雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的單克隆抗體與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體與應(yīng)用，特別 是設(shè)及口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株W 及該抗體在檢測(cè)口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄 動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，最易感染的動(dòng)物是牛、豬、駱駝、羊、鹿等，野豬、野牛 等野生動(dòng)物也易感染此病?？谔阋咴趤喼?、非洲和中東W及南美均有流行，在非流行區(qū)也有 散發(fā)病例。
[0003] 口蹄疫發(fā)病后一般不致死，但會(huì)使病獸的口、蹄部出現(xiàn)大量水瘤，高燒不退，使實(shí) 際畜產(chǎn)量銳減。另外，有個(gè)別口蹄疫病毒的變種可傳染給人。因此，每次爆發(fā)后只能屠宰和 集體焚毀染病牲畜W絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè) 的"頭號(hào)殺手"。我國(guó)對(duì)口蹄疫的預(yù)防主要通過(guò)疫苗注射接種，發(fā)生口蹄疫的則捕殺。
[0004]FMDV的免疫是依賴T細(xì)胞的口蹄疫病毒（FMDV)目前有0、A、C、SATl、SAT2、 SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型）和Asial(亞洲1型）7個(gè)血清型。各型之間幾乎沒 有免疫保護(hù)力，感染了一型口蹄疫的動(dòng)物仍可感染另一型口蹄疫病毒而發(fā)病，因此常常用 多價(jià)疫苗來(lái)降低患口蹄疫的風(fēng)險(xiǎn)。FMDV屬于小RNA病毒科（Picornaviridae) 口瘡病屬 (Aphthovirus),是偶蹄類動(dòng)物高度傳染性疾?。谔阋撸┑牟≡?。在病毒的中屯、為一條單 鏈的正鏈RNA，由大約8000個(gè)堿基組成，是感染和遺傳的基礎(chǔ)；周圍包裹著的蛋白質(zhì)決定了 病毒的抗原性、免疫性和血清學(xué)反應(yīng)能力；病毒外殼為對(duì)稱的20面體。口蹄疫0型毒株是 國(guó)內(nèi)流行較廣的一類亞型，其中，口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒是口蹄疫0型的一個(gè) 毒株。0/Mya98/XJ/2010株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，屬于東南亞拓?fù)湫停⊿EA)Mya-98譜 系，該毒株在BHK21細(xì)胞上遺傳穩(wěn)定，免疫原性好，疫苗的交叉保護(hù)性高，每毫升抗原表達(dá) 量可達(dá)2微克W上，每毫升TCI^。可達(dá)10 7'5W上。
[0005] 疫苗接種是特異性預(yù)防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功預(yù)防、控 制乃至最終消滅FMDV的先決條件。FMDV弱毒疫苗和滅活疫苗等常規(guī)疫苗都具有良好的免 疫原性，在預(yù)防和控制FMDV的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， FMDV基因工程疫苗如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成膚疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、 活載體疫苗、核酸疫苗等不斷涌現(xiàn)。目前，常見的是口蹄疫多種毒株制備的多價(jià)疫苗，如口 蹄疫0型（0/GX/09-7)和口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)混合制備成的雙組份疫苗。疫苗 生產(chǎn)企業(yè)目前常采用薦糖密度梯度離屯、法測(cè)量口蹄疫病毒的含量，但是無(wú)法對(duì)多組份疫苗 的某種毒株進(jìn)行單獨(dú)定量。
[0006] 基于抗原抗體的免疫學(xué)檢測(cè)，因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備便宜等 優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛使用在臨床檢測(cè)上。目前，市場(chǎng)上偶見能夠檢測(cè)口蹄疫抗原的酶聯(lián)免疫 檢測(cè)試劑盒，但是大都采用了多克隆抗體制成，如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所開發(fā)、 生產(chǎn)的O型口蹄疫146S抗原定量化ISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒已經(jīng)申報(bào)專利（申請(qǐng)公布 號(hào)CN103076451A)，該試劑盒采用了O型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清兩種多克隆抗體 制成，但是無(wú)法區(qū)分O型的不同毒株，如細(xì)甸98株（0/Mya98/BY/2010株）和廣西株（0/ GX/09-7株），因而就無(wú)法對(duì)多組份0型疫苗中的每種0型口蹄疫146S抗原進(jìn)行單獨(dú)定量， 其主要的原因就在于多克隆抗體針對(duì)多種抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的 不同毒株之間存在相同的抗原表位。因此，采用多克隆抗體去特異性檢測(cè)口蹄疫不同的毒 株是不可能成功的，尤其是同一血清型不同的毒株。
[0007] 單克隆抗體因其針對(duì)的抗原位點(diǎn)單一，特異性較好，并且生產(chǎn)的重復(fù)性優(yōu)于多克 隆抗體，目前在很多臨床檢測(cè)中被采用。國(guó)內(nèi)偶見有制備口蹄疫單克隆抗體的研究，但尚未 見到用于特異性檢測(cè)口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的單克隆抗體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的雜交 瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0009] 本發(fā)明W口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒為免疫原免疫小鼠，獲得持續(xù)、穩(wěn)定 分泌抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為1F2,該 細(xì)胞株已于2015年06月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保 藏編號(hào)為CGMCCNo. 10896。
[0010] 由雜交瘤細(xì)胞株1F2分泌的單克隆抗體命名為lF2anti，來(lái)源于小鼠屬小鼠（Mus mus州Ius)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] lF2anti的重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?表中SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且可與 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒特異結(jié)合的多膚，輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQID No: 2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQIDNo: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基 酸殘基的取代、缺失或添加且可與口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒特異結(jié)合的多膚。
[0012] 序列表中的SEQIDNo:1由113個(gè)氨基酸殘基組成，序列表中的SEQIDNo:2由 98個(gè)氨基酸殘基組成。
[0013]編碼單克隆抗體lF2anti的基因（lF2anti)，其重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表 中SEQIDNo:3的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可 與序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列雜交的核巧酸序列，其輕鏈可變區(qū)編碼基因具有 序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條 件下可與序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列雜交的核巧酸序列；
[0014] 所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.IXSS陽(yáng)（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C條件下 雜交并洗膜。
[0015] 序列表中的SEQIDNo:3由339個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo:1的 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQIDNo:4由294個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中 SEQIDNo:2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0016] 含有本發(fā)明基因lF2anti的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0017] 擴(kuò)增本發(fā)明基因lF2anti中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 獲得本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株1F2的方法，可包括W下步驟：
[0019] 1)用口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒作為免疫原免疫動(dòng)物；
[0020] 2)分離免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤；
[0021] 3)篩選雜交瘤細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞株1F2。
[0022] 獲得本發(fā)明單克隆抗體lF2anti的方法，在上述步驟的基礎(chǔ)上增加W下步驟：
[0023] 4)從雜交瘤細(xì)胞株1F2的培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞株1F2的動(dòng)物的腹水液中分離 并純化出單克隆抗體lF2anti。
[0024] 在上述方法中，步驟1)中的口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒可為活病毒或滅 活病毒，優(yōu)選為滅活病毒，濃度為10-1000 y g/mL;用于制備單克隆抗體的免疫動(dòng)物可為小 鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠。
[00巧]步驟2)中當(dāng)被免疫動(dòng)物的血清抗體水平達(dá)到峰值時(shí)，可分離動(dòng)物的脾細(xì)胞并制 備成單細(xì)胞懸液。必要時(shí)，可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿ㄈ缇垡叶?醇）的誘導(dǎo)下與骨髓瘤細(xì)胞（優(yōu)選為小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0)融合W形成雜交瘤。
[0026] 步驟3)中可W在選擇性培養(yǎng)基（如HAT培養(yǎng)基）中培養(yǎng)W篩選融合的雜交瘤細(xì) 胞，并進(jìn)一步可使用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽(yáng)性抗性 細(xì)胞株。
[0027] 步驟4)中可于體外（如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中）或體內(nèi)（小鼠腹水） 培養(yǎng)分泌口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒單克隆抗體lF2anti的雜交瘤細(xì)胞株1F2,并 從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化出單克隆抗體lF2anti。
[0028] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種單克隆抗體lF2anti的應(yīng)用，提出口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒的化ISA檢測(cè)方法，該檢測(cè)是用口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒 的單克隆抗體lF2anti作為包被抗體及酶標(biāo)抗體的雙抗夾屯、化ISA檢測(cè)方法。
[0029] 具體來(lái)講，所述雙抗夾屯、ELISA檢測(cè)，可包括W下步驟：
[0030] 1)用單克隆抗體lF2anti包被酶聯(lián)板，封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板；
[0031] 2)加待測(cè)樣品，洗板；
[0032] 3)加辣根過(guò)氧化物酶（HR巧或堿性憐酸醋酶（AL巧標(biāo)記的單克隆抗體lF2anti， 洗板；
[003引 4)加底物顯色；
[0034]W終止反應(yīng)；
[00對(duì) 6)測(cè)定004加值。
[0036] 上述檢測(cè)方法中的反應(yīng)條件及試劑均可按照常規(guī)方法進(jìn)行選擇。
[0037] 步驟3)中單克隆抗體lF2anti的標(biāo)記酶優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶，可通過(guò)戊二醒法 或過(guò)艦酸法將酶交聯(lián)在單克隆抗體lF2anti上。
[0038] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供一種檢測(cè)口蹄疫0型（0/Mya98/BY