一株抗萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一株抗萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，設(shè)及雜交瘤細(xì)胞株2A1及其 分泌產(chǎn)生的抗萬古霉素單克隆抗體，屬于食品安全免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]萬古霉素（VAN)，英文名稱為Vancomycin,是由McCormick等于1956年從一 株?yáng)|方擬無枝酸菌（Amycolatopsisorientalis)的發(fā)酵液中分離得到的一種糖膚類 抗生素，1958年11月份獲美國(guó)抑A批準(zhǔn)，由EliLilly公司開發(fā)上市，商品名為"穩(wěn)可 信（Vancocin)"。鹽酸萬古霉素分子式為Ce化6化成〇24,CAS號(hào)為1404-90-6,分子量為 1485.71。國(guó)內(nèi)由放線菌東方23號(hào)所產(chǎn)生的主要為去甲基萬古霉素（NVAN)，英文名稱為 Norvancomycin，于1967年投入臨床使用。兩者都是用于治療由革蘭氏陽(yáng)性菌所引發(fā)的感 染性疾病。其作用機(jī)制是通過同時(shí)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成中的兩步酶促反應(yīng)，即轉(zhuǎn)糖基 作用(膚聚糖的延伸）和轉(zhuǎn)膚作用(膚鏈的交聯(lián)）或其中的任何一步，達(dá)到阻止細(xì)胞壁合成的 目的，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
[0003] 腎毒性和耳毒性是早前生產(chǎn)的不純的萬古霉素產(chǎn)生的副反應(yīng)，運(yùn)些副反應(yīng)在50 年代中期進(jìn)行的萬古霉素臨床試驗(yàn)中顯得尤其嚴(yán)重。且萬古霉素口服無法吸收，必須在 溶劑稀釋的條件下緩慢給藥，W避免局部疼痛和血栓靜脈炎的發(fā)生，W及一些輸液反應(yīng)如 紅人綜合癥。因此萬古霉素僅作為保留藥物治療由少數(shù)金黃色葡萄球菌引起的嚴(yán)重感染 性疾病。但由于P-內(nèi)酷胺類抗生素的大量使用，導(dǎo)致了甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌 (Methicillin-resistantStaphylococ州Saureus，MRSA)的產(chǎn)生，MRSA成為了地方性流 行性疾病，W及萬古霉素純化工藝的改善，使得萬古霉素成為了治療MRSA的特效藥物。但 在1989年，美國(guó)首次報(bào)道了萬古霉素耐藥菌（Vancomycin-resistantenterococci,VRE)。 預(yù)防和控制萬古霉素耐藥菌的擴(kuò)散需要各方面的協(xié)調(diào)努力。包括臨床醫(yī)生謹(jǐn)慎使用萬古霉 素，及早的檢測(cè)出具有耐藥性的腸球菌及其他一些革蘭氏陽(yáng)性菌等。我國(guó)的獸藥地方標(biāo)準(zhǔn) 廢止目錄中在禁用獸藥一項(xiàng)中規(guī)定抗生素類藥物萬古霉素及其鹽、醋及制劑不得檢出。
[0004] 農(nóng)業(yè)部1862號(hào)規(guī)定中利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的萬古霉素。其他檢 測(cè)方法還有固相萃取-高效液相色譜法（SPE-冊(cè)LC)與巧光偏振免疫法（FPIA)相結(jié)合的方 法；反相高效液相色譜（RP-冊(cè)LC)測(cè)定法；高效液相色譜法（HPLC)，但運(yùn)些方法由于前處理 過程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，要專口的儀器及耗材，費(fèi)用較貴，并不適合臨床應(yīng)用。微生物分析方法 測(cè)定抗生素含量是一種經(jīng)典的方法，樣品無需作繁瑣處理，且對(duì)儀器設(shè)備要求不高。但微生 物法測(cè)定易受合并應(yīng)用其他抗生素的影響。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、 對(duì)技術(shù)人員相對(duì)要求低等特點(diǎn)，因此適用于大量樣品的快速篩查。本發(fā)明在于提供一種能 產(chǎn)生對(duì)萬古霉素具有較高親和力和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA試劑盒W及膠體金試紙條的研發(fā)推廣奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抗萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備 的抗體對(duì)萬古霉素和去甲萬古霉素具有較好的親和力和檢測(cè)靈敏度，可W用來建立萬古霉 素和去甲萬古霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，或建立膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一株抗萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為2A1，已 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10869。
[0007] 抗萬古霉素單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10869的雜交瘤細(xì)胞株 2A1所分泌產(chǎn)生。所述的抗萬古霉素單克隆抗體的應(yīng)用，其在食品中萬古霉素和去甲萬古霉 素殘留量的分析檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株2A1細(xì)胞株的制備基本步驟為： (1) 免疫原的制備與鑒定：利用活潑醋法，使萬古霉素鹽酸鹽的簇基與載體蛋白BSA的 氨基相連制備免疫原；利用高艦酸鋼法，使萬古霉素的葡萄糖基的鄰二醇結(jié)構(gòu)在高艦酸鋼 的作用下氧化生成醒基，再與載體蛋白OVA的氨基反應(yīng)生成Schiff氏堿W制備包被原，反 應(yīng)結(jié)束后，通過透析分離完全抗原與未偶聯(lián)的小分子半抗原，完全抗原通過紫外吸收掃描 方法鑒定； (2) 小鼠的免疫：將抗原與福氏佐劑乳化完全后，通過皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠。 首次免疫采用福氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用福氏不完全佐劑，沖刺免疫時(shí)免疫劑量為前一 次免疫劑量的一半，與生理鹽水混合均勻后直接進(jìn)行腹腔注射；各次免疫間隔為=周。第= 次免疫后，間隔一周采血檢測(cè)血清效價(jià)和抑制，根據(jù)小鼠血清的檢測(cè)結(jié)果，確定加強(qiáng)免疫的 次數(shù)； (3) 細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000)法，使小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤 細(xì)胞融合，融合后細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，第S天進(jìn)行HAT半換液，第五天HAT全換液，第屯 天取出細(xì)胞上清液利用間接化ISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA法測(cè)定 陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行=次亞克隆，最 終篩選獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株2A1; (4) 雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗套裝測(cè)定； ICs。值、交叉反應(yīng)率及親和力的測(cè)定通過化ISA法。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：（1)本發(fā)明獲得的抗萬古霉素單克隆抗體細(xì)胞株，可W 達(dá)到同時(shí)檢測(cè)萬古霉素和去甲萬古霉素的目的。（2)選擇兩種偶聯(lián)方法合成了免疫原和包 被原，利用了萬古霉素不同的連接位點(diǎn)，W達(dá)到更高的檢測(cè)靈敏度。
[0010] 生物材料樣品保藏：一株抗萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2A1，分類命名為 單克隆細(xì)胞株，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，簡(jiǎn)稱CGMCC，地 址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 10869,保藏日期2015年05月19日。
【附圖說明】
[0011] 圖1免疫原的紫外吸收光譜表征。
[0012] 圖2包被原的紫外吸收光譜表征。
[0013] 圖3雜交瘤細(xì)胞株2A1單克隆抗體對(duì)萬古霉素和去甲萬古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明，不作為本發(fā)明的限定內(nèi)容 或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0015] 本發(fā)明通過將制備的萬古霉素免疫原免疫小鼠，選擇效價(jià)和抑制效果最好的小鼠 進(jìn)行細(xì)胞融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，通過間接化ISA和間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA 篩選細(xì)胞上清，得到對(duì)萬古霉素抑制效果最好的雜交瘤細(xì)胞孔，通過對(duì)該孔的細(xì)胞=次亞 克隆，最終得到了能分泌對(duì)萬古霉素有較好親和力和靈敏度的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株。
[0016] 實(shí)施例1 :雜交瘤細(xì)胞株2A1的制備 1、完全抗原的合成 取7.Omg萬古霉素鹽酸鹽，再加入2.OmgEDC和1.OmgN服，使用400yLDMF，200yL MES緩沖液溶解，室溫?cái)埌?，活?h;另取5mgBSA溶解于2血、0.05M、pH9.6的CB溶 液中，將上述活化后的萬古霉素溶液慢速逐滴加入BSA溶液中，室溫?cái)埌璺磻?yīng)過夜后，4°C 透析S天，-20°C分裝保存得到免疫原。取5mg萬古霉素鹽酸鹽溶于水中，加入新鮮配置的 2. 5mg化1〇4水溶液，冰浴活化30min，將上述活化后的萬古霉素溶液慢速逐滴加入溶解于 2mL、0. 05M、pH9. 6 的CB溶液中的 5mgOVA溶液中，4°C