfR抗體(Abcam)替代PE-綴合的小鼠抗-人 ⑶71。相應(yīng)地調(diào)節(jié)同種型對(duì)照。圖44顯示了 Sp2細(xì)胞系的TfR+細(xì)胞的概況。門控并分選TfR+陽性的細(xì)胞(圖 44a)。原始的Sp2群體中大約45%是TfR陽性的。將分選的細(xì)胞在300g離心10分鐘，并懸浮于Iml PBS中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。收集IOOml懸浮的TfR+-分選的細(xì)胞用于純度分析， 如圖44b所示。得到TfR+分選的細(xì)胞的99. 5%純度。在細(xì)胞分選以后，將Sp2細(xì)胞系的 TfR+細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，或置于在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)物中，并標(biāo)記為TfR-富集的 Sp2細(xì)胞。I. 2.從原代癌細(xì)胞選擇細(xì)胞作為癌基因來源作為一個(gè)實(shí)例，下面的方法描述了從急性髓細(xì)胞性白血病(AML)患者得到的骨髓樣品的髓性譜系選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。相同的方法也適用于從對(duì)應(yīng)的血液惡性腫瘤的骨髓樣品選擇其它譜系的細(xì)胞。在知情同意以后，從AML患者得到骨髓抽吸物。從患者提取樣品，所述患者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以前已經(jīng)確診AML。使用與第I. 3. I部分所述相同的密度梯度離心程序，分離出AML單核的細(xì)胞，并使用FACS，從樣品分選或分離CD34+細(xì)胞。為了染色或標(biāo)記上面得到的單核的細(xì)胞，將10 μ I小鼠抗-人⑶34-ΡΕ抗體(BD Pharmingen)或PE同種型對(duì)照抗體(BD Pharmingen)添加到IxlO6單核的細(xì)胞在染色培養(yǎng)基(PBS+5% BSA)中的100 μ I給定的等分試樣中。對(duì)于給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將IOml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到細(xì)胞沉淀中，并在350g和4°C離心7min。 抽吸上清液，然后通過輕打管，重新懸浮細(xì)胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細(xì)胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。將標(biāo)記的細(xì)胞懸浮于染色培養(yǎng)基中，并應(yīng)用FACS。在設(shè)定CD34+細(xì)胞群體的適當(dāng)分選門以后，收集細(xì)胞級(jí)分。對(duì)于富集培養(yǎng)物，將40xl03細(xì)胞的CD34+-富集的細(xì)胞鋪平板于用合成的胞外基質(zhì)預(yù)包被的12孔板中。在補(bǔ)加了 57mM β-巰基乙醇(Sigma)、ImM氫化可的松和20ng/ml人 IL-3和人G-CSF的完全TC培養(yǎng)基中，增殖細(xì)胞。培養(yǎng)48小時(shí)以后，使用FACS，針對(duì)⑶15 表達(dá)來進(jìn)一步選擇細(xì)胞。對(duì)于熒光-細(xì)胞染色，使用小鼠抗-人CD15_FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人 CD34-PE (BD Pharmingen)，且也采用在在該部分前面的內(nèi)容中描述的類似的細(xì)胞染色方法。使用FACS，分析染色的樣品。在為⑶34和⑶15陽性的細(xì)胞群體(⑶34+CD15+)或?yàn)?⑶34陽性和⑶15陰性的細(xì)胞群體(⑶34+⑶15_)設(shè)定適當(dāng)?shù)姆诌x門以后，收集級(jí)分。培養(yǎng)48小時(shí)以后⑶15在⑶34+AML細(xì)胞上的表達(dá)的概況顯示于圖3中。大約54% 的AML單核的細(xì)胞被測(cè)試為CD15陽性的，同時(shí)維持它們的CD34表達(dá)，而細(xì)胞群體的剩余部分保持它的CD34表達(dá)，沒有定型為骨髓單核細(xì)胞譜系。在該實(shí)驗(yàn)中使用CD34+CD15+細(xì)胞， 用于確立三雜交體。1.3.原代細(xì)胞原代細(xì)胞可以源自任意淋巴組織，諸如外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體和局部淋巴結(jié)。作為第一步，處理所有淋巴組織，以分離單核的細(xì)胞。1.3.1.從骨髓、外周血或臍帶血分離人單核的細(xì)胞在知情同意以后，從健康個(gè)體收集外周血樣品。將每個(gè)血液樣品收集在肝素化 (heparinised)的管(Vacutainer, BD)中，合并，并在 RPMI 1640 中稀釋。從經(jīng)歷骨髓活組織檢查且具有正常骨髓、沒有任何血液異常的患者，得到人骨髓抽吸物。以I : 3的比例，用RPMI 1640稀釋樣品。在知情同意以后，從正常的足月產(chǎn)道分娩，得到人臍帶血樣品。在分娩嬰兒和結(jié)扎臍帶以后，在娩出胎盤之前，用肝素化的60ml注射器，收集每份臍帶血。在RPMI1640中稀釋每份樣品。通過在Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia)上的密度離心，制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)、骨髓單核的細(xì)胞(BMMC)和臍帶血單核的細(xì)胞(UCBMC)。簡(jiǎn)而言之，使用附著至 20ml注射器的套管，在20ml細(xì)胞懸浮液下,分層IOml Ficoll-Paque。在I, 700rpm(700g) 在4°C離心樣品細(xì)胞40分鐘。收集在界面中的細(xì)胞，且通過在2，OOOrpm(1，OOOg)離心10 分鐘，在50ml RPMI 1640中洗滌。拋棄上清液，將沉淀的細(xì)胞重新懸浮于40ml RPMI 1640中，并在I, 300rpm(400g)離心10分鐘。如下分別取出紅血細(xì)胞和血小板用O. 83% (wt/ VoDNH4Cl裂解，并在用PBS以I 2比率稀釋的Ficoll-Paque上進(jìn)行第二次離心。分離的單核的細(xì)胞用于培養(yǎng)或分析，并通過FACS或磁珠分離系統(tǒng)，分選成細(xì)胞特異性的級(jí)分。1.3.2.從實(shí)體淋巴組織分離人單核的細(xì)胞下面的方法描述了在本發(fā)明中使用的從脾、胸腺、扁桃體或局部淋巴結(jié)分離單核的細(xì)胞的程序。也給出了用于細(xì)胞染色和分選的方法。遵循國家倫理方針，從器官移植供體得到脾樣品。在分離脾細(xì)胞之前，將各自大約 2x 2x 3cm的脾塊于4°C保存在RPMI 1640中。使用注射器的柱塞，穿過無菌篩目，將每個(gè)塊切成小塊。然后通過用在完全培養(yǎng)基中的20U/ml VII型膠原酶(Sigma)和20U/ml DNA 酶(Sigma)在室溫消化30分鐘，酶促地解離細(xì)胞。通過添加EDTA達(dá)到10mM，并在室溫?cái)嚢?分鐘，進(jìn)一步解離細(xì)胞團(tuán)塊。然后用完全培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞2次，以停止酶促消化，并重新懸浮于RPMI 1640中。與非酶促解離程序(McIlroy等人1995)相比，這些條件不影響表面分子表達(dá)。通過在第I. 3. I部分中描述的密度梯度離心(但是紅血細(xì)胞的取出除外)， 從這些脾細(xì)胞懸浮液分離脾單核的細(xì)胞。將脾單核的細(xì)胞重新懸浮于RPMI1640中，且將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至IxlO6細(xì)胞/ml。通過錐蟲藍(lán)排除，測(cè)得細(xì)胞生存力超過98%。在他們的父母知情同意以后，從經(jīng)歷心臟外科手術(shù)的兒童獲得胸腺。如下從胸腺分離出胸腺細(xì)胞破裂胸腺組織，并使用填充了 RPMI1640培養(yǎng)基的注射器，沖洗胸腺細(xì)胞脫離組織。通過上述的密度梯度-離心，純化胸腺細(xì)胞。在知情同意以后，從因?yàn)檠仔圆“Y而經(jīng)歷扁桃體切除術(shù)的患者得到扁桃體。將組織樣品保存在冰上的完全培養(yǎng)基和250 μ g/ml慶大霉素中，并在3小時(shí)內(nèi)處理。在去除上皮層以后，將扁桃體組織切成塊，并通過截?cái)噢D(zhuǎn)移移液管，輕輕抽吸組織塊。然后使用與前面在脾單核細(xì)胞的分離中所述相同的程序，分離扁桃體細(xì)胞。I. 3. 3.從源自各種組織的單核的細(xì)胞分離譜系特異性的原代細(xì)胞使用FACS分析和細(xì)胞分選或磁性細(xì)胞分選，通過標(biāo)準(zhǔn)程序，分離B淋巴譜系、T淋巴譜系和髓譜系的人細(xì)胞。下面給出了用于從各種組織分離譜系特異性的原代細(xì)胞的細(xì)胞染色和分選的非限制性實(shí)例。I. 3. 3. I.從人脾和外周血分離B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞如第I. 3. I部分所述，初步處理組織樣品，以提取單核的細(xì)胞群體。然后在分離單核的細(xì)胞群體的4小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行熒光-細(xì)胞染色，繼之以細(xì)胞分選。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(參見第I. I部分)，將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基中，直到染色。I. 3. 3. I. I.源自各種組織的原代成熟B細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞的細(xì)胞染色和分選下面是來自原代細(xì)胞的B和T細(xì)胞的染色和分選的實(shí)例。通常，B細(xì)胞和輔助T 細(xì)胞的選擇分別基于CD19和CD4的表面表達(dá)，而骨髓單核細(xì)胞的選擇是基于CD14和/或 ⑶16的表面表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，將各10 μ I的小鼠抗-人CD19-FITC抗體(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD4-PE抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照添加到單核的細(xì)胞在染色培養(yǎng)基(PBS+5% BSA)中的IOOy I等分試樣中，每份等分試樣含有IxlO5細(xì)胞。對(duì)于單核的細(xì)胞群體的給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將IOml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到染色混合物中，且在350g和4°C離心7分鐘。抽吸上清液，且然后通過輕打管，重新懸浮細(xì)胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細(xì)胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。對(duì)于其它等分試樣，重復(fù)該過程。使用FACS，分析染色的細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)樣品，分析至少20，000個(gè)門控的事件。在為⑶19陽性的B細(xì)胞群體(CD19+CD4_)或?yàn)镃D4陽性的T細(xì)胞群體(CD4+CD19_)設(shè)定適當(dāng)?shù)姆诌x門以后，收集級(jí)分。收集Iml每個(gè)級(jí)分用于純度分析，并將每個(gè)級(jí)分的剩余部分重新懸浮于完全培養(yǎng)基中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。I. 3. 3. I. 2.分選的細(xì)胞群體的回收和分析使用適當(dāng)?shù)你暯宇^，將少數(shù)細(xì)胞(S5X105細(xì)胞)直接地分選進(jìn)微量離心管中。 在分選之前，向回收管中添加小體積(O. 1-0. 2ml)的補(bǔ)料RPMI 1640，以與分選的樣品混合，并提高分選的細(xì)胞的生存力。在分選以后，只要回收的細(xì)胞的數(shù)目允許，用染色培養(yǎng)基以I : 10稀釋20 μ I每個(gè)分選的細(xì)胞樣品用于重新分析，以驗(yàn)證它的純度?？山邮艿募兌仁轻?5%。添加另外20-40μ1 FCS/ml的分選的樣品，且隨后在350g、4°C離心7min。然后將細(xì)胞重新懸浮于標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)基中。如果可得到足夠的細(xì)胞，則對(duì)它們計(jì)數(shù)，以測(cè)定得率。用抗-人⑶19-FITC和抗-人⑶4-PE標(biāo)記的脾樣品的FACS概況示于圖11a，而分選的⑶19+B細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞的純度分析的概況示于圖Ilb和Ilc (參見KBT雜交體表征)。級(jí)分中的細(xì)胞純度超過98% (對(duì)于⑶19+細(xì)胞而言)和96% (對(duì)于⑶4+細(xì)胞而言)。來自外周血的⑶19+和⑶4+細(xì)胞的分選和純度概況與來自脾樣品的那些基本上類似，僅得到更少數(shù)目的每種細(xì)胞群體。對(duì)于人單核細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞的分離，首先根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用人CD14 磁珠MACS (Mi ltenyi Biotec GmbH)，排除單核的細(xì)胞群體中的⑶14陰性的細(xì)胞。用小鼠抗-人 CD16-PE (BD Pharmingen)和小鼠抗-人 CD14_PerCP (BD Pharmingen)抗體,進(jìn)一步染色或標(biāo)記陽性地選擇的CD14細(xì)胞。上面已經(jīng)描述了細(xì)胞染色和分選以及回收分選的細(xì)胞的方法(參見第I. 3. 3. I. I部分和第I. 3. 3. I. 2部分)。使用FACS，分析染色的樣品。分析至少20，000個(gè)門控的事件。使用MACS珠關(guān)于 CD14陽性選擇的總細(xì)胞中的大約86%是CD14陽性的?；贑D16的表達(dá)，將CD14+群體進(jìn)一步分成3個(gè)組代表大部分⑶14+細(xì)胞的⑶14hCD16_ KDHtDieL和⑶14HCD16H細(xì)胞的少數(shù)群體。級(jí)分中的細(xì)胞純度超過98% (對(duì)于⑶14HCD16_而言)、96% (對(duì)于⑶14%0161 而言)和92% (對(duì)于CD14HCD16H而言)。在設(shè)定適當(dāng)?shù)姆诌x門以后，收集下述細(xì)胞群體 ⑶14HCD16_、⑶14%0161和⑶14tD16H細(xì)胞級(jí)分。圖4顯示了用小鼠抗-人⑶16-PE和小鼠抗-人⑶14-PerCP標(biāo)記的⑶14富集的樣品的FACS概況。來自脾組織的CD14+細(xì)胞的細(xì)胞分選和純化的方法與來自外周血樣品的那些基本上相同，但是得到更少數(shù)目的每個(gè)細(xì)胞群體。I. 3. 3. 2.從人臍帶血分離⑶5陽性的(抗原處理過的)B細(xì)胞和⑶5陰性的(幼稚)B細(xì)胞如在第I. 3. I部分中所述，從臍帶血樣品制備單核的細(xì)胞。在單核的細(xì)胞群體分離的4小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行熒光-細(xì)胞染色，繼之以細(xì)胞分選。在該具體實(shí)施例中，根據(jù)前面(第 I. 3. 3. I. I部分)所述的方法，使用小鼠抗-人⑶5-FITC抗體(BD Pharmingen)、小鼠抗-人CD19-PE抗體(BDPharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照,從人臍帶血分選CD5陰性的(幼稚)B 細(xì)胞和⑶5陽性的(抗原處理過的)B細(xì)胞。使用FACS，分析染色的樣品。對(duì)于每個(gè)樣品，分析至少20，000門控的事件。在為 ⑶5陰性的B細(xì)胞群體(⑶19+CD5_)或?yàn)棰?陽性的B細(xì)胞群體(⑶19+⑶5+)群體設(shè)定適當(dāng)?shù)姆诌x門以后，收集許多級(jí)分。圖5顯示了用小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5染色的樣品的典型概況。樣品中B細(xì)胞的百分比范圍是4-19. 2 %，且⑶5+B細(xì)胞占總循環(huán)的淋巴細(xì)胞的 O. 8-7. 2%。I. 3. 3. 3.從人臍帶血分離⑶5陽性的(抗原處理過的)T細(xì)胞和⑶5陰性的(幼稚)T細(xì)胞使用與在第I. 3. I部分中所述類似的方法，從臍帶血樣品提取單核的細(xì)胞。在單核的細(xì)胞群體分離的4小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行熒光-細(xì)胞染色，繼之以細(xì)胞分選。在該具體實(shí)施例中，根據(jù)前面(第I. 3. 3. I. I部分)所述的細(xì)胞方法，使用小鼠抗-人CD5-FITC抗體(BD Pharmingen)、小鼠抗-人⑶3-PE抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照，從人臍帶血分選CD5陽性的(抗原處理過的)T細(xì)胞和CD5陰性的(幼稚)T細(xì)胞。使用FACS，分析染色的細(xì)胞。分析至少20，000門控的事件。設(shè)定分選門，以收集含有CD5陰性的T細(xì)胞 (CD3+CD5-)或CD5陽性的T細(xì)胞(CD3+CD5.)的級(jí)分。圖6顯示了用小鼠抗-人CD3和小鼠抗-人CD5抗體染色的樣品的典型概況?；厥蘸头治龇诌x的群體實(shí)際上，用于回收和分析分選的群體的相同方法已經(jīng)描述在第I. 3. 3. I. 2部分中。樣品中T細(xì)胞的百分比范圍是I. 7-13. 5%，且⑶5+T細(xì)胞占總循環(huán)的淋巴細(xì)胞的
O.4-1. 3%。I. 3. 3. 4.基于⑶20和⑶72表達(dá)從人骨髓單核的群體分離早期B細(xì)胞、活化的和靜息B細(xì)胞使用前面(第1.3. I部分)所述的方法，從骨髓提取單核的細(xì)胞。在單核的細(xì)胞群體分離的4小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行熒光-細(xì)胞染色，繼之以細(xì)胞分選?；罨腂細(xì)胞的染色和分選以前描述在第1.3.3. I. I部分。具體地，使用10 μ I小鼠抗-人⑶72-FITC抗體(BD Pharmingen)和20 μ I小鼠抗-人⑶20-ΡΕ抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照(PE 小鼠IgG2b，K抗體)。使用FACS，分析染色的細(xì)胞。設(shè)定分選門，以收集含有下述群體的級(jí)分包含前B細(xì)胞、靜息和活化的B細(xì)胞、濾泡樹突細(xì)胞的⑶20陽性群體(⑶20+⑶72_)，或包含早期B細(xì)胞(⑶20TD72+)或活化的B細(xì)胞(⑶20+CD72+)的⑶72陽性的細(xì)胞群體。圖 7顯示了用小鼠抗-人CD20和小鼠抗-人CD72抗體染色的樣品的典型概況?；厥蘸头治龇衷柕娜后w實(shí)際上，將在第I. 3. 3. I. 2部分中描述的相同方法用于回收和分析分選的群體。通常，骨髓單核的細(xì)胞群體中的大約10-15%是⑶20和⑶72陽性的；9_12%的細(xì)胞是⑶20陽性的，但是⑶72陰性的；且僅大約8%是⑶72陽性的。1.3. 3. 5.通過磁珠分選分離出胸腺細(xì)胞亞群使用MACS CD4 Multisort 試劑盒(Miltenyi Biotec GmbH),根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，分選⑶4TD8_雙陰性的胸腺細(xì)胞、⑶4+⑶8+雙陽性的胸腺細(xì)胞和⑶4+和⑶8+單陽性的胸腺細(xì)胞群體。簡(jiǎn)而言之，與⑶4Multisort⑶4微珠一起，溫育使用與在第I. 3. 2部分中所述類似的方法收集的胸腺細(xì)胞30分鐘。用在PBS中的5mM EDTA和O. 5% BSA洗滌以后， 在磁性柱上分離標(biāo)記的細(xì)胞。陽性選擇的胸腺細(xì)胞(其保持在磁性柱上)含有CD4+單陽性的和CD4+CD8+雙陽性的細(xì)胞群體，而CD4排除的細(xì)胞群體(其通過柱洗脫)含有CD8+單陽性的和CD4_CD8_雙陰性的細(xì)胞。為了從CD4陽性地選擇的細(xì)胞群體去除微珠，將細(xì)胞與 MACS Multisort釋放試劑溫育。20分鐘以后，停止消化，且用⑶8微珠標(biāo)記細(xì)胞30分鐘。 通過陽性選擇，得到CD4+CD8+雙陽性的胸腺細(xì)胞，而CD4+單陽性的細(xì)胞存在于排除的細(xì)胞群體中。將CD4排除的細(xì)胞群體與CD8微珠溫育30分鐘。在將標(biāo)記的細(xì)胞應(yīng)用于磁性柱以后，CD8+單陽性的細(xì)胞可以與CD4_CD8_雙陰性的胸腺細(xì)胞分離開。通過流式細(xì)胞術(shù)分析， 評(píng)價(jià)4個(gè)不同的胸腺細(xì)胞亞群的純度?？山邮艿募兌仁浅^95%。I. 3. 3. 6.從人扁桃體分離CD54+T細(xì)胞。使用在第I. 3. 2部分中所述的方法，從人扁桃體提取單核的細(xì)胞。在單核的細(xì)胞群體分離的4小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行熒光-細(xì)胞染色，繼之以細(xì)胞分選。使用小鼠抗-人CD3-PE抗體(BD Pharmingen)和小鼠抗-人⑶54-FITC抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照，從單核的扁桃體細(xì)胞群體提取CD54+T細(xì)胞(細(xì)胞間粘附分子-I或ICAM-1)，使用在第
1.3.3.I. I部分中所述的細(xì)胞染色/分選方法進(jìn)行選擇。使用FACS，分析染色的細(xì)胞。設(shè)定分選門，以收集含有⑶3+T細(xì)胞(即⑶3+⑶54_細(xì)胞)或活化的⑶54+T細(xì)胞(即⑶3+⑶54+ 細(xì)胞)的級(jí)分。圖8顯示了用小鼠抗-人⑶3和小鼠抗-人⑶54抗體染色的樣品的FACS 概況。使用⑶3+細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交體，而⑶54+活化的T細(xì)胞用于表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，盡管T細(xì)胞占從扁桃體分離的單核的細(xì)胞的大多數(shù)(82%)，但僅9%是 CD54+T 細(xì)胞。1.3. 4小鼠單核的細(xì)胞的分離將8-12周齡的BALB/c小鼠維持在無特定病原動(dòng)物設(shè)施中。在組織提取之前，通過CO2暴露，對(duì)小鼠實(shí)施安死術(shù)。通過腋動(dòng)脈或股動(dòng)脈穿刺，得到外周血，并收集在肝素包被的管中。使用與在第I. 3. I部分中關(guān)于人外周血單核的細(xì)胞的分離所述相同的規(guī)程，分離單核的細(xì)胞群體。機(jī)械地破裂小鼠脾，并使用在第I. 3. 2部分中所述的人脾單核的細(xì)胞的分離的程序，分離單核的細(xì)胞。1.3.5.從小鼠單核的細(xì)胞分離譜系特異性的原代細(xì)胞使用FACS分析和細(xì)胞分選或磁性細(xì)胞分選，通過標(biāo)準(zhǔn)程序，分離T淋巴譜系和髓譜系的小鼠細(xì)胞。下面給出了用于分離譜系特異性的原代小鼠細(xì)胞的細(xì)胞染色和分選的非限制性實(shí)例。I. 3. 5. I.從小鼠脾和外周血分離效應(yīng)T細(xì)胞不同的效應(yīng)T細(xì)胞的選擇基于⑶4和⑶8的表面表達(dá)。 將10 μ I每種小鼠抗-小鼠OM-PE抗體(BD Pharmingen)和大鼠抗-小鼠 CD8-FITC抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照添加到脾或外周血單核細(xì)胞在染色培養(yǎng)基(PBS+5% BSA)中的100μ I等分試樣中，每份等分試樣含有IxlO5細(xì)胞。對(duì)于單核的細(xì)胞群體的給定的等分試樣，在冰上溫育染色混合物30分鐘。將IOml冰冷的染色培養(yǎng)基添加到染色混合物中，且在350g和4°C離心7分鐘。抽吸上清液，且然后通過輕打管，重新懸浮細(xì)胞沉淀，向其中添加同等體積的冰冷的染色培養(yǎng)基。將染色的細(xì)胞離心，且在冰冷的染色培養(yǎng)基中再洗滌一次。對(duì)于其它等分試樣，重復(fù)該過程。使用FACS，分析染色的細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)樣品，分析至少20，000個(gè)門控的事件。染色的小鼠外周血和脾單核的細(xì)胞的典型FACS概況分別顯示于圖45 (a)和45 (b)中。淋巴組織含有單陽性的⑶4或⑶8T細(xì)胞和雙陽性的T細(xì)胞，但是細(xì)胞表現(xiàn)存在差異。例如，外周血中的最大群體含有CD8+CD4—細(xì)胞毒性T細(xì)胞(43% )，而單核的脾細(xì)胞主要表現(xiàn)為⑶4+CD8_輔助或調(diào)節(jié)T細(xì)胞(42% )。在為CD4陽性群體(區(qū)域Rl)、為CD8陽性群體(區(qū)域R3)或?yàn)殡p陽性的細(xì)胞群體(區(qū)域R2) 設(shè)定適當(dāng)?shù)姆诌x門以后，收集級(jí)分。收集Iml每個(gè)級(jí)分用于純度分析，并將每個(gè)級(jí)分的剩余部分重新懸浮于完全培養(yǎng)基中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。每個(gè)級(jí)分的純度大于98%。1.3. 5. 2.從小鼠外周血分離單核細(xì)胞通過使用磁珠(Miltenyi Biotec)的負(fù)選擇,從外周血單核群體分離小鼠單核細(xì)胞。將單核的細(xì)胞懸浮于磁性細(xì)胞分選緩沖液(PBS，01% wt/vol BSA，和O. 5mM EDTA)中， 并根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，與包括針對(duì)T細(xì)胞(⑶90)、B細(xì)胞(B220)和NK細(xì)胞(⑶49b)的抗體的抗體微珠(MicroBeads)混合物一起溫育。然后將細(xì)胞通過LD-負(fù)選擇柱運(yùn)行。收集陰性的(單核細(xì)胞)級(jí)分。為了測(cè)定純度，用PE綴合的針對(duì)CDllb的抗體和FITC綴合的針對(duì) CD90、B220、CD49b、NKl. I和Ly6G的抗體(BD Pharmingen)，對(duì)細(xì)胞染色。將單核細(xì)胞鑒別為⑶llb+ra9(TB220TD49b-NK I. rLy6G-/(ffi)，并通過FACS驗(yàn)證純度概況。小鼠單核細(xì)胞群體的純度概況示于圖46。100%的細(xì)胞是⑶Ilb陽性的，而它們中超過98%是B220、⑶90、 ⑶49b和NKl. I陰性的。大約38%的CDllb陽性的細(xì)胞在低水平表達(dá)Ly6G。實(shí)施例22.分泌所需蛋白的原代細(xì)胞的產(chǎn)生在下面的部分中，給出了用于產(chǎn)生分泌所需蛋白的原代人細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞被用于細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)，或用作分析實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，或用作在三雜交體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白的分析參照。2. I.分泌人GM-CSF的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生首先，通過如在第I. 3. I部分中所述的梯度密度離心，分離臍帶血淋巴細(xì)胞，然后在含有植物凝集素(PHA)的培養(yǎng)物中活化，繼之以在IL-2(1000U/ml)中進(jìn)行細(xì)胞增殖。通過ELISA，分析人GM-CSF的生產(chǎn)。生產(chǎn)的濃度范圍是15_40ng/ml/106細(xì)胞。將共300，000PHA-活化的人淋巴細(xì)胞與根據(jù)生產(chǎn)商的說明書的濃度的與FITC綴合的小鼠抗-人⑶4抗體(Sigma)在暗處在4°C溫育30min。使用FACS(FACS VantageSE, BD)，分析和選擇活化的人T細(xì)胞。圖42 (a)顯示了 PHA-活化的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中CD4+T細(xì)胞的典型概況，而圖42(b)顯示了⑶4+分選的細(xì)胞的100%純度。2. 2.分泌IgM和IgG的人淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生將純化的B細(xì)胞(參見第I. 3. 3. I部分)以3. 75x10s細(xì)胞/ml接種在用小鼠抗-人 ⑶154抗體(BD Pharmingen)包被的96圓底孔板(Corning)的孔中。在完全RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，所述完全RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)加了 10%熱滅活的超低IgG FBS(Gibco/BRL) 和100U/ml白介素4(IL-4) (R&D systems),并在培養(yǎng)3天后添加50ng/ml白介素10 (IL10)。 通過每2-3天更換一半培養(yǎng)基，補(bǔ)充培養(yǎng)物。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，通過錐蟲藍(lán)排除，一式三份地評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力和計(jì)數(shù)。在第5天和第10天，收獲培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，在PBS中洗滌2次，并使用小鼠抗-人⑶19-PE、小鼠抗-人IgM-FITC或小鼠抗-人IgG-FITC抗體(都來自BDPharmingen),通過FACS進(jìn)行分析。使用I μ g每種抗體/IxlO6細(xì)胞,在4°C進(jìn)行所有染色。在所有分析中，超過95%的細(xì)胞是雙陰性的(使用根據(jù)同種型-匹配的陰性對(duì)照染色的標(biāo)記物集合)。從分析中排除含有死細(xì)胞和碎片的區(qū)域。通過門控5000-10000活細(xì)胞，進(jìn)行所有分析。培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中IgM和IgG陽性的細(xì)胞的典型概況示于圖9。在培養(yǎng)5天以后， 18%的⑶19+細(xì)胞是IgM陽性的，且僅I %在表面上具有可檢測(cè)的IgG，而在10天以后，IgM 陽性的淋巴細(xì)胞的百分比降低至僅2%，同時(shí)IgG陽性的細(xì)胞的百分比增加至15%。在設(shè)定適當(dāng)?shù)拈T以后，分選IgM陽性的和IgG陽性的級(jí)分，用于Ig表達(dá)實(shí)驗(yàn)。通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA，使用96ELISA孔板和塑料吸附的山羊-親和純化的針對(duì)人μ 和Y鏈的抗體，測(cè)定培養(yǎng)物中的IgM和IgG濃度。用HRP-綴合的綿羊抗-人Ig抗體揭示結(jié)合的抗體。所有抗體來自Sigma。將ABTS用作底物，并在405nm測(cè)量光密度。表I總結(jié)了在5和10天以后在B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)到的IgM和IgG水平。表I
培養(yǎng)時(shí)間段IgM, ng/ΙΟ6 細(xì)胞IgG，ng/106 細(xì)胞5天2480±182850±9210天1215±2601914±101在培養(yǎng)5天以后，IgM的生產(chǎn)下降，而IgG生產(chǎn)增加。實(shí)施例33.體細(xì)胞雜交幾種體細(xì)胞雜交方法是本領(lǐng)域眾所周知的。它們包括、但不限于例如，使用融合病毒諸如仙臺(tái)病毒的生物學(xué)方法(Kohler和Milstein，1975)，使用聚乙二醇(PEG)的化學(xué)方法(Wojciezsyn,等人，1983),及使用電場(chǎng)的電方法(Neil,和Zimmermann, 1993)。每種方法可以誘導(dǎo)或造成目標(biāo)細(xì)胞的質(zhì)膜可逆地可透過和雜交。無論采用上述的哪種細(xì)胞雜交方法，原則上，為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞雜交，需要2個(gè)基本步驟。首先，必須使要雜交的細(xì)胞的質(zhì)膜發(fā)生良好的細(xì)胞膜接觸。其次，必須同時(shí)地誘導(dǎo)質(zhì)膜在接觸點(diǎn)處可逆的破裂。關(guān)于電細(xì)胞雜交方法，通過使用具有適當(dāng)電場(chǎng)頻率的交流電電場(chǎng)(AC場(chǎng))，可以使目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生良好的細(xì)胞膜接觸，然后當(dāng)用AC場(chǎng)使它們同時(shí)地暴露于短電脈沖時(shí)，誘導(dǎo)雜交。為了進(jìn)一步詳細(xì)地說明，電細(xì)胞雜交涉及下述的物理現(xiàn)象介電電泳(DEP)和漿細(xì)胞膜的電破裂。介電電泳(Pohl，1978)是這樣的現(xiàn)象其描述了介電顆粒(諸如生物細(xì)胞)當(dāng)懸浮于適當(dāng)?shù)娜芤褐胁⑹┘舆m當(dāng)頻率的不均勻的AC電場(chǎng)時(shí)的運(yùn)動(dòng)。已經(jīng)確定地記載，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)可以描述為(i)介電顆粒的平移或遷移，例如，對(duì)于懸浮于IOOmM山梨糖醇中的Sp2 細(xì)胞，在O. 5-2. O兆赫(MHz)之間的電場(chǎng)效率(Mahaworasilpa，1992)，和(ii)介電顆粒的旋轉(zhuǎn)(MahaworasiIpa, 1992),例如對(duì)于懸浮于IOOmM山梨糖醇中的Sp2細(xì)胞,在2_10千赫 (kHz)之間的電場(chǎng)頻率。通過在一對(duì)電極(例如，圓柱狀電線，其可以排列成許多構(gòu)型)之間施加電場(chǎng)，可以產(chǎn)生不均勻的場(chǎng)。最廣泛使用的構(gòu)型是平行的電極構(gòu)型(圖58)。在有不均勻的場(chǎng)存在下，DEP可以造成介電顆粒(即生物細(xì)胞)彼此吸引，并同時(shí)向最強(qiáng)場(chǎng)的區(qū)域遷移。結(jié)果，它形成細(xì)胞的鏈或串，并又誘導(dǎo)良好的細(xì)胞膜接觸。顯而易見，當(dāng)將細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)牡蛯?dǎo)電性溶液中時(shí)，強(qiáng)烈地促進(jìn)細(xì)胞的相互吸引。當(dāng)將懸浮于合適的雜交溶液中的細(xì)胞暴露于具有適當(dāng)脈沖振幅和寬度的電脈沖時(shí)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜的電破裂(Zimmermann，1982)。廣泛地使用一定范圍的脈沖寬度，例如， 1-200微秒(μ sec)的矩形脈沖，這取決于要雜交的細(xì)胞的類型。3. I.電細(xì)胞雜交系統(tǒng)在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，電細(xì)胞技術(shù)可以用于產(chǎn)生雜交的細(xì)胞，諸如三雜交體。3. I. I.細(xì)胞操作系統(tǒng)為了在細(xì)胞雜交之前操作個(gè)別目標(biāo)細(xì)胞，在本發(fā)明自始至終使用在前面(第
I.I. I部分)描述的單細(xì)胞操作/遞送系統(tǒng)。3. 1.2.微電極在本發(fā)明中，使用2個(gè)L-形微電極。圖57顯示了直徑為128μπι的、由未包被的鎳合金制成的微電極(7)。微電極的軸被外徑為I. 5mm的血細(xì)胞比容毛細(xì)管⑶覆蓋。微電極的L-形部分(9和10)構(gòu)造成允許電極的水平段和垂直段的表面的相容區(qū)域暴露于培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)娜芤褐?Mahaworasilpa，1992)。在細(xì)胞雜交過程之前，將2個(gè)微電極安裝在 2個(gè)精致的顯微操作器上，每個(gè)顯微操作器安裝一個(gè)微電極。以得到每個(gè)電極的平行電極構(gòu)型的方式，排列這些微電極(圖58)。每個(gè)精致的顯微操作器由液壓驅(qū)動(dòng)，并允許在X、Y或 Z方向做出精細(xì)至O. 5μπι的運(yùn)動(dòng)。3. 1.3.細(xì)胞室和構(gòu)型圖59顯示了在標(biāo)準(zhǔn)的96-孔TC板的孔中的2個(gè)平行的電極，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述孔用作細(xì)胞雜交室。為了進(jìn)行細(xì)胞雜交，將微電極浸沒在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(11) 中，所述培養(yǎng)基包含在標(biāo)準(zhǔn)的96-孔組織培養(yǎng)板的孔(12)內(nèi)。圖60和圖61分別顯示了平行的電極構(gòu)型的頂視圖和側(cè)視圖，其中，將例如3個(gè)預(yù)選擇的要雜交的細(xì)胞放在平行的電極之間，其方式使得它們?cè)谟羞m當(dāng)AC電場(chǎng)存在下可以被誘導(dǎo)列成一行或形成細(xì)胞鏈。實(shí)施例44.通過電細(xì)胞雜交方法生產(chǎn)跨譜系三雜交體的實(shí)施例下面的部分提供了產(chǎn)生三雜交細(xì)胞系的實(shí)施例，所述三雜交細(xì)胞系通過雜交來自不同的譜系或細(xì)胞類型的細(xì)胞、或來自相同的譜系/或細(xì)胞類型但是具有不同表型的細(xì)胞而得到。對(duì)每個(gè)穩(wěn)定的三雜交體進(jìn)行分析，以證實(shí)它同時(shí)具有親本細(xì)胞的表型特征。所述證實(shí)基于譜系特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記物的分析、譜系特異性的標(biāo)記物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、譜系特異性的標(biāo)記物的RNA轉(zhuǎn)錄物的存在、核型分析和/或譜系特異性的蛋白的分泌。下面的實(shí)施例例證了跨譜系三雜交體的最典型的表型特征。但是，這些實(shí)施例絕不限于選擇的特定標(biāo)記物。4. I.從源自髓譜系、T淋巴譜系和B淋巴譜系的3個(gè)無限增殖細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體——KMW。通過雜交I個(gè)髓樣K562細(xì)胞、I個(gè)T淋巴樣M0LT4細(xì)胞和I個(gè)B淋巴樣WIL2NS細(xì)胞，產(chǎn)生這類跨譜系三雜交體。這樣得到的跨譜系三雜交體被標(biāo)記為KMW系(繼之以它的系列號(hào))。下面描述了在本發(fā)明中使用的KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的過程的下述步驟、溶液 (雜交培養(yǎng)基、培養(yǎng)培養(yǎng)基和恢復(fù)培養(yǎng)基)和參數(shù)。4. I. I.用于KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在我們的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(參見第I. I部分)中，培養(yǎng)K562、WIL2NS和M0LT4細(xì)胞系。 作為慣例，每3天傳代每個(gè)細(xì)胞系。在細(xì)胞雜交之前，使用在第I. I. 2部分中描述的程序， 確立每個(gè)細(xì)胞類型的穩(wěn)定克隆，其具有最高增殖速率。在有些實(shí)驗(yàn)中，使用如在第I. I. 3部分中所述確立的⑶71+-富集的細(xì)胞群體。同樣，在一些場(chǎng)合，使用⑶71+-富集的K562群體的CD15+細(xì)胞(第I. I. 3. I部分)。4. 1.2.用于KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程將TC 96-孔板的幾個(gè)孔用作細(xì)胞雜交孔。給每個(gè)孔裝填大約150μ I雜交培養(yǎng)基，其由 240mM 山梨糖醇(Sigma)、2· OmM KH2PO4(Sigma)、0· 4mM CaCl2(Sigma)、0· 2mM Mg (C2H3O2) 2 (Sigma)和 0. 2mM Ca (C2H3O2) 2 (Sigma)組成，并補(bǔ)加了 0. 2 % 牛血清清蛋白 BSA(Sigma)。在電細(xì)胞雜交之前，在雜交培養(yǎng)基中洗滌每個(gè)細(xì)胞類型的預(yù)選擇的克隆的細(xì)胞一次，進(jìn)行幾分鐘，并轉(zhuǎn)移至含有新鮮的雜交培養(yǎng)基的孔中。該孔被命名為預(yù)雜交孔。在細(xì)胞雜交過程之前，根據(jù)第I. I. I部分，操作每個(gè)選擇的克隆的單個(gè)且洗過的細(xì)胞，從而使得僅3個(gè)細(xì)胞(一個(gè)細(xì)胞來自一個(gè)選擇的克隆)位于一對(duì)相同的平行的電極之間，所述電極浸沒至孔底(如圖61所示)。電極的間距設(shè)定為400微米(即400 μ m)。為了實(shí)現(xiàn)電細(xì)胞雜交，首先，在電極之間施加交流電(AC)場(chǎng)幾秒，所述交流電場(chǎng)具有O. 8MHz的頻率和大約50-60千伏/米(例如50_60kV/m)的場(chǎng)強(qiáng)，直到3個(gè)細(xì)胞被介電電泳DEP誘導(dǎo)成彼此吸引，并形成細(xì)胞串。該過程造成細(xì)胞產(chǎn)生良好的細(xì)胞膜接觸。以使K562細(xì)胞處于細(xì)胞排列的中間的方式,排列細(xì)胞(參見圖60或61)。然后,用AC場(chǎng)同時(shí)施加2個(gè)矩形電脈沖，在脈沖之間時(shí)間間隔3秒。使用具有大約170kV/m的強(qiáng)度和75微秒(例如75ysec)的脈沖寬度的每個(gè)脈沖。在第二個(gè)矩形脈沖結(jié)束以后，使AC場(chǎng)保持連續(xù)另外5秒，從而導(dǎo)致細(xì)胞雜交成單個(gè)跨譜系三雜交的細(xì)胞。對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案， 觀察到，3個(gè)細(xì)胞的雜交可能不同時(shí)地發(fā)生，即經(jīng)常先發(fā)生3個(gè)細(xì)胞中的2個(gè)的雜交，然后與第三個(gè)細(xì)胞雜交。在有些情況下，需要額外的矩形脈沖來達(dá)到完全的3細(xì)胞雜交。然后將新產(chǎn)生的跨譜系三雜交細(xì)胞從雜交孔轉(zhuǎn)移至恢復(fù)孔，后者位于與雜交孔不同的行中。每個(gè)恢復(fù)孔含有150 μ I標(biāo)準(zhǔn)的TC培養(yǎng)基(參見第11部分)。在濕潤的培養(yǎng)箱(運(yùn)行在37°C 和5% CO2含量)中，溫育每個(gè)新確立的跨譜系三雜交細(xì)胞7天，每個(gè)恢復(fù)孔一個(gè)跨譜系三雜交細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)跨譜系三雜交體在細(xì)胞雜交事件以后的36小時(shí)內(nèi)分裂。在溫育時(shí)間段結(jié)束時(shí)，用新鮮的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充每個(gè)恢復(fù)孔中的培養(yǎng)基。這刺激每個(gè)跨譜系三雜交體克隆的細(xì)胞增殖。2或3天以后，從每個(gè)恢復(fù)孔鑒別出分裂的細(xì)胞或存活的細(xì)胞， 并鋪平板進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的24-孔TC板的孔中，產(chǎn)生一組跨譜系三雜交體克隆。在24-孔板中培養(yǎng)每個(gè)跨譜系三雜交體克隆另外一周，然后轉(zhuǎn)移進(jìn)25cm2TC瓶，該瓶含有10毫升(ml)我們的標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基(參見第I. I部分)，并適當(dāng)?shù)貥?biāo)記，用于進(jìn)一步分析。為了產(chǎn)生一批穩(wěn)定的跨譜系三雜交細(xì)胞,重復(fù)電細(xì)胞雜交和跨譜系三雜交體恢復(fù)過程的整個(gè)過程許多次。
4. I. 3. KMW跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)CD標(biāo)記物的表汰下面給出了確立的KMW跨譜系三雜交細(xì)胞系的確認(rèn)實(shí)施例。在已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件下確立KMW跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。使用三色FACS分析來驗(yàn)證下述⑶標(biāo)記物的共表達(dá)源于WIL2NS的⑶19、源于 K562 的 CD 15 和源于 M0LT4 的 CD4。簡(jiǎn)而言之，以Ix IO6細(xì)胞/ml的濃度，將100 μ I在含有5% BSA的PBS中的KMW跨譜系三雜交細(xì)胞懸浮于100 μ I PBS中，并在4°C與O. 5mg/100ml小鼠抗-人CD15_PerCP、 O. 25mg/100ml小鼠抗-人CD4-PE和I. 0mg/100ml小鼠抗-人CD19-FITC抗體或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照一起溫育30min。從BD Pharmingen得到所有小鼠抗-人抗體。在用PBS充分洗滌以后，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest Pro軟件，分析標(biāo)記的細(xì)胞。圖10顯示了 KMW跨譜系三雜交細(xì)胞系的FACS概況，其間接表明，KMW跨譜系三雜交細(xì)胞(其中譜系特異性的特征來自無限增殖的表型)含有混合表型的異質(zhì)細(xì)胞群體，其中髓樣表型是優(yōu)勢(shì)的。但是，62%的KMW細(xì)胞具有髓樣表型和T淋巴樣表型，且28%的KMW 細(xì)胞表達(dá)T淋巴樣表型和B淋巴樣表型。4. 2.從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞和2個(gè)原代淋巴樣細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體-
KBT 通過I個(gè)髓樣K562細(xì)胞、I個(gè)原代人B細(xì)胞和I個(gè)原代人T細(xì)胞的體細(xì)胞雜交，產(chǎn)生跨譜系三雜交體。所述跨譜系三雜交體被稱作KBT繼之以系列號(hào)。4. 2. I.用于KBT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在前面(第4. I. I部分)已經(jīng)描述了在產(chǎn)生KBT跨譜系三雜交體之前制備K562 細(xì)胞。在KBT跨譜系三雜交體的產(chǎn)生中使用的原代細(xì)胞包括(i)源自脾、外周血或臍帶血的成熟的B細(xì)胞(CD19+);源自骨髓的早期B細(xì)胞(CD20—CD72+);源自骨髓的活化的B細(xì)胞 (CD20+CD72.);抗原處理過的源自臍帶血的B細(xì)胞(CD19+CD5.)，和(ii)源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助T細(xì)胞(CD4+)，源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)； 抗原處理過的源自臍帶血的T細(xì)胞(CD3+CD5+);源自臍帶血的CD3+T細(xì)胞；源自胸腺的雙陰性的T細(xì)胞(CD3+CD4_CD8_)，源自胸腺的雙陽性的T細(xì)胞(CD3+CD4+CD8+)，將它們用于實(shí)驗(yàn)中。在前面在第I. 3部分中已經(jīng)描述了來自各種淋巴組織的各種原代淋巴樣細(xì)胞的分離。4. 2.2.用于KBT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于KBT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程類似于用于KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程(第4. I. 2部分)，但是培養(yǎng)基和AC電場(chǎng)和脈沖不同。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的雜交培養(yǎng)基由 230mM 山梨糖醇、I. 8mM ΚΗ2Ρ04、0· 5mM CaCl2,0. 2mM Mg (C2H3O2)JPO. 3mM Ca (C2H3O2) 2 組成，補(bǔ)加了 0. 3% BSA。同時(shí)施加0. 5MHz和65_75kV/m的AC場(chǎng)，其具有3秒時(shí)間間隔的 3個(gè)矩形脈沖串，每個(gè)矩形脈沖具有100 μ sec的脈沖寬度和175-185kv/m的強(qiáng)度。在第三個(gè)矩形脈沖結(jié)束以后，將AC場(chǎng)連續(xù)接通另外5秒，從而導(dǎo)致細(xì)胞的雜交，以生產(chǎn)跨譜系三雜交細(xì)胞。在第4. I. 2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細(xì)胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4. 2. 3. KBT跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)
CD標(biāo)記物在細(xì)朐表面h的表汰從I個(gè)無限增殖的髓樣(K562)細(xì)胞、I個(gè)原代成熟的B細(xì)胞和I個(gè)原代效應(yīng)T輔助細(xì)胞確立的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞系在例如已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件下確立跨譜系三雜交細(xì)胞系幾個(gè)月以后，分析該細(xì)胞系的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。使用與雜交之前在細(xì)胞制備中所述相同的規(guī)程(第
1.3.I. I部分)，用小鼠抗-人⑶19和⑶4抗體標(biāo)記KBT細(xì)胞系的細(xì)胞。圖11(d)顯示了從I個(gè)無限增殖的骨髓單核細(xì)胞和2個(gè)原代細(xì)胞確立的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞系的FACS概況(⑶19和⑶4標(biāo)記)。一般，這樣的穩(wěn)定的跨譜系三雜交體中超過95%的細(xì)胞表達(dá)B和 T細(xì)胞的CD標(biāo)記物，具有與親本、原代細(xì)胞類似的密度。從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)和2個(gè)原代抗原處理過的淋巴樣細(xì)胞(B和T 細(xì)胞)確立的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞系在另一個(gè)實(shí)施方案中，確立了源自I個(gè)K562細(xì)胞、I個(gè)抗原處理過的B細(xì)胞和I個(gè)抗原處理過的T細(xì)胞的細(xì)胞雜交的KBT細(xì)胞系。使用FACS，分析細(xì)胞的⑶19、⑶3和⑶5的
共表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，使用與細(xì)胞雜交之前在細(xì)胞制備中相同的規(guī)程(第1.3. I. I部分)，用小鼠抗-人⑶5-FITC和小鼠抗-人⑶19-PE或小鼠抗-人⑶4-PE抗體標(biāo)記細(xì)胞。圖12 顯示了這樣的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞系的細(xì)胞的FACS概況。結(jié)果表明，5-10%的KBT細(xì)胞群體通過維持CD5分子的細(xì)胞表面表達(dá)，同時(shí)是CD3和/或CD 19陽性的，來保持它的抗原暴露記憶。同樣，⑶5陰性的細(xì)胞群體中的至少83%共表達(dá)B譜系(⑶19)和T譜系(⑶3) 標(biāo)記物。從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)、I個(gè)活化的B細(xì)胞和I個(gè)原代雙陽性的未定型的效應(yīng)T細(xì)胞確立的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞系在另一個(gè)實(shí)施方案中，確立了源自I個(gè)K562、l個(gè)分離自胸腺的T細(xì)胞(⑶4+和 ⑶8+雙陽性的)和I個(gè)分離自骨髓的活化的B細(xì)胞(⑶20+和⑶72+)(在第I. 3. 34部分中解釋)的細(xì)胞雜交的KBT細(xì)胞系。關(guān)于⑶4、⑶8、⑶20和⑶72在細(xì)胞表面上的共表達(dá)，分析細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，使用與關(guān)于原代淋巴細(xì)胞的分離所述的相同規(guī)程(第1.3.3. I. I部分)，用小鼠抗-人⑶4-PE和小鼠抗-人⑶72-FITC抗體、或小鼠抗-人⑶20-PE和小鼠抗-人⑶8-FITC抗體、或小鼠抗-人⑶4-PE和小鼠抗-人⑶8-FITC抗體的抗體組合，標(biāo)記KBT跨譜系三雜交細(xì)胞。圖13顯示了這樣的跨譜系三雜交細(xì)胞的FACS概況。結(jié)果(參見圖13)表明，99%的KBT跨譜系三雜交細(xì)胞在它的表面上表達(dá)雙陽性的T細(xì)胞衍生的⑶4或⑶8中的任一種，其中66-71%的細(xì)胞是⑶4陽性的，且88-89%的細(xì)胞是⑶8陽性的。在這些細(xì)胞的60%中，⑶4和⑶8的表達(dá)是并行的。在是源自雙陽性的胸腺細(xì)胞的CD4陽性的同時(shí)，61%的細(xì)胞也是源自骨髓的活化B細(xì)胞的CD72陽性的。但是，跨譜系三雜交體群體中的94%在它們的表面上表達(dá)⑶72。另一方面，31%的⑶8陽性的跨譜系三雜交細(xì)胞共表達(dá)⑶20。⑶20陽性的細(xì)胞的總數(shù)是39%。4. 3.從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞、I個(gè)原代淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)原代骨髓單核細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體——WTM這是從I個(gè)無限增殖的人B淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、I個(gè)原代人T細(xì)胞和I個(gè)原代人單核細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交細(xì)胞系的實(shí)施例?？缱V系三雜交體系被標(biāo)記為WTM繼之以系列號(hào)。4. 3. I.用于WTM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在前面在第4. I. I部分中描述了在WTM跨譜系三雜交體的產(chǎn)生中使用的WIL2NS 細(xì)胞的制備。原代細(xì)胞包括源自脾和外周血的⑶14+⑶16—或⑶14+00161單核細(xì)胞；源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助T細(xì)胞(CD4+);源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細(xì)胞毒性 T細(xì)胞(⑶8+);源自臍帶血的抗原處理過的T細(xì)胞(⑶3+CD5+)和⑶3+T ;源自胸腺的雙陰性的T細(xì)胞(CD3+CD4TD8_)和雙陽性的T細(xì)胞(⑶3+⑶4+CD8+)，它們用于這些實(shí)驗(yàn)中。在前面 (第I. 3. 3部分)已經(jīng)描述了從各種淋巴組織分離各種原代淋巴樣細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，使用源自骨髓的CD34+CD15+骨髓單核祖細(xì)胞替代CD14陽性的單核細(xì)胞。4. 3. 2.用于WTM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于WTM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程類似于用于KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程(參見第4. I. 2部分)，但是培養(yǎng)基不同。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的雜交培養(yǎng)基由 235mM 山梨糖醇、I. 8mM KH2PO4、O. 5mM CaCl2、O. 3mM Mg(C2H3O2)2 和 O. 25mM Ca(C2H3O2)2(Sigma)組成，并補(bǔ)加了 O. 3% BSA。使用完全如第4. 2. 2部分所述的電規(guī)程，生產(chǎn)WTM。在第4. I. 2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細(xì)胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4. 3. 3. WTM跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)CD標(biāo)記物的表汰從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、1個(gè)原代T細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞確立的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系確立了源自I個(gè)WIL2NS細(xì)胞、I個(gè)原代T細(xì)胞和I個(gè)單核細(xì)胞的細(xì)胞雜交的WTM 細(xì)胞系。在已經(jīng)在正常條件(參見第I. I部分)下培養(yǎng)跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析該跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。使用三色FACS分析，以驗(yàn)證源于WIL2NS的⑶19、源于原代單核細(xì)胞的⑶14和源于原代T細(xì)胞的⑶4的共表達(dá)(當(dāng)這些原代T細(xì)胞被用于雜交時(shí))。簡(jiǎn)而言之，以IxlO6細(xì)胞/ml的濃度，將IOOml在含有5% BSA的PBS中的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞懸浮于100 μ I PBS中，并與標(biāo)記的單克隆抗體(O. 5mg/100ml CD14_PerCP、
O.25mg/100ml CD4-PE和 I. 0mg/100ml CD19-FITC，都來自 BD Pharmingen)或適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照在4°C溫育30min。在用PBS徹底洗滌以后，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest Pro軟件,分析標(biāo)記的細(xì)胞。WTM跨譜系三雜交細(xì)胞的FACS概況示于圖14。盡管源自無限增殖細(xì)胞的⑶19標(biāo)記物在跨譜系三雜交細(xì)胞群體中的表達(dá)水平似乎是一致的，但源于原代細(xì)胞的標(biāo)記物的表達(dá)似乎是變化的。在該具體實(shí)施例中，基于CD14和CD4表達(dá)強(qiáng)度，可以將細(xì)胞群體分成3個(gè)亞群(i)CD4HCD14L ； (ii)CD4HCD14H ； (iii) CD4LCD14H。隨后，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如 FACS、MACS 或單細(xì)胞克隆等，可以分離這些群體中的每一個(gè)，并增殖成單獨(dú)的跨譜系三雜交體培養(yǎng)物， 它們形成彼此不同的表型特征，同時(shí)維持在培養(yǎng)物中的同質(zhì)性。從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、1個(gè)原代抗原處理過的T細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞確立的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系
當(dāng)使用⑶5+抗原處理過的T細(xì)胞來產(chǎn)生WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系時(shí)，通過使用三色FACS分析，驗(yàn)證⑶5與⑶19和⑶14并行的表達(dá)。該規(guī)程與上面所述的規(guī)程基本上相同， 但是采用小鼠抗-人⑶19-PE和小鼠抗-人⑶5-FITC抗體替代小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶4-PE抗體。這些⑶在跨譜系三雜交細(xì)胞上的表達(dá)的FACS概況示于圖15。分析表明，盡管源自無限增殖細(xì)胞且負(fù)責(zé)B細(xì)胞表型的CD19表達(dá)水平在細(xì)胞群體的約91-99% 中似乎是一致的，但源自抗原處理過的T細(xì)胞的⑶5和源自原代單核細(xì)胞的⑶14的表達(dá)， 在WMT雜交細(xì)胞中存在差異。僅63%的⑶19陽性細(xì)胞也是⑶5陽性的，且79%的⑶19陽性細(xì)胞是CD14陽性的。值得注意的是，在這樣的WMT跨譜系三雜交細(xì)胞中，CD14表達(dá)水平從低到高變化。另一方面，所述細(xì)胞群體明顯地分成⑶5+和⑶5_跨譜系三雜交細(xì)胞。從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、1個(gè)原代細(xì)胞毒性T細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞確立的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系當(dāng)使用細(xì)胞毒性的CD8陽性的T細(xì)胞來產(chǎn)生WTM跨譜系三雜交體系時(shí)，使用與在本部分前面所述相同的三色標(biāo)記規(guī)程，進(jìn)行FACS分析來驗(yàn)證⑶19、⑶8和⑶14的共表達(dá)。 圖16顯示了⑶19、⑶8和⑶14在該WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系的細(xì)胞上的表達(dá)的FACS概況。 ⑶19的表達(dá)和它的水平在這些WMT跨譜系三雜交細(xì)胞中保持恒定，而這些細(xì)胞中僅46%在低水平共表達(dá)源自原代細(xì)胞毒性T細(xì)胞的⑶8，且41%共表達(dá)源自原代單核細(xì)胞的⑶14。 值得注意的是，這些WMT細(xì)胞中的CD14表達(dá)水平從低到高變化。從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、I個(gè)原代雙陽性的T細(xì)胞和I個(gè)原代單核細(xì)胞確立的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系當(dāng)使用源自胸腺的雙CD陽性的T細(xì)胞(CD4+CD8+)來產(chǎn)生WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系時(shí)，除了分析⑶19、⑶8和⑶14表達(dá)以外，還分析⑶4和⑶8共表達(dá)。圖17顯示了⑶4 和CD8在跨譜系三雜交細(xì)胞系的細(xì)胞上的共表達(dá)的FACS概況。在該使用雙陽性的T細(xì)胞的情況下，96%的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞是⑶4和⑶8陽性的。⑶19和⑶14在源自⑶4+⑶8+ 陽性的T細(xì)胞的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞上的表達(dá)概況，與源自細(xì)胞毒性的CD8陽性的效應(yīng) T細(xì)胞的那些WTM跨譜系三雜交細(xì)胞基本上類似。從I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)、I個(gè)原代T細(xì)胞和I個(gè)原代骨髓單核祖細(xì)胞確立的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系當(dāng)使用源自骨髓的⑶34+CD15+骨髓單核細(xì)胞來產(chǎn)生WTM跨譜系三雜交細(xì)胞系時(shí)， 分析了 CD 19 (B譜系)、CD3 (T譜系)、CD15 (髓譜系)和CD34 (祖細(xì)胞)的表面標(biāo)記物。簡(jiǎn)而言之，用小鼠抗-人CD19-PE、小鼠抗-人CD4-FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD15_PerCP 抗體的組合，或用小鼠抗-人⑶34-PE、小鼠抗-人⑶4-FITC和小鼠抗-人⑶15-PerCP抗體的組合，標(biāo)記該WMT跨譜系三雜交細(xì)胞系的細(xì)胞。根據(jù)前面(第I. 3. 3. I. I部分)所述的規(guī)程，進(jìn)行細(xì)胞染色。源于CD34+CD15+骨髓單核祖細(xì)胞的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞的典型表達(dá)概況示于圖18。分析表明，大約81%的WTM跨譜系三雜交細(xì)胞共享B譜系和骨髓單核細(xì)胞表型(CD19+CD15+)，且61 %的CD19+也是CD4T譜系標(biāo)記物陽性的。34%的CD4+跨譜系三雜交細(xì)胞也在它們的表面上保持⑶34，且68%的⑶34+三雜交細(xì)胞表達(dá)⑶15。令人感興趣地，28%的⑶34+跨譜系三雜交細(xì)胞不保留⑶15的表達(dá)，即使⑶34和⑶15來自相同來源(骨髓單核祖細(xì)胞)。4. 4.從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)原代淋巴樣T細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜合體——KffT通過I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)、I個(gè)無限增殖的B淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和 I個(gè)原代人T細(xì)胞的細(xì)胞雜交，產(chǎn)生這類跨譜系三雜交體生產(chǎn)。這類跨譜系三雜交體被稱作 KWT繼之以系列號(hào)。4. 4. I.用于KWT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在第4. I. I部分中已經(jīng)描述了用于這些細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)的K562和WIL2NS細(xì)胞的制備。在細(xì)胞雜交之前，使用在第1.1.1部分中所述的規(guī)程序，確立表現(xiàn)出最高增殖速率的每個(gè)細(xì)胞類型的穩(wěn)定克隆。在某些實(shí)施方案中，使用如在第I. I. 3部分中描述的CD71+-富集的細(xì)胞群體。在其它實(shí)施方案中，使用如在第I. 1.3. I部分中所述選擇的CD71+-富集的K562群體的⑶15+細(xì)胞。用于產(chǎn)生KWT跨譜系三雜交體的原代細(xì)胞包括源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的輔助T細(xì)胞(CD4+);源自脾、外周血、臍帶血和胸腺的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CD8+);抗原處理過的源自臍帶血的T細(xì)胞(CD3+CD5+)和CD3+T細(xì)胞；源自胸腺的雙陰性的 T細(xì)胞(CD3+CD4_CD8_)和雙陽性的T細(xì)胞(⑶3+⑶4+⑶8+)，它們用于這些實(shí)驗(yàn)中(參見第I. 3 部分)。 4. 4. 2.用于KWT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于KWT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程類似于KMW跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程(參見第4. I. 2部分)。4. 4. 3. KffT跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)CD標(biāo)記物的表汰從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)、I個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和I個(gè)原代T細(xì)胞確立的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞系確立了源自I個(gè)K562細(xì)胞、I個(gè)WIL2NS細(xì)胞和I個(gè)原代T細(xì)胞的細(xì)胞雜交的KWT 細(xì)胞系。在已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件下穩(wěn)定跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。使用三色FACS分析，以鑒別源于K562的 ⑶15、源于WIL2NS的⑶19和源于原代效應(yīng)T輔助細(xì)胞的⑶4的共表達(dá)。用于KWT跨譜系三雜交細(xì)胞的細(xì)胞染色的規(guī)程與關(guān)于KMW跨譜系三雜交體所述的規(guī)程(部分4. I. 3)基本上相同。源自⑶4+效應(yīng)T細(xì)胞的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞的FACS概況示于圖19。大部分KWT 跨譜系三雜交細(xì)胞表現(xiàn)出骨髓單核譜系、B淋巴譜系和T淋巴譜系的混合表型特征。100% 的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)⑶4 (即T淋巴譜系的標(biāo)記物)，其源自原代效應(yīng)T細(xì)胞，而這些細(xì)胞中的54%同時(shí)是B譜系標(biāo)記物⑶19 (其源自無限增殖的細(xì)胞WIL2NS 系)陽性的，且這些⑶4+CD19+細(xì)胞中的24%是⑶15 (其源自無限增殖的骨髓單核祖細(xì)胞系K562)陽性的。從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)、無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和I個(gè)雙陽性的T細(xì)胞確立的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞系當(dāng)使用雙陽性的T細(xì)胞(CD4+⑶8+細(xì)胞)來產(chǎn)生KWT跨譜系三雜交體系時(shí)，也分析了源自原代胸腺細(xì)胞的CD4和CD8的表達(dá)概況。用于CD概況分析的規(guī)程與上面關(guān)于源自 CD4+T細(xì)胞的KWT跨譜系三雜交體所述的規(guī)程基本上相同，但是使用小鼠抗-人CD8-FITC 抗體替代小鼠抗-人CD19-FITC抗體。源自雙陽性的(CD4+CD8+)T細(xì)胞的跨譜系三雜交細(xì)胞的典型CD表達(dá)概況示于圖20。結(jié)果表明，99%的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞是CD4+陽性的，且69 %是⑶8陽性的，26 %的⑶4+細(xì)胞是⑶15骨髓單核細(xì)胞標(biāo)記物陽性的，且23 %的⑶8+ 細(xì)胞是CD15陽性的，這意味著，CD4+CD8+CD15+細(xì)胞占總細(xì)胞群體的大約23% (因?yàn)閹缀?100%的細(xì)胞是⑶4+，雙陽性的⑶8+⑶15+群體也是⑶4陽性的)。象在源自⑶4+效應(yīng)T細(xì)胞的KWT三雜交體中一樣，⑶19+細(xì)胞占總細(xì)胞群體的52 %，它們中的22 %共表達(dá)⑶15。因而，整個(gè)⑶15+細(xì)胞群體共表達(dá)⑶4、⑶8和⑶19，意味著22-23%。從I個(gè)無限增殖的髓樣細(xì)胞(K562)、無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和⑶5陽性的抗原處理過的T細(xì)胞確立的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞系當(dāng)使用⑶5陽性的抗原處理過的T細(xì)胞來產(chǎn)生KWT跨譜系三雜交體系時(shí)，分析了 CD5的表達(dá)。除了在小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5抗體之間的熒光綴合物的顛倒 (reversion)以外，使用與分析WTM跨譜系三雜交體所用相同的規(guī)程(部分4. 6),用小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶5-PE抗體標(biāo)記KWT雜交細(xì)胞。在圖21中所示的結(jié)果表明，90%的KWT跨譜系三雜交細(xì)胞是⑶5 (源自抗原處理過的T細(xì)胞)陽性的，且49%的⑶5 細(xì)胞也是⑶19(源于WIL2NS細(xì)胞(B細(xì)胞))陽性的。⑶19+細(xì)胞在跨譜系三雜交細(xì)胞中的總百分比是約56%。4. 5.從2個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和I個(gè)原代單核細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體-WWM通過2個(gè)無限增殖的淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和I個(gè)原代人單核細(xì)胞的體細(xì)胞雜交， 產(chǎn)生這類跨譜系三雜交體生產(chǎn)?？缱V系三雜交體被標(biāo)記為WWM繼之以系列號(hào)。4. 5. I.用于WWM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備以與在第4. I. I部分中所述相同的程序，培養(yǎng)WIL2NS細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，使用如在第I. I. 3部分中所述確立的⑶71+-富集的細(xì)胞群體。從源自脾、外周血或臍帶血的混合淋巴細(xì)胞，分離出人單核細(xì)胞。單核細(xì)胞的分離基于 ⑶14標(biāo)記物的表達(dá)，和在有些情況下，基于⑶16的低表達(dá)水平(FACS或磁珠)，如前面在第
1.3.3. I. I部分中所述。當(dāng)使用來自不同淋巴組織的單核細(xì)胞時(shí)，雜交參數(shù)或得到的跨譜系三雜交體似乎沒有差異。4. 5. 2.用于WWM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于WWM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程與用于KBT跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程(參見第4. 2. 2部分)類似。4. 5. 3. WWM跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)CD標(biāo)記物的表汰在已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件(參見第I. I部分)下穩(wěn)定WffT跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。施加小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶14-PE抗體的雙重染色或標(biāo)記，以描繪得到的跨譜系三雜交體的跨譜系標(biāo)記物表達(dá)。圖22a顯示了這樣的跨譜系三雜交細(xì)胞的典型CD概況。癌基因-關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物CD19的表達(dá)似乎在跨譜系三雜交細(xì)胞中是恒定的。 盡管一些部分的細(xì)胞(23. 5%)在它們的表面上確實(shí)表達(dá)⑶14，但剩余的72. 7%是⑶14表面表達(dá)陰性的。4.6.使用非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞的跨譜系三雜交體生產(chǎn)下面的實(shí)施例表明，使用除了人細(xì)胞以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(具體地，小鼠細(xì)胞)，可以產(chǎn)生跨譜系三雜交體。應(yīng)當(dāng)理解，相同的原理可以用于從其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交體。4. 6. I.從I個(gè)無限增殖的小鼠淋巴樣細(xì)胞、I個(gè)原代小鼠淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)原代
小鼠單核細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體本部分描述了從I個(gè)無限增殖的小鼠B淋巴樣細(xì)胞(Sp2)、1個(gè)原代小鼠T細(xì)胞和 I個(gè)原代小鼠單核細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交細(xì)胞系。該跨譜系三雜交體系被標(biāo)記為STmMm繼之以系列號(hào)。4. 6. I. I.用于STmMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在前面在第11. 4部分中描述了用于產(chǎn)生STmMm跨譜系三雜交體的Sp2細(xì)胞的制備。在這些實(shí)驗(yàn)中使用原代小鼠細(xì)胞，包括源自外周血的CDllb+CD90-B22(TCD49b-NKl. FL y6G_/ffi單核細(xì)胞；源自脾或外周血的小鼠輔助T細(xì)胞(CD4+);源自脾或外周血的小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞(⑶8+);和源自脾或外周血的雙陽性的T細(xì)胞(⑶4+CD8+)。在前面(第I. 3. 5部分)已經(jīng)描述了從脾和外周血分離各種原代小鼠淋巴樣細(xì)胞。4. 6. 1.2.用于STmMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于STmMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程類似于用于WTM跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程(參見部分4. 3. 2)，但是培養(yǎng)基和AC電場(chǎng)和脈沖不同。也就是說，在這些實(shí)驗(yàn)中使用的雜交培養(yǎng)基由265mM山梨糖醇、I. 5mM KH2PO4、O. 4mM CaCl2和O. 3mM Mg(C2H3O2)2(Sigma)組成，補(bǔ)加了 O. 2% BSA0 同時(shí)施加 O. 5MHz 和 65_75kV/m 的 AC 場(chǎng)，其具有3秒間隔的3個(gè)矩形脈沖串，每個(gè)矩形脈沖具有70 μ sec的脈沖寬度和250_280kV/m的強(qiáng)度。在第4. I. 2部分中描述了該新形成的跨譜系三雜交細(xì)胞的穩(wěn)定系的回收和確立的規(guī)程。4. 6. I. 3. STmMm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)確立了源自I個(gè)Sp2細(xì)胞、I個(gè)原代小鼠T細(xì)胞和I個(gè)小鼠單核細(xì)胞的細(xì)胞雜交的STmMm細(xì)胞系。在已經(jīng)在正常條件(參見第I. I部分)下培養(yǎng)跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。使用三色FACS分析，以驗(yàn)證源于Sp2細(xì)胞的⑶138、源于原代小鼠單核細(xì)胞的⑶IIb和源于原代小鼠T細(xì)胞的CD4的共表達(dá)(當(dāng)這些原代T細(xì)胞用于雜交時(shí))。簡(jiǎn)而言之，以IxlO6細(xì)胞/ml的濃度，將100 μ I在含有5% BSA的PBS中的STmMm 跨譜系三雜交細(xì)胞懸浮于100 μ I PBS中，并與標(biāo)記的針對(duì)小鼠⑶138-ΡΕ、⑶I Ib-FITC和 OM-PerCP的大鼠單克隆抗體(BD Pharmingen)或適當(dāng)同種型對(duì)照一起在4°C溫育30min。 在用PBS徹底洗滌以后，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest Pro軟件，分析標(biāo)記的細(xì)胞。STmMm跨譜系三雜交細(xì)胞的FACS概況示于圖47。盡管⑶138 (即源自B譜系無限增殖細(xì)胞的標(biāo)記物)的表達(dá)水平在跨譜系三雜交細(xì)胞群體中似乎是一致的，源于原代細(xì)胞的標(biāo)記物的表達(dá)似乎是不同的。在該具體實(shí)施例中，存在相對(duì)較小百分比的不共表達(dá)CD4 或⑶I Ib之一與⑶138的細(xì)胞(參見圖47a和b)。當(dāng)分析STmMm細(xì)胞的⑶4和⑶I Ib的共表達(dá)時(shí)(參見圖47c)，大約82%的細(xì)胞共表達(dá)。實(shí)際上，細(xì)胞群體中的82%表達(dá)所有3個(gè) ⑶標(biāo)記物，僅5%的細(xì)胞是⑶138陽性的，不共表達(dá)⑶4或⑶Ilb之一。隨后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如FACS、MACS或單細(xì)胞克隆等，可以分離這些不同群體中的每一個(gè)，并增殖成單獨(dú)的跨譜系三雜交體培養(yǎng)物,它們形成彼此不同的表型特征，同時(shí)維持在培養(yǎng)物中的同質(zhì)性。當(dāng)使用細(xì)胞毒性的⑶8陽性的淋巴細(xì)胞來產(chǎn)生STmMm三雜交體時(shí)，使用大鼠抗-小鼠⑶8-PerCp抗體替代抗-⑶4-PerCp，用于在得到的三雜交細(xì)胞上共表達(dá)⑶。如從圖48可見，97-100%的三雜交細(xì)胞是⑶138陽性的(圖48a和b)，同時(shí)這些細(xì)胞中的56% 或57%共表達(dá)⑶8 (圖48b)或⑶I Ib (圖48a)。三雜交體群體中的至少40%表達(dá)所有3種標(biāo)記物 CD 138、CD8 和 CDllb (圖 48c)。在雙陽性的CD4+CD8+T細(xì)胞的情況下，以與細(xì)胞毒性T細(xì)胞相同的方式進(jìn)行第一次分析。圖49顯示了得到的三雜交體上的⑶138、⑶Ilb和⑶8表達(dá)的FACS概況。98-100% 的三雜交細(xì)胞是⑶138陽性的，整個(gè)群體中的57-60%是所有3個(gè)譜系標(biāo)記物陽性的(圖 49c)。在93%的細(xì)胞上，檢測(cè)到⑶138和⑶8的共表達(dá)(圖49b)。在第二步中，檢查三雜交細(xì)胞的⑶8和⑶4的共表達(dá)。用大鼠抗-小鼠⑶8-PE和大鼠抗-小鼠⑶4-FITC抗體(BD Pharmingen)標(biāo)記細(xì)胞。圖50顯示了⑶8和⑶4表達(dá)的FACS概況。盡管95%的三雜交細(xì)胞在表面上表達(dá)⑶8，但僅50%的細(xì)胞同時(shí)共表達(dá)⑶4。值得注意的是，實(shí)際上整個(gè)⑶4陽性群體也是⑶8陽性的。4. 6. 2.從2個(gè)無限增殖的小鼠淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)原代小鼠單核細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系三雜交體本實(shí)施例詳述了從2個(gè)無限增殖的小鼠B淋巴樣細(xì)胞(Sp2)和I個(gè)原代小鼠單核細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交細(xì)胞系。跨譜系三雜交體系被標(biāo)記為SSMm繼之以系列號(hào)。4. 6. 2. I.用于SSMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在前面在第I. I. 4部分中描述了用于產(chǎn)生SSMm跨譜系三雜交體的Sp2細(xì)胞的制備。在這些實(shí)驗(yàn)中使用源自外周血的原代小鼠CDllb+CD90-B220XD49b-NKl. rLy6G-/ffi單核細(xì)胞。在前面(第I. 3. 5部分)已經(jīng)描述了從外周血分離原代小鼠單核細(xì)胞。4. 6. 2. 2.用于SSMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于SSMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程與用于STmMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程相同(參見第4. 6. I. 2部分)。4. 6. 2. 3. SSMm跨譜系三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)在已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件(參見第11部分)下穩(wěn)定SSMm跨譜系三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠CDllb-FITC抗體(BD Pharmingen) 的雙重染色或標(biāo)記，以描繪得到的跨譜系三雜交體的跨譜系標(biāo)記物表達(dá)。圖51顯示了這樣的跨譜系三雜交細(xì)胞的典型CD概況。癌基因-關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物CD138的表達(dá)似乎在跨譜系三雜交細(xì)胞中是恒定的，僅7%的細(xì)胞是CD138陰性的。大部分細(xì)胞(70%)確實(shí)也在它們的表面上表達(dá)⑶11b，盡管剩余的23%的⑶138陽性的細(xì)胞是⑶IIb表面表達(dá)陰性的。4.7.使用人和非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系嵌合三雜交體本實(shí)施例詳述了使用人和非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞(具體地，小鼠)產(chǎn)生跨譜系嵌合三雜交體。應(yīng)當(dāng)理解，相同的原理可以用于從其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系三雜交體。4. 7. I.從I個(gè)無限增殖的小鼠淋巴樣細(xì)胞、I個(gè)無限增殖的人淋巴樣細(xì)胞和I個(gè)原代小鼠或人單核細(xì)胞生產(chǎn)跨譜系嵌合三雜交體從I個(gè)無限增殖的小鼠B淋巴樣細(xì)胞(Sp2)、l個(gè)無限增殖的人B淋巴樣細(xì)胞(WIL2NS)和I個(gè)原代小鼠或人單核細(xì)胞產(chǎn)生跨譜系嵌合的三雜交細(xì)胞系。跨譜系三雜合體系被標(biāo)記為SWMm (在使用小鼠單核細(xì)胞的情況下)和SWMh (在使用人單核細(xì)胞的情況下)。 在每個(gè)情況下，三雜交體的縮寫名稱后面跟著系列號(hào)。4. 7. 1.1.用于SWMm和SWMh跨譜系嵌合三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞制備在前面在第I. I. 4部分和第I. I. 3部分中，分別描述了用于產(chǎn)生SWMm和SWMh跨譜系嵌合三雜交體的Sp2和WIL2NS細(xì)胞的制備。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用源自外周血的原代小鼠CDllb+CD90_B220_CD49b_NKl. rLy6GVffi單核細(xì)胞。在前面(第I. 3. 5部分)已經(jīng)描述了從外周血分離原代小鼠單核細(xì)胞。從源自脾、外周血或臍帶血的混合淋巴細(xì)胞，分離出人單核細(xì)胞。單核細(xì)胞的分離基于CD14標(biāo)記物的表達(dá)，和在有些情況下，基于CD16的低表達(dá)水平(FACS或磁珠)，如前面在第I. 3. 3. I. I部分中所述。當(dāng)使用來自不同淋巴組織的單核細(xì)胞時(shí)，雜交參數(shù)或得到的跨譜系三雜交體似乎沒有差異。4. 7. 1.2.用于SWMm和SWMh跨譜系嵌合三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程用于SWMm和SWMh跨譜系三雜交體生產(chǎn)的細(xì)胞雜交規(guī)程與用于STmMm跨譜系三雜交體生產(chǎn)的規(guī)程相同(參見第4. 6. I. 2部分)。4. 7. I. 3. SWMm和SWMh跨譜系嵌合三雜交體狀態(tài)的確認(rèn)在已經(jīng)在正常培養(yǎng)條件(參見第I. I部分)下穩(wěn)定SWMm和SWMh跨譜系嵌合的三雜交細(xì)胞系6個(gè)月以后，分析跨譜系嵌合的三雜交細(xì)胞群體的譜系特異性的CD標(biāo)記物的表達(dá)。針對(duì)人CD71和小鼠TfR的表達(dá)進(jìn)行雙染色，以確立得到的三雜交體的嵌合狀態(tài)。 圖52顯示了這樣的分析的典型FACS概況，100%的細(xì)胞是人和小鼠運(yùn)鐵蛋白受體陽性的。 這指示三雜交體對(duì)小鼠和人細(xì)胞分裂控制的依賴性。依賴于原代單核細(xì)胞的小鼠或人來源，施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠 CDllb-FITC 抗體(BD Pharmingen)或大鼠抗-小鼠 CD138-PE 和小鼠抗-人 CD14-FITC 抗體(BD Pharmingen)的雙重染色或標(biāo)記，以描繪得到的跨譜系嵌合三雜交體的跨譜系標(biāo)記物表達(dá)。圖53顯示了這樣的跨譜系嵌合三雜交細(xì)胞的典型CD概況。癌基因-關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物CD138(源自小鼠Sp2細(xì)胞系)的表達(dá)似乎依賴于單核細(xì)胞的小鼠或人來源。小鼠CD138 陽性的細(xì)胞的百分比從在SWMm三雜交體中的84%下降至在SWMh三雜交體中的29%。但是，96%的SWMh嵌合的三雜交細(xì)胞是人CD19(源自WIL2NS)陽性的(參見圖54)，而在SWMm 嵌合的三雜交體中的細(xì)胞都不表達(dá)人CD19。實(shí)施例55.基于CD標(biāo)記物的分布來富集具有特定跨譜系表型的細(xì)胞的跨譜系三雜交體下面的部分提供了基于不同的表型特征來確立跨譜系三雜交細(xì)胞系的亞系的實(shí)施例。所述方法基于譜系特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記物的分析、譜系特異性的標(biāo)記物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、譜系特異性的標(biāo)記物的RNA轉(zhuǎn)錄物的存在、核型分析和/或譜系特異性的蛋白的分泌。通過FACS，從一般群體分離出具有希望的特征的跨譜系三雜交細(xì)胞。下面的實(shí)施例基于WWM跨譜系三雜交體，其具有2個(gè)基于CD14表達(dá)(陽性的和陰性的)的三雜交體群體。 但是，該實(shí)施例絕不限于選擇的特定跨譜系三雜交體或標(biāo)記物。將WWM跨譜系三雜交細(xì)胞分選成CD14陽性的和CD14陰性的級(jí)分，增殖每個(gè)級(jí)分， 并單獨(dú)地維持培養(yǎng)3個(gè)月。圖22b表明，超過95%的跨譜系三雜交細(xì)胞保持⑶14表達(dá)，而圖22c中的細(xì)胞群體繼續(xù)是CD14陰性的。這表明，可能分離和確立源自相同跨譜系三雜交體系的不同的同質(zhì)細(xì)胞群體。通討RT-PCR確認(rèn)跨譜系三雜奪體為了驗(yàn)證產(chǎn)生的亞系的跨譜系三雜交體性質(zhì)，對(duì)原始的跨譜系三雜交細(xì)胞, ⑶19+CD14+富集的傳代培養(yǎng)物和⑶14陰性的傳代培養(yǎng)物進(jìn)行關(guān)于⑶14的RT-PCR測(cè)定。使用人CD14+單核細(xì)胞作為陽性對(duì)照。使用在前面(第I. 3. 3部分)描述的FACS，從外周血分離對(duì)照細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，使用RNeasy試劑盒(RNeasy Mini kit, Qiagen),從培養(yǎng)的細(xì)胞制備總 RNA。根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，使用cDNA-Kit (Amersham Pharmacia),進(jìn)行cDNA合成,且基本上如Sewing等人所述,進(jìn)行PCR。通過瓊脂糖凝膠(2% )電泳,分析PCR反應(yīng)混合物,并通過溴化乙錠染色來顯影。寡核苷酸引物對(duì)具有序列5，-引物 5，-CACACTCGCCTGCCTTTTCC-3，(SEQ ID NO 1)和3，-引物 5，GATTCCCGTCCAGTGTCAGG-3’ (SEQ ID NO 2)用于擴(kuò)增450bp的PCR產(chǎn)物。如圖23所示，RT-PCR揭示CDHmRNA轉(zhuǎn)錄物在含有細(xì)胞的原始WWM培養(yǎng)物中和在原始WWM培養(yǎng)物的CD14+富集的傳代培養(yǎng)物中的存在。在缺少表面CD14的WWM傳代培養(yǎng)物中也檢測(cè)到CD14mRNA，其水平與人CD14+單核細(xì)胞的水平相當(dāng)。實(shí)施例66.核型分析進(jìn)行跨譜系三雜交體的核型分析，以確立跨譜系三雜交體的細(xì)胞發(fā)生特征，并證實(shí)它們的雜交體起源。6. I.原始細(xì)胞系的核型分析作為一個(gè)實(shí)例，對(duì)K562和WIL2NS細(xì)胞系的細(xì)胞的早期傳代和晚期傳代進(jìn)行核型分析，以記錄原始細(xì)胞系的任何染色體不穩(wěn)定性。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于給定的細(xì)胞系，例如K562 系，新鮮解凍的系的核型與在正常培養(yǎng)條件下維持幾個(gè)月的細(xì)胞系的核型相同。圖24和25分別描繪了 K562和WIL2NS細(xì)胞的典型核型。在兩種情況下，在400bphs 檢查到共20個(gè)具有G帶的中期細(xì)胞。核型分析結(jié)果表明，K562細(xì)胞系含有具有三倍體特征的單個(gè)克隆，即具有69染色體的模式數(shù)，具有各種染色體異常。相比而言，WIL2NS細(xì)胞系含有5個(gè)二倍體克隆，具有 47-48的染色體數(shù)目，與K562細(xì)胞相比具有明顯不同的染色體異常。WIL2NS細(xì)胞系中的克隆的表現(xiàn)如下克隆I 占 10%克隆2 占 55%克隆3 占 10%克隆4 占 20%克隆5占5%表2(下面)總結(jié)了 K562和WIL2NS細(xì)胞系的復(fù)雜核型。2個(gè)細(xì)胞系之間沒有共享的異常。用藍(lán)色突出顯示在WIL2NS細(xì)胞系的所有克隆中存在的染色體異常。
6.2.用于蛋白表達(dá)的跨譜系三雜交體的核型分析對(duì)跨譜系三雜交體進(jìn)行了核型分析，所述跨譜系三雜交體源自3個(gè)不同譜系的無限增殖細(xì)胞和原代細(xì)胞的各種組合，并進(jìn)一步用于表達(dá)所需蛋白。還將這些核型與用于產(chǎn)生跨譜系三雜交體的原始無限增殖細(xì)胞系的核型進(jìn)行了對(duì)比。
權(quán)利要求
1.通過雜交下述細(xì)胞而產(chǎn)生的雜交細(xì)胞第一個(gè)細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是干細(xì)胞或源自未定型的祖細(xì)胞的細(xì)胞；源自淋巴共同祖細(xì)胞的第二個(gè)細(xì)胞；和源自淋巴共同祖細(xì)胞的第三個(gè)細(xì)胞，且其中所述第一個(gè)細(xì)胞不是骨髓瘤細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雜交細(xì)胞，其中所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雜交細(xì)胞，其中所述第二個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雜交細(xì)胞，其中所述第二個(gè)細(xì)胞是源自B淋巴譜系的細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是源自T淋巴譜系的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是骨髓單核祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞系，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞顯示至少一種下述CD抗原⑶16、CD15或⑶14。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是單核細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是原代骨髓單核祖細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞源自脾、外周血、臍帶血或骨髓。
12.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是前B細(xì)胞、幼B細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雜交細(xì)胞，其中所述效應(yīng)B細(xì)胞是抗原處理過的B-細(xì)胞或漿細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。
15.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是前T細(xì)胞、幼T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞或效應(yīng)T細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞顯示至少一種下述⑶抗原⑶3、⑶4、⑶5或⑶8。
17.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞是無限增殖化的細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。
20.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自T淋巴譜系的細(xì)胞源自淋巴組織。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的雜交細(xì)胞，其中所述淋巴組織選自外周血、臍帶血、脾、骨髓、胸腺、扁桃體、腺樣體和局部淋巴結(jié)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中至少一個(gè)細(xì)胞是人細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中至少一個(gè)細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自髓共同祖細(xì)胞的細(xì)胞是K562細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雜交細(xì)胞，其中所述第二個(gè)細(xì)胞或所述第三個(gè)細(xì)胞是 WIL2-NS細(xì)胞或M0LT4細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述源自B淋巴譜系的細(xì)胞是 WIL2-NS 細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中源自所述T淋巴譜系的細(xì)胞是 M0LT4細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞， 所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是M0LT4細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞， 所述第二個(gè)細(xì)胞是原代B細(xì)胞,且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人骨髓單核祖細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代人T細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是K562細(xì)胞， 所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代T細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求4所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是原代小鼠T細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的雜交細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是原代人或小鼠單核細(xì)胞，所述第二個(gè)細(xì)胞是WIL2-NS細(xì)胞，且所述第三個(gè)細(xì)胞是SP2細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交細(xì)胞表達(dá)所需蛋白。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交細(xì)胞表達(dá)超過一種所需蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交細(xì)胞表達(dá)2種所需蛋白。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交細(xì)胞表達(dá)3種所需蛋白。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是內(nèi)源蛋白。
42.根據(jù)權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白中的至少一種是內(nèi)源蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求37所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是重組蛋白。
44.根據(jù)權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白中的至少一種是重 組蛋白。
45.根據(jù)權(quán)利要求36-44中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是細(xì)胞因子。
46.根據(jù)權(quán)利要求37-44中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是集落刺激因子。
47.根據(jù)權(quán)利要求37-44中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是白介素。
48.根據(jù)權(quán)利要求37-44或46中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是GM-CSF。
49.根據(jù)權(quán)利要求37-44或47中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是白介素2。
50.根據(jù)權(quán)利要求37-44中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是受體或其片段。
51.根據(jù)權(quán)利要求37-44或50中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是可溶的受體。
52.根據(jù)權(quán)利要求36-44或50中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是人IL-4受體 a鏈。
53.根據(jù)權(quán)利要求36-44或50中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是免疫球蛋白。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的雜交細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白是IgM。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的雜交細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白是IgG。
56.根據(jù)權(quán)利要求37-44或51中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述蛋白是CD54。
57.根據(jù)權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交通過電方法來實(shí)現(xiàn)。
58.根據(jù)權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交通過化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-58中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其進(jìn)一步與表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞雜交。
60.如權(quán)利要求1-58中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交通過雜交3個(gè)個(gè)別細(xì)胞 來實(shí)現(xiàn)。
61.如權(quán)利要求1-58中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交使用3個(gè)細(xì)胞群體來實(shí) 現(xiàn)，其中每個(gè)所述群體包括多個(gè)相同的細(xì)胞類型。
62.根據(jù)權(quán)利要求1-61中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞，其中所述雜交細(xì)胞富含界定特定細(xì) 胞類型的標(biāo)記物，以允許表達(dá)表現(xiàn)出希望的翻譯后修飾或希望的功能性的蛋白。
63.—種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-62中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞的方法，其中所述方法包括 下述步驟雜交第一個(gè)細(xì)胞，其中所述第一個(gè)細(xì)胞是干細(xì)胞或源自未定型的祖細(xì)胞的細(xì)胞；源自淋巴共同祖細(xì)胞的第二個(gè)細(xì)胞；和 源自淋巴共同祖細(xì)胞的第三個(gè)細(xì)胞，且其中所述第一個(gè)細(xì)胞不是骨髓瘤細(xì)胞。
64.一種生產(chǎn)蛋白的方法，所述方法包括下述步驟在根據(jù)權(quán)利要求1-62中任一項(xiàng)所 述的雜交細(xì)胞中表達(dá)蛋白。
65.在根據(jù)權(quán)利要求1-62中任一項(xiàng)所述的雜交細(xì)胞中生產(chǎn)的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及雜交細(xì)胞和用于生產(chǎn)雜交細(xì)胞的方法。具體地，本發(fā)明涉及從至少3個(gè)細(xì)胞的雜交產(chǎn)生的雜交細(xì)胞，其中至少2個(gè)細(xì)胞源自不同的譜系。本發(fā)明另外涉及雜交細(xì)胞用于表達(dá)蛋白的應(yīng)用，所述蛋白可用于多種診斷用途、預(yù)防用途、治療用途和/或研究用途。
文檔編號(hào)C12N5/16GK102612556SQ201080035457
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者G·卡塞科, T·L·馬哈沃拉西爾帕 申請(qǐng)人:Bts研究國際股份有限公司